DNA-repair. Cell and Molecular Biology. Program. Mutationer. Felaktiv duplikering av ärftlig information. 1x10 9 fel/nukleotider polymeriserade

Transkript

1 KAROLINSKA INSTITUTET Department of Cell and Molecular Biology Medical Nobel Institute Cell and Molecular Biology Piergiorgio Percipalle, PhD Program Föreläsning 1 DNA Repair Föreläsning 2 - Transkription Föreläsning 3 Genreglering Föreläsning 4 Genreglering och signaltransduktion Föreläsning 5 RNA-processning Föreläsning 6 - Translation Duplikering av den genetiska informationen är en mycket säker process med få fel DNA-polymeras: 1x10 5 fel/polymeriserade nukleotider DNA-repair En individs överlevnad kräver genetisk stabilitet 1x10 9 fel/nukleotider polymeriserade Fenotyp Felaktiv duplikering av ärftlig information Enzym eller process Mutationer Vad är genetisk variation? Möjliggör långsiktig genetisk utveckling av en art i en föränderlig miljö Coloncancer Hudcancer Cellulär UV-känslighet Bröst-och äggstockscancer Förtid åldrande Medfödda abnormaliteter Mismatch repair Nucleotide excision-repair Mutationer i DNA-polymeras Repair med homolog rekombination DNA-helikas DNA inter-strand crosslink repair Vad är en mutation? Ärftliga förändringar i nukleotidföljden hos en kromosom Vilka typer av mutationer blir ärftliga? Endast sådana som påverkar könsceller är ärftliga 1

2 Ärftliga sjukdomar med fel i DNAreparation Varifrån kommer mutationer? Inducerade mutationer - Ioniserade strålning (Röntgenstrålning och γ-strålning) - Kemiska mutagener Spontanmutationer - När orsaken är till mutation är okänd Inducerade mutationer Basmodifierande agenter - mispairing Basanaloger Interkalerande agenter påverkar DNA-replikering, transkription och translation Interkalerande agenter Insertion eller deletion av ett helt baspar ger frameshift-fel 2

3 Spontan DNA-skada Kemiska modifikationer av DNA - Deaminering av cytosin - Depurinering 10,000 purines are lost per 20 hour cell cycle - Tymidindimerer (Oxydatively damaged bases) Deaminering av cytosin Depurination Tyminedimer Pyrimidinbaser är mycket känsliga för UVstrålning Tymindimerer hindrar korrekt replikation Antingen dör cellen eller börjar dela sjukligt, kan ge malignanta förändringar (tumörer) (t ex Xeroderma pigmentosum) DNA-reparation Det uppstår olika typer av förändringar hos DNAmolekyler kontinuerligt T ex strängar som går av, felaktivt inkorporerade nukleotider, nukleotider som skadas Det är viktigt med genetisk stabilibetet för att en organism och en art kan överleva Därmed har organismer utvecklat många olika mekanismer för reparering av skador hos DNA 3

4 Korrekturläsning av DNA-polymeras DNA-polymeras har 3-5 korrekturläsning DNA-skador kan repareras av flera olika mekanismer Singelsträngade brott i DNA Dubbelsträngade brott i DNA Polymerisering Editering Base Excision Repair Singelsträngade brott i DNA Apurinic sites on the DNA Base Excision Repair Nucleotide Excision repair Nucleotide Excision Repair Ataxia ATM-protein medierar cellulära reaktioner till DNA-skador (särskilt i cellcykeln) Flera enzymer kan känna av en förändrad form av DNA-strängen Tymindimerer repareras med hjälp av denna mekanism mutation Leukemi Lymphoma Genomisk instabilitet 4

