Me too-läkemedel, Indinavir

Transkript

1 TVE Examensarbete 15 hp Juni 2011 Me too-läkemedel, Indinavir Sam Ardavan, Hanna Eriksson Röhnisch, Jenny Gustafsson, Carl Hemmingsson, Anna Maria Pettersson, Jens Westerinen

2 Abstract Me too-läkemedel, Indinavir Me too-drugs, Indinavir Teknisk- naturvetenskaplig fakultet UTH-enheten Besöksadress: Ångströmlaboratoriet Lägerhyddsvägen 1 Hus 4, Plan 0 Postadress: Box Uppsala Telefon: Sam Ardavan, Hanna Eriksson Röhnisch, Jenny Gustafsson, Carl Hemmingsson, Anna Maria Petterson, Jens Westerinen Syntesdesign AB is an academic company that is supposed to enter the HIV drug market by manufacturing a "me-too"-drug with indinavir as the starting substance. ur task is to find 100 potential indinaviranalogues. ur further task is to suggest how to perform a bondingassay to test the affinity for all these analogues. We will present a method, required equipment and calculated costs for the assay. Telefax: Hemsida: Handledare: Lena Bergström Ämnesgranskare: Christian Sköld Examinator: Enrico Baraldi ISS: , TVE

3 Sammanfattning Målet med detta projekt var att ta fram 100 analoger till indinavir samt att ta fram en bindningsassay för att testa deras affinitet till HIV-proteas och beräkna kostnaderna för detta. Med hjälp av litteraturstudier och datasimuleringar har indinavir undersökts med avseende på de delar som interagerar med HIV-proteaset. Syftet med detta var att definiera farmakoforen för substansen. Utifrån farmakoforen kan man göra en prediktion av vad som kan tänkas bytas ut mot bioisostera substituenter. Vi har även undersökt syntesen för indinavir för att kunna se i vilket steg förändringarna rimligen kan ske som ger den önskade analogen. Arbetet har resulterat i att vi kan redovisa förslag för strukturformler till 100 analoger. Utifrån litteratur och studiebesök valdes en kompetitionsstudie med radioligand som metod för bindningsassayen. Kostnaden för att utföra bindningsassayen beräknades till SEK. Men för att kunna genomföra projektet, med investeringar och optimeringar, krävs SEK.

4 Innehåll 1. Analoger Inledning Bakgrund HIV HIV-proteashämmare Indinavir Metaboliter Interaktioner mellan HIV-proteas och indinavir Viktiga strukturelement i HIV-proteashämmare Mjukvarubaserad interaktionsanalys Syntes av indinavir Syntes av molekyl A Syntes av molekyl B Slutsyntes Metod för att skapa analoger Grundanaloger kombinationer Datasimulering av ligand-protein-interaktioner Konsult Utbildning Bindningsassay Inledning Bakgrund Arbetssätt Kompetitionsstudie Teori Kort om utförandet av kompetitionsstudien Kommentarer till kompetitionsstudien Radiomärkt ligand HIV-proteas Buffert

5 2.5.3 Kravet på koncentrationsintervallet för analogerna i provserien Tidsplan Kapacitet Kostnader Inredningskostnader Instrumentkostnader Materialkostnader Kemikaliekostnader Personalkostnader Avfallskostnader Slutsats Slutsatser av bindningsassayen Kostnad för bindningsassay Totalkostnad för hela projektet Referenser Analoger Bindningsassay Bilagor Bilaga 1: Analoger Bilaga 2: Förberedelser inför samt instruktioner för bindningsassay 3