5 Werners syndrom Tidig föråldrande Polymorfismer i genen WRN Missense-polymorphism ger funktionella varianter Konservativa polymorphismer ger inte funktionella förändringar Missense-mutationer Vad betyder det? Cockayne syndrom DNA-repair-sjukdom UV-känslighet Single-stranded DNA endonuclease (XPF) 3 5 exo 3 5 helicase RESULTAT DNA-repair fungerar inte Replication Step 5 3 polymerization Tre steg som garanterar bra DNA-synthes 3 5 exonucleolytic proofreding Strand-directed mismatch repair Errors per nucleotide polymerized 1x10 5 1x10 2 1x10 2 Total 1x10 9 Dubbelsträngade brott i DNA Ionizing radiations, oxidizing reagents, replication errors, certain metabolic products in the cell Hela kromosomen kan gå av (båda strängar) Därmed har organismer utvecklat många olika mekanismer för reparering av skador hos DNA 5

6 Williams syndrom Non-homologous end-joining Deletion av kromosom 7 (elastin, LIM kinase) Homologous end-joining Breast cancer susceptibility gene 2 (BRCA2) BRC2_Human Storlek: 3418 aminosyror; Da Funktion: deltar i en pathway associerad med aktivering av double-strand break repair och/eller homolog rekombinering Subenhet: Interagerar med RAD51. Vävnadsspecificitet: högsta nivåer av uttryck hos bröst och tymus, något lägre nivåer i lungan, ovarier och mjälte Likheter: innehåller 8 BRCA2 repeats 6

7 7

8 Program Föreläsning 1 DNA-repair Föreläsning 2 Transkription Föreläsning 3 Genreglering Transkription Föreläsning 4 Genreglering och signaltransduktion Föreläsning 5 RNA-processning Föreläsning 6 - Translation Hur använder nder cellerna informationen i kromosomernas DNA? Hur ser det ut påp kromosomen? Molekylärbiologins centrala dogma RNA-syntes 1

9 DNA-sekvenser transkriberas till RNA Transkription Ribonucleic acid (RNA) Likheter med DNA Olikheter med DNA Nukleotiderna hos RNA är ribonukleotider RNA innehåller basen uracil i stället för f thymin. Thymin kan också basbara med adenine Den kemiska strukturen hos RNA Uracil basparar med adenine A B DNA och RNA har olika strukturer Det finns olika typer av RNA Typ av RNA Funktion mrnas rrnas trnas snrnas snornas Andra icke-kodande RNAs Budbärar rar-rna, kodar för f r proteiner Ribosomala RNAs, ribosomstruktur RNA är r en lineär r polymer, precis som DNA, bestående ende av fyra olika nukleotider bundna med fosfodiester- bindningar Förflyttar-RNAs,, proteinsyntes Små nukleära RNAs,, RNA-processning Små nukleära RNAs, rrna-processning I olika cellulära processer DNA som dubbelhelix Lineär r RNA 2

10 Transkription utförs av enzymet RNA-polymeras Hur framställs RNA med DNA som mall? Transkription är r en stegvis process Transkriptionscykeln Igenkänning nning av specifika DNA-sequenser sequenser: RNA-synthes börjar Promoter Termination Initiation RNA-syntes Igenkänning nning av specifika DNA-sequenser sequenser: RNA-änder Terminator RNA-polymeras Orientation av RNA-polymeras 3

11 Riktning av transkription längs en kromosom Typ av polymeras RNA-polymeras I RNA-polymeras II RNA-polymeras III Gener som transkriberas rrna-gener Alla proteinkodande gener trna-gener Strukturen av RNA-polymeras II är r mycket konserverad Signalsekvenser vid starten av transkription Eukaryot RNA-polymeras II kräver allmänna transkriptionsfaktorer.. Eukaryoter har tre olika RNA-polymeraser. samt aktivator-, mediator- och kromatin-remodelling remodelling- proteiner för RNA-syntes Transkription Transkription börjarb 4

12 Skillnader mellan eukaryot och prokaryot transkription Prokaryoter Eukaryoter 5

13 Program Föreläsning 1 DNA-repair Föreläsning 2 - Transkription Föreläsning 3 Genreglering Genreglering Föreläsning 4 Genreglering och signaltransduktion Föreläsning 5 RNA-processning Föreläsning 6 - Translation Gener måste regleras för att de skall bli olika sorters celler! Är r det samma DNA i alla typer av celler? Olika celler - samma DNA? - samma proteiner? Olika proteiner i olika celler Olika vävnader v vnader har olika proteiner Många processer gemensamma till alla celler Vissa proteiner endast hos vissa celler T ex hemoglobin En typisk cell använder gener Det finns MÅNGA fler olika proteiner än så i en cell Alternativ splitsning, sekundära modifikationer 1

14 Kontrol av genuttryck Hur funkar genreglering på molekylär r nivå under transkription? Gene regulatory proteins Functional and structural properties How do they work? Transkriptional reglering viktigast - och mest ekonomiskt Typiska kontakter mellan DNA och reglerande protein Helix-turn turn-helix (HTH) motif major groove minor groove Bindning av ett reglerande protein schematiskt t ex HTH Zinc-finger (ZF) motif Cluster of 4 amino acids co-ordinate ordinate a Zn atom Palyndromic symmetry 2

15 DNA-bindning av Zinc- fingrar på p protein Leucine zippers Mer variation genom heterodimerisering Kombinatorisk kontroll Specific protein modules regulate DNA-binding activity Helix-loop- -loop-helix-motivet Reglering av tryptofanoperonet Genetic switches Ingen tryptofan i cellen - operonet aktiveras! Hur gener slås på och av hos prokaryoter (och mitt i mellan) 3

16 Genreglering hos eukaryoter Mera komplexa switchar Reglerande proteiner kan binda tusentals baspar från själva promotern; på det sättet kan en enda promoter regleras av väldigt många olika reglerproteiner Eukaryota RNA-polymeraser kräver assemblering av transkriptionsfaktorer Eukaryot-DNA packas i kromatin; detta kan utnyttjas för genreglering Genkontrollområde av en typisk eukaryotgen Transcription factors not assembled on linear DNA Transcription factors display concerted actions on polymerase Genaktivatorproteiner är modulära Aktivering kan vara synergisk Aktivatorproteiner kan ändra kromatinstrukturer och därmed d aktivera gener Chromatin remodeling complex 4

17 En sammanfattning om en transkriptions-initationsprocess initationsprocess hos en eukaryot (Saccharomyces) Repressorer hos eukaryoter Men hur regleras aktivitet av genreglerande proteiner hos eukaryoter? 5

18 Locus control region reglerar kromatinets kondensation hos globin- gencluster Insulatorelement hindrar spridning av enhancereffekten Ett enda reglerprotein kan reglera många m olika gener 6

19 Program Föreläsning 1 DNA-repair Föreläsning 2 - Transkription Föreläsning 3 Genreglering Föreläsning 4 Genreglering och signaltransduktion Genreglering och signaltransduktion Föreläsning 5 RNA-processning Föreläsning 6 - Translation Cellkommunikation Intracellulär signalväg Biokemisk kommunikation från en del av cellen till en annan Viktiga steg i cellkommunikation: Mottagning av signal (med receptormolekyl) Biokemisk processning av signalen (amplifiering, integrering) Reaktion (t ex ändring i cellens aktivitet eller genuttryck) Det finns många olika signalvägar Varför finns cellkommunikation? Celler i flercelliga organismer måste kunna kommunicera med varandra Cellerna måste kunna integrera komplex information som kommer från olika källor Cellkommunikation Signalmolekyler binder till specifika receptorer Signalmolekyler: Ligander som utsöndras av den signalerande cellen -För att känna av sin position och funktion -Koordinera rörelse -Utföra specifika uppgifter, t.ex celldelning, metabolism eller producera en specifik molekyl Receptorer: Binder signalmolekyler och initierar ett svar i målcellen 1