6 1. Analoger 1.1 Inledning Idag, drygt trettio år efter att HIV-viruset identifierades, så finns det fortfarande inget vaccin eller botemedel mot sjukdomen. Det finns dock flera olika typer av bromsmediciner som gör att människor som bär på viruset kan leva ett relativt normalt liv. Men dessa bromsmediciner har ganska många biverkningar samt att viruset kan utveckla resistens mot läkemedlen. Detta gör att utveckling av nya bromsmediciner ständigt behövs. 1.2 Bakgrund HIV Humant immunbristvirus, HIV, är ett retrovirus som bryter ned immunsystemet genom att angripa t-hjälparceller, CD4+-celler, som är en typ av vita blodkroppar. Viruset tar sig in i CD4+-cellerna och förökar sig. är kroppen har för få t-hjälparceller klarar inte immunförsvaret av att bekämpa vanliga infektioner längre. är man hamnat i detta stadium, när immunförsvaret inte fungerar effektivt, så kallas tillståndet AIDS. HIV-viruset innehåller RA som med hjälp av enzymet omvänt transkriptas skrivs om till DA. Från detta DA kan mra produceras som kodar för ett protein. är detta protein har skapats behöver det klyvas till mindre peptider för att anta dess aktiva form. Denna klyvning sker med hjälp av enzymet HIV-proteas. Detta enzym är alltså en viktig del i HIV-virusets livscykel. Det finns läkemedel som blockerar HIV-proteas för att stoppa spridningen av viruset. Dessa kallas HIV-proteashämmare HIV-proteashämmare HIV-proteaset består av två stycken identiska subenheter som är uppbyggda av 99 aminosyror vardera. En HIV-proteashämmare binder in till HIV-proteas och blockerar bindningssitet där det verkliga substratet binder in. De verkliga substraten är polypeptider som ska klyvas i proteaset för att anta dess aktiva form. Proteashämmaren gör då att polypeptiden inte kan binda in och klyvas och viruset förblir inaktivt. Alla läkemedel som tillhör gruppen HIV-proteashämmare påminner om det verkliga substratet till HIV-proteas och efterliknar dess transition state för att passa in i enzymet. HIV-proteashämmare bromsar alltså virusets spridning i kroppen vilket gör att immunförsvaret kan återhämta sig och hejdar därmed sjukdomsförloppet Indinavir Merck & Co är ett världsledande läkemedelsföretag som bland annat tillverkar HIVläkemedlet Crixivan. Crixivan innehåller den aktiva substansen indinavirsulfat som hindrar tillväxten av HIV-virus genom att hämma enzymet HIV-proteas. Indinavir hör till gruppen HIV-proteashämmare och tas oftast i kombination med andra HIVläkemedel. HIV-viruset kan utveckla resistens mot läkemedlen, vilket gör att man oftast 4

7 kombinerar flera olika typer av dessa läkemedel för att få en stark effekt som gör att viruset inte hinner mutera. Kombination av olika HIV-läkemedel görs inte enbart för risken att utveckla resistans utan även för att minska biverkningar, då läkemedlen tas i lägre doser då de kombineras. Merck & Co tog flera patent på Crixivan. Det första patentet går ut 2012 medan vissa är giltiga till år Enligt Patentlagen (1967:837), 3, har patentinnehavaren ensamrätt till sin uppfinning. Dock finns det vissa undantag. Ett av dessa undantag innebär att studier, prövningar och undersökningar får göras på den patentskyddade uppfinningen, bara det inte tas ut på marknaden för försäljning. Detta innebär att utvecklingen av ett generika kan påbörjas innan patentet gått ut så att det är klart att släppas på marknaden då patentet blivit ogiltigt. 1.3 Metaboliter Sju stycken huvudmetaboliter har identifierats från kliniska studier av indinavir. Dessa presenteras i figur 1. Huvudmetaboliterna är glukurordinering vid pyridinkvävet (M1), pyridin--oxidering (M2, M4), para-hydroxylering av fenylmetyldelen (M5), 3 -hydroxylering av indanringen (M2, M3, M7), samt -depyridometylering (M6, M7). Metaboliterna har en liten proteashämmande effekt eftersom de inte binder in till HIV-proteaset lika effektivt som indinavir. M4 M6 - M5 Indinavir M1 M3 M2 M7 Figur 1. Indinavir och dess sju huvudmetaboliter 5