20 Signalmolekyler signalmolekyler utsöndras från den signalerande cellen Receptorer Proteiner Små peptider Amino syror Nukleotider Steroider (små lipofila molekyler) Retinoider Fettsyror Gaser: ex. NO, CO och O 2 Sitter på målcellen -låg ligand koncentration - hög receptor affinitet -hög ligand koncentration - låg receptor affinitet Binder specifika signalmolekyler och initierar ett svar i målcellen Olika typer av receptorer Cross-talk, Amplifiering och Integrering -Membranbundna receptorer Binder hydrofila signalmolekyler -Intracellulära receptorer Binder hydrofoba signalmolekyler Olika signalvägar interagerar ( Cross-talk ) Kan vara samverkan eller motverkan Amplifiering Integrering Signalering Avståndet mellan signalcellen och målcellen avgör typen av signalering Signalering -lokal -snabb kontakt beroende signalering parakrin signalering synaptisk signalering endokrin signalering 2

21 Signalering -långa avsånd (blodomloppet) -långsam Långsamt och snabbverkande signaler Snabba signaler Effekt på några sekunder, t ex på metabolismen T ex aktivering av ett inaktivt enzym Signalen bryts snabbt ner - det är viktigt att kunna stänga av signalen Långsamma signaler Hormoner som verkar över timmar och dagar Ändrar t ex i nivån i genutrycket Multipla extracellulära signaler Multipla extracellulära signaler Varje cell är programmerad för att tolka olika kombinationer av signalmolekyler. detta kan ge upphov till olika svar i målcellen -ett hundratal signalmolekyler kan ge upphov till tusental cellulära svar! Intracellulära receptorer Kärnreceptorer Signalmolekyler - hydrofoba och/eller små Ligand-aktiverade transkriptionsfaktorer Exempel: NO CO O 2 steroidhormoner tyroidhormoner (sköldkörtelhormon) retinoider vitamin D3 orphan receptorer = receptorer utan identifierad ligand 3

22 Glukokortikoid- Receptorn (GR) Receptorn är inaktiv och befinner sig i cytoplasman. Glukokortikoider binder till receptorn - complexet transporteras in i kärnan. Binder DNAt och reglerar transkription. Tyroidhormon-receptorn Receptorn binder till DNAt men kan inte stimulera transkription om inte tyroidhormonet binder till receptorn Cooper 13.3 Cooper 13.4 Primärt svar. Sekundärt svar. Struktur av ligand-bindande domänen Membranbundna Receptorer 4

23 Network of intracellular signaling molecules Signal Transducers Molecular Switches Fem parallella intracellulära signalvägar Gene transcription activated by a G-protein linked receptor Increased level of camp produces increased gene activity -Adrenalin -Glucagon 5

24 Jak-STAT signalering Jak-STAT signalering Anti-viral response Ras signalering TGF-β signaling pathway Embryonic development Immune System Aktivering av NF-κB -Cell proliferation -Differentiation Anti Inflammatory Response Cancer och signalvägar Mutationer hos ras-proteiner är vanliga hos cancerceller Muterade onkogena Ras-proteiner förblir låsta i den aktiva formen, stimulerande MAP-signalvägen konstitutivt Därmed blir cancercellens tillväxt oberoende av mängden av tillväxtfaktor i omgivning Receptorstörningar Cellerna har möjlighet att reglera antalet receptorer på målcellens yta Desensitisering kan uppnås via förändrad receptor Fosforylering eller proteiner som binder Exempel är insulinresistens Hormonen finns men har inte någon verkan 6

25 Aktivering av NF-κB -Proteolys av det inhibitoriska proteinet IκB aktiverar NF-κB -NF-κB transporteras till kärnan och reglerar transkription av sina målgener -NF-κB aktiverar även IκB negative feedback 7

26 Program Skillnader mellan eukaryot och prokaryot transkription Föreläsning 2 - Transkription Föreläsning 3 Genreglering Föreläsning 4 Genreglering och signaltransduktion Procaryotes Föreläsning 5 RNA-processning Föreläsning 6 - Translation Eucaryotes Föreläsning 1 DNA-repair RNA- processing Elongering av transkription hos eukaryoter sker samtidigt med RNA-processing RNA-splitsning RNA-polyadenylering (3 end) RNA-capping (5 end) RNA-capping 5 -fosfat avlägsnas GMP adderas (5 to 5 ) 5 Metylering av guanosin Splitsning av RNA Hos eukaryota celler, det primära ra RNA-transkriptet transkriptet, (pre-mrna),, innehåller både b kodande och Icke-kodande sekvenser Hos pre-mrna mrna, kodande sekvenser kallas Exoner medan icke-kodande sekvenser kallas Introner 1

27 Strukturen hos två gener Under splitsningen klyvs Intronsekvenserna bort A RNA-splitsning görs i spliceosomen Alternativ splitsning av α-tropomyosingenen hos råtta B E C F D RNA-polyadenylering Termineringssekvens på RNA som syntetiseras Klyvning av RNA RNA-editering RNA-editing är r en process som förändrarf nucleotidsekvenser hos mrna-molekyler efter själva transkriptionen PAP tillsätter tter 200 nukleotider (3 ) 2

28 Mekanismen för RNA-editering Plants, Trypanosoma (mitochondria) Mekanismen för A I mrna-editering Adenosine deaminases (ADAR) act directly on mrna by deaminating adenines Example: Transmitted-gated ion channel in brain (Glu Arg editing alters Ca permeability of the channel)) The Cell Nucleus by Ramon y Cajal (Nobel Prize, Medicine and Physiology) Cellkärnans struktur Nukleolen och ribosomala gener Nukleolära avdelningar 3

29 Mekanismen för rrna-processning Cajal Bodies: visualisering Funktion av Cajal Bodies Humana celler Cajal Bodies/GEMS Assembly of of Transcription-Processing Machinery Xenopus Oocyter Speckles: visualisering Visualisering av kromatin och nukleär struktur Speckles Cajal Body Cajal Body Speckles Stockpiles of fully mature snrnps ready to be used in RNA-splicing 4

30 Cajal Bodies och Speckles är fysiskt sammanlänkade Cellkärnans struktur Cajal Body Speckles Nukleocytoplasmisk transport av RNA-molekyl Protein synthesis factors Protein- syntes 5

31 Program Föreläsning 1 DNA-repair Föreläsning 2 - Transkription Föreläsning 3 Genreglering Translation Föreläsning 4 Genreglering och signaltransduktion Föreläsning 5 RNA-processning Föreläsning 6 Translation Huvudpunkter mrna fungerar som en informationsbärare mellan DNA och protein Vad är translation? Mekanismerna Komponenterna Medicinsk relevans (antibiotika) Reglering Hur kan informationen i den lineära sekvensen av nukleotider i mrna översättas till en lineär sekvens av aminosyror för att skapa proteiner? Transkription Samma språk: 1 dntp 1 rntp Proteinsyntes Olika språk: 1 rntp 1 aa RNA-translation 1

32 Specifika problem Alla celler måste m kunna översätta nukleotidspråket ket till ett proteinspråk Denna översättning kan inte göras g bokstav förf bokstav eftersom det finns fyra olika baser hos DNA/RNA och 20 olika aminosyror Den genetiska koden mrna läses i kodoner (kodontripletter), t ex ATG Varje kodon specifierar en aminosyra eller STOP i translationssprocessen Den genetiska koden är r universal - den används nds av alla organismer. Den genetiska koden är reduntant - flera av aminosyror kan kodas på p flera olika sätt. s Den genetiska koden Hur görs kopplingen mellan nukleotider och aminosyror? Svarta bokstäver: kodontripletter Röda bokstäver: aminosyror Adaptormolekyler matchar aminosyror till kodoner i mrna Adaptormolekylerna kallas förflyttar-rna f (trna( trna) trna i form av en L med specifika bindningsställen 3 end Amino acid binding site Codon binding site Anticodon 2