8 1.4 Interaktioner mellan HIV-proteas och indinavir Som nämnts tidigare i efterliknar HIV-proteashämmare och till lika så även indinavir trasition state hos det verkliga substratet i den katalytiska reaktionen med enzymet. Då det ursprungliga substratet är en peptid måste så även den syntetiska substansen ha en generell struktur lik en peptidkedjas, se figur 2, för att passa in i enzymet. R1 R2 Figur 2. Generell struktur hos en peptidkedja Efter att substratet bundit in till enzymet initieras klyvningen av peptiden med att en vattenmolekyl, genom en nukleofil attack, adderar till kolet i en karbonylgrupp i kedjan. HIVproteas tillhör gruppen aspartylproteaser och namnet på gruppen syftar till att aminosyran asparaginsyra katalyserar denna reaktion. Ketonen i fråga är i indinavir utbytt mot en hydroxidgrupp vilken medför att en nukleofil attack på kolet blir mindre gynnad och klyvningen av molekylen inleds således inte. Den hämmande substansen binder in till enzymet och hindrar det från att reagera vidare. Det är dock en fråga om en kompetativ reversibel hämning och enzymet blir inte permanent inaktiverat. Denna hydroxidgrupp har en avgörande roll för att ge substansen dess hämmande effekt. Det som gör indinavir HIV-proteasspecifikt är att de båda ketonerna i molekylen agerar som vätebindningsacceptorer till en och samma vattenmolekyl, vilket låser grundstrukturen i molekylen till en viss konfiguration. Denna vattenmolekyl binder i sin tur till en amingrupp i enzymet i egenskap av vätebindningsacceptor. Detta ger molekylen egenskaper som gör att den enbart passar i HIV-proteaset och inte hämmar andra cellulära aspartylproteaser. Således utgör dessa karbonylgrupper fundamentala delar i molekylen för att den skall erhålla sin specificitet Viktiga strukturelement i HIV-proteashämmare Jämför man med andra liknande preparat finner man återkommande strukturelement som är karaktäriserande för gruppen HIV-proteashämmare, se figur 3 nedan. Utöver de tidigare nämnda så finns en fenylgrupp som substituent i den centrala delen av grundkolkedjan. Dessutom finns även en heterocykel i ena ändan vilken har en bekräftad positiv effekt på affiniteten till målproteinet. 6

9 Figur 3. Strukturformler för respektive HIV-proteashämmare Mjukvarubaserad interaktionsanalys För att kunna utröna fler interaktioner mellan indinavir och HIV-proteas simulerades en protein-ligand-interaktion med hjälp av programmet Maestro från Schrödinger. En fil (PDB ID: 2R5P) med hämmaren inbunden till målproteinet i kristalliserad form, illustrerat i 3D, laddades ned från RCSB PDB (Protein Data Base). Utifrån denna kunde en tvådimensionell bild tas fram, se figur 4, där interaktionerna molekylerna emellan, inom en radie av fyra ångström, åskådliggjorts. HIV-proteaset som användes vid kristallografianalysen var en muterad form (mutationer: Q7K, L33I, L63I) av wild type -proteaset, kallad Subtyp C. Mutationerna leder dock inte till en förändring vid bindningssiten eller påverkar affiniteten hos indinavir, utom minskar endast enzymets autoprotolysering. Fördelen med att göra analysen på denna mutant är att den är väldigt lik och har samma direkt avgörande egenskaper som det HIV-proteas som används i bindningsassayen, vilken beskrivs senare i avsnitt 2. Har indinavir påvisad god affinitet till detta enzym kommer förutsättningsvis även analogerna att ha det och således till det enzym som används i bindningsassayen, vilket är en förutsättning för en lyckad screening. 7

10 Figur 4. Illustrering över indinavir inbundet till HIV-proteaset i sin absolutkonfiguration och intilliggande aminosyror från respektive subenhet (A/B) i enzymet. Asp, asparaginsyra, är deprotolyserad och föreligger som negativt laddad vid fysiologiskt ph ( 7). Arg, arginin, är protolyserad och föreligger således som positivt laddad. Thr, treonin, är neutral, men polär. Resterande på bilden är opolära oladdade aminosyror. Det heldragna strecket från aminen, som bryggar över till indanolgruppen, påvisar en vätebindning till Gly B:27. Även hydroxidgruppen på indanolen vätebinder med syret som vätebindingsacceptor, då till aminen i Asp B:29. Detta visas dock inte på denna bild. Det kan även nämnas att Asp A:25 och B:25 är de två asparaginsyrorna som omtalats i 1.4 och katalyserar brytningen av peptidbindningen, men som då inte kan initieras då det sitter en hydroxidgrupp där på indinavir istället för en keton som på ursprungssubstratet. Fortsättningsvis är det till synes mestadels opolära aminosyror som vetter inåt mot bindningssiten och ger således miljön där en övervägande hydrofob karaktär. Därutav de stora opolära substituenterna på den aktiva substansen, så som fenylen och den tertiära butylen. Även indanolen har en aromatisk del vänd mot en yta som till större delen utgörs av opolära aminosyror. Som nämnts i ger en heterocykel i ena änden av molekylen en påvisad positiv effekt på affiniteten till enzymet. I indinavir utgörs den utav pyridinen. Det 8

11 kan tänkas vara kvävets fria elektronpar som interagerar med den positivt laddade argininen på plats B:8 som ger upphov till denna effekt. En likadan analys som utfördes på indinavir gjordes på nelfinavir inbundet till samma mutant, Subtyp C och gav resultatet som visas i figur 5. Figur 5. Illustrering över nelfinavir inbundet till HIV-proteaset i sin absolutkonfiguration och intilliggande aminosyror från respektive subenhet (A/B) i enzymet. Detta bekräftar viktiga delar för interaktionerna mellan den aktiva substansen och målproteinet utöver de tidigare påvisade likheterna preparaten emellan. Till exempel vätebindningen mellan en amin och glycin på plats B:27, till större delen opolära inslag i molekylen och närheten av en hydroxidgrupp till asparaginsyra i B-kedjan. 1.5 Syntes av indinavir Indinavir har visat sig vara kanske den mest komplexa molekylen som någonsin gjorts i förhållande till dess kvantitet. Detta eftersom det behövs ca ett kilo av läkemedlet per år för varje patient som är under behandling. Komplexiteten kommer dels från de fem stereogena centra, som ses i figur 6, och dels från de många funktionella grupperna som är utplacerade i molekylen. 9

12 Det finns flera olika sätt att syntetisera indinavir. Vi har valt att dela upp molekylen i två delar som sedan kopplas samman till den slutliga molekylen. B A Figur 6. Indinavir med dess stereogena centra ringmarkerade. Den streckade linjen delar upp molekylen i de två delar som sedan sammankopplas till indinavir Syntes av molekyl A Syntesen utgår från inden och innefattar fyra stycken stereogena centra, påkoppling av en fenylring och bildning av en epoxid. Detta kommer nu att gås igenom grundligt. I figur 7 ses molekyl A. A Figur 7. van ses den högra delen innan sammankoppling. De fyra stereogena centra är utmarkerade. Vidare ses bland annat en fenylring och en epoxid. Steg 1. Katalys av inden samt oxidation. H H t -Bu Mn Cl t -Bu t -Bu t-bu Ph + acl Utgångsmatrialet är inden som går igenom en katalys för att sänka aktiveringsenergin av dubbelbindningen i pentenringen. Dubbelbindningen är annars är för stabil då den befinner 10

13 sig i ett konjugerat system. Efter katalysen genomförts kan sedan pentenringen oxideras. Produkten blir då racematisk. Men kristallisering med vinsyrasalt och därefter utfällning leder till att man kan få ut rätt enantiomer. Steg 2. Ritter reaktion. H 2 S 4 CH 3 C Denna reaktion kommer beskrivas nedanför med hjälp av en mekanism. Väte protonerar syret och bindningen kommer då att slå upp på det laddade syret. Då bildas den stabilaste karbokatjonen, vilket är den som sitter närmast aromaten. CCH3 Katjonen blir nu snabbt attackerad av kvävets odelade elektronpar. Varför nitrilen attackerar underifrån (dvs. cis-konfiguration) kan verka underligt. Det förväntade är att den attackerar ovanifrån eftersom H-gruppen redan blockerar i viss mån under. Detta har dock sin förklaring i att syrets odelade elektronpar inte når till nitrilen om den sitter i trans och då kommer den att lossna. m den däremot sätter sig i cis-position kommer syrets odelade elektronpar snabbt att fånga upp nitrilen. Då syrets elektronpar slår ner kommer kolet samtidigt slå vidare en av sina bindningar och på så vis bildas en heterocykel. 11

14 Steg 3. Bildning av cis-aminoindanol H 2 H 2 H + H cis-aminoindanol Kvävet samt syret är angripbart för protonering. Detta leder till att etylen försvinner och att vi får då en hydroxidjon samt en aminogrupp. Steg 4. Acylering med acylklorid och skydd av aminoalkoholen H 2 H 1. Cl cis-aminoindanol 2. CH 3 S 3 H, CH 3 I detta steg görs grunden till det som skall bli det tredje stereogena centrat. Genom att tillsätta acylklorid får vi början på den bit som skall efterlikna en peptidkedja. Aminoalkoholen skyddas därefter genom tillsatts av 2-metoxypropen samt en syrakatalysator. Detta görs enbart i syfte för att aminogruppen inte ska reagera med andra reagens. Steg 5. Bildning av stereogent center 1. Li[CH 3 ] 2 2. Br Eftersom aminoalkoholen steriskt hindrar undersidan av molekylen kommer den bulkiga kvävegruppen att attackera som en elektrofil från ovansidan. Då bildas ett cis-enolat, som i sin tur reagerar vidare med allylbromid. 12

15 Steg 6. Bildning a epoxid H -Jodoosuccinimid I ach 3 ahc 3 Genom att först tillsätta -jodosuccinimid (IS), en elektrofil som reagerar med alkenen och därefter få karbonylkolet attackerat av en hydroxidjon kommer det ske en ringslutning. Ringslutning kan bara ske på ett sätt då den andra diastereomeren är steriskt hindrad. är sedan ringen öppnas upp kommer bara en diastereomer att infinnas som sedan sluts till en epoxid med hjälp av en bas. Mekanismen följer: -Jodoosuccinimid - - H ahc3 Efter att jod har satt sig på alkenen kommer hydroxidjonen från natriumvätekarbonat att attackera karbonylkolet. Den negativt laddade syreatomen kommer då att skapa en femring. Steriskt hinder bidrar till enbart en diastereomer vars ring senare öppnas. H I ach 3 Genom tillsatts av bas, i detta fall ame, stängs sedan jodoalkoholen till en epoxid och därefter är molekyl A klar. 13

16 1.5.2 Syntes av molekyl B Syntesen utgår från ett piperazinfragment och innefattar bland annat ett stereogent center samt skydd av kväveatomerna. Detta ses i figur 8. [CH3]3C H [CH3]3C H Figur 8. Utgångsämnet är ett piperazinfragment som har ett stereogent center. De två kväveatomerna kräver separat skydd eftersom de ska reagera var för sig. Steg 7. Addition av 2-amino-2-metyl propan samt reduktion [CCl 2] 2 H 2 Pd/C H H CH [CH3]3CH2 Aminogruppen sätter sig på karbonylkolet. Därefter genomgår molekylen en reduktion, en så kallad katalytisk hydrering. Metallkatalysatorn är i det här fallet palladium och sänker energibarriären av reaktionen som annars hade varit enorm eftersom H-H bindningen är såpass stark. Genom att ha Pd/C som katalysator kan man få hydreringen stoppad och på så vis behålla en dubbelbindning som kommer vara av stor vikt för vidare syntes. Steg 8. Skydd av kvävegrupperna [CH3]3C H [CH3]3C H H 1. Cl t.bu H [CH3]3C H 2. t.bu DMAP t.bu [CH3]3C H De två kväveatomerna i ringen skiljer sig från varandra genom att det vänstra är konjugerad med amiden och är därför mer stabil. Detta gör det vänstra kvävet mindre reaktivt. Den högra kväveatomen kommer därför att skyddas först med benzylkloroformat. Därefter kan det mindre reaktiva kvävet skyddas genom att använda DMAP. 14

17 Steg 9. Assymetrisk hydreringen t.bu H 2 BIAP t.bu [CH3]3C H [CH3]3C H är de båda kvävegrupperna är skyddade är det dags att göra det stereogena centrat rätt. Detta görs genom att använda sig av en kiral ligand kallad BIAP. Hur mekanismen går till är ej helt klarlagt men liganden binder in väte till dubbelbindningen så att nästintill enbart den önskade enatiomeren bildas. Steg 10. Hydrering t.bu H 2 Pd [CH3]3C H [CH3]3C H [CH3]3C H Karbobenzyloxy(Cbz)-gruppen, det vill säga den grupp som skyddade kväveatomen med benzylkloroformat, lämnar då hydrering sker. Eftersom kvävet ska kunna slås samman med epoxiden från den högra syntesen används hydrering för att åter göra kvävet reaktivt Slutsyntes Sammanslagning Epoxider är mycket reaktiva. Allt som behövs är att tillsätta energi i form av värme för att reaktionen ska starta. [CH3]3C [CH3]3C H H HCl [CH3]3C H H H H H 15

18 Mekanismen följer: R1 R1 R3 H R2 R2 Kvävets fria elektronpar attackerar epoxiden som slår upp sin bindning. Ett H-shift kommer nu genomföras och produkten blir således: Reaktionen är dock inte klar än. Genom tillsats av koncentrerad syra, HCl, kommer den skyddande tert-butyloxykarbonyl(bc)-gruppen att lämna samt även se till att aminoalkoholens skyddande grupp lämnar. Slutprodukten blir då: Sista steget blir att koppla på ett pyredinfragment med hjälp av en reaktiv elektrofil som 3- klormetylpyridin. Detta presenteras i figur Cl [CH3]3C H H H H H 2. H 2S 4 [CH3]3C H H Indinavir H H + H2S4 Figur 9. Sista steget i syntesen av indinavir. 16

19 1.6 Metod för att skapa analoger Me-too -läkemedel är vanligt förekommande i läkemedelsindustrin för läkemedel där patentet har gått ut. Eftersom de utgår från ett läkemedel som redan finns på marknaden så behövs inte alls lika mycket pengar och tid för att ta fram något liknande. Ett me-too - läkemedel innebär att substansen har en mycket snarlik effekt och struktur som dess utgångsläkemedel har. För att skapa me-too preparat med indinavir som utgångssubstans studerades syntesen för indinavir samt dess interaktioner med HIV-proteas. Till en början studerades vad som måste behållas i grundstrukturen, vilket tas upp i avsnitt 1.4. Därefter granskades syntesen för att se i vilka steg det var möjligt att byta ut i reaktanterna. En analys över interaktionerna mellan HIV-proteaset och indinavir, se avsnitt , gjordes för att kunna veta vilka egenskaper de olika delarna behövde ha. Var och en av dessa grupper byttes ut i syntesen på några olika vis och gav 19 stycken grundanaloger, se Dessa 19 grundanaloger kombinerades så 81 nya analoger erhölls. Totalt ger detta 100 analoger. För de kombinerade analogerna se avsnitt och bilaga Grundanaloger Grundanalogerna har skapats med utgångspunkt från indinavirmolekylens olika delar. Indinavirs egenskaper har analyserats och bevarats för att den nya analogen ska kunna binda in till HIV-proteaset. I de analoger som presenteras i det här avsnittet har endast en del av molekylen bytts ut mot en bioisoster förändring jämfört med indinavir. Dessa olika förändringar av indinavir kombineras sedan för att göra 100 unika analoger som ska ligga till grund för att ta fram ett me too -läkemedel till indinavir. Syntes av indinavir utan förändring i steg 4 som presenteras i figur 10: CH3S3H, Figur 10. Inga förändringar har genomförts i syntesen och är alltså samma reaktion som finns beskrivet i

20 Förändring i steg 4, vilket leder till grundanalog A01-A07, presenteras i figur 11-17: CH3S3H, A01 Figur 11. Den förändring som leder till analog A01 är att vi tagit bort en kolatom från reaktanten för att på så vis behålla dess hydrofoba egenskaper, dock med viss förändring av storlek. Detta kan medföra större interaktioner med omkringliggande grupper CH3S3H, A02 Figur 12. Den förändring som leder till analog A02 är att vi bytt ut en kolatom i fenylringen mot ett kväve, vilket medför att man behåller ringens aromaticitet och får ingen större förändring av storleken. Dess hydrofoba interaktioner med HIV-proteaset bör vara liknande som indinavir CH3S3H, A03 Figur 13. Den förändring som leder till analog A03 är att vi har utökat kolkedjan mellan aromatringen och kloratomen. Molekylen behåller sina hydrofobiska egenskaper samt att den ökar i storlek CH3S3H, A04 Figur 14. Den förändring som leder till analog A04 är att vi har lagt till en kolatom så att kolkedjan blir längre och även att vi har bytt ut en kolatom mot en kväveatom i den aromatiska ringen. Detta kommer att ge en större molekyl men dess hydrofoba egenskaper kommer att vara lika. 18

21 1. 2. CH3S3H, A05 Figur 15. Förändringen som leder till analog A05 är att vi har tagit bort en kolatom i kolkedjan och bytt ut en kolatom mot en kväveatom i den aromatiska ringen. Detta ger en något mindre molekyl som bör ha liknande egenskaper då kväveatomen inte ska ge någon förändring i hydrofobicitet i den aromatiska ringen CH3S3H, A06 Figur 16. Förändringen som leder till analog A06 är att vi har bytt ut en kolatom mot en svavelatom i kolkedjan som binder fenylen. Detta förändrar inte de hydrofoba egenskaperna hos fenylen eftersom att svavelatomen är en bioisoster till kolatomen CH3S3H, A07 Figur 17. Förändringen som leder till analog A07 är att vi har lagt till en kolatom och även bytt ut en kolatom mot en svavelatom i kolkedjan som binder fenylen. Denna förändring ger ingen skillnad i hydrofoba egenskaper då svavelatomen är en bioisoster till kolatomen, men det ger dock en förändring i storlek. Syntes av indinavir utan förändring i steg 5 presenteras i figur Li[Si(CH3)3]2 2. Figur 18. Bilden beskriver hur syntesen ser ut i steg 5 då man inte har gjort några förändringar. 19

22 Förändring i syntes steg 5 leder till analog B01 som presenteras i figur Li[Si(CH3)3]2 2. B01 Figur 19. Förändringen i molekyl B01 beror på att vi har bytt ut brompropen till brombuten. Detta medför att kolkedjan blir längre vilket ger möjligheten att koppla på ytterligare en funktionell sidogrupp. Analogen blir längre och kan eventuellt få problem med att binda in till HIV-proteaset då man även har bytt ut andra delar av molekylen. Syntes av indinavir utan förändring i slutsyntesen, vilket beskrivs i avsnitt 1.5.3, presenteras i figur 20 nedan H2S4 Figur 20. Bilden beskriver slutsyntesen av indinavir utan förändring av reaktanter. Förändring av slutsyntesen som leder till analog C01-C06, presenteras i figur H2S4 C01 Figur 21. Förändringen i molekyl C01 är att vi har bytt ut en kolatom mot en kväveatom i den aromatiska pyridingruppen. Detta medför ingen skillnad i gruppens egenskaper och bör därför ha hydrofoba egenskaper vid interaktion med HIV-proteaset. 20

23 1. 2. H2S4 C02 Figur 22. Förändringen i molekyl C02 är att vi har lagt till en kolatom i kedjan som binder den aromatiska pyridingruppen, vilket medför att molekylen blir lite större men behåller sina hydrofobiska egenskaper H2S4 C03 Figur 23. Förändringen i molekyl C03 är att vi har tagit bort kväveatomen som sitter i den aromatiska pyridingruppen och bytt ut den mot en kolatom. Detta byte borde ge en molekyl med liknande egenskaper som grundmolekylen och dess hydrofoba egenskaper behålls H2S4 C04 Figur 24. Förändringen i molekyl C04 är att vi bytt ut pyridingruppen mot en tiofengrupp. Detta medför att de hydrofoba interaktionerna behålls och att analogen blir mindre än indinavir H2S4 C05 Figur 25. Förändringen som leder till analog C05 är att vi har bytt ut pyridingruppen mot en metyltiazol som är bioisoster med pyridingruppen och analogen bör ha samma hydrofoba egenskaper. 21

24 1. 2. H2S4 C06 Figur 26. Förändringen som leder till analog C06 är att vi har bytt ut pyridingruppen mot en etyltiazol