33 Den genetiska koden Wobble i basparning mellan kodoner och antikodoner Svarta bokstäver: kodontripletter Röda bokstäver: aminosyror Ett specifikt enzyme laddar trna-molekylen med en aminosyra Den genetiska koden översätts med hjälp av två olika adaptorer Enzymet heter aminoasyl-trna syntetas 1 2 Amino acyl trna Nettoresultat: en aminosyra väljs v ut av en kodon Den nya aminosyran inkorporeras i den växande polypeptiden Men var sker denna process? 3

34 A B Ribosomer C Ribosomer Ribosomen är r en mycket komplex katalytisk maskin innehållande fler än n 50 olika proteiner och flera olika RNA-molekyler (rrna( rrna) Aktiva ribosomer består r av en stor och en liten enhet Ribosomer är r mycket konserverade hos prokaryoter och eukaryoter Eukaryotisk ribosom Prokaryotisk ribosom Hos eukaryoter, ribosomer finns i cytoplasman endast (och i mitokondrier) Antibiotika och translation Proteinsyntes är en dynamisk process Antibiotika är r riktade mot processer och strukturer som är r unika för f r mikrober och inte finns hos eukaryota celler (alltså människan) Den eukaryota ribosomen skiljer sig något n från n den prokaryota ribosomen Det finns antibiotika (t ex kanamycin) ) som specifikt hindrar translation hos prokaryota ribosomer Därmed påverkar p dessa antibiotika endast kroppens prokaryota beståndsdelar Ribosomen innehåller fyra bindnindssäten Hur kan ribosomen facilitera de många samordnade molekylära förflyttningarna som krävs för effektiv translation? trna-bindningss -bindningssäten mrna-bindningss -bindningssätet 4

35 Det finns tre huvudsteg i translationen Translation av en mrna-molekyl.. Bindning av aminoasyl-trna till A-sätet Den C-terminala ändan av peptiden i P- sätet kopplas till N-terminus av aminosyran i A-sätet Peptidyltransferas Konformationella förändringar flyttar mrna exakt 3 nukleotider så att A-sätet blir åter tillgängligt Konformationella förändringar hos mrna.kräver hjälp av elongeringsfaktorer A D Initiering och terminering av translation kräver specifika signaler B C E F Initiering kräver ett specifikt AUG-kodon kodon,, som binder nästan alltid en trna som bär b r på p en metionin Translationen termineras när stopkodoner (UAA, UAG, UGA) ) kommer fram till ribosomen Inga vanliga trna-molekyler binder till stopkodoner Initiering kräver initieringsfaktorer Initierande trna laddas på p den lilla ribosomala enheten Den lilla enheten känner k igen 5-5 capstrukturen hos mrna (behövs även initieringsfaktorer, eif4e och eif4g) Den lilla enheten flyttar sig framåt t påp mrna tills den kommer till en AUG Den stora enheten binder till den lilla och initiationsfaktorerna dissocieras A B C Initiation av translation D E F 5

36 Termination av translation Proteiner skapas på polyribosomer De flesta proteiner syntetiseras klart mellan 20 s och några minuter A B Det färdiga f proteinet lämnar ribosomen Ribosomen disassocierar Hur kontrolleras kvaliteten hos nysyntetiserade proteiner? Proteiner veckas co-translationellt Proteiner får f r sitt sekundära struktur under translationsprocessen Flera mekanismer garanterar den korrekta veckningen Abnormalt veckade proteiner kan aggregera och ge upphov till sjukdomar Prionsjukdomar, Huntington och Alzheimers är r alla resultat av ackumulering av felaktigt veckade proteiner som bildar filament som kroppen inte klarar av att hydrolysera 6

37 En lång väg från DNA till protein 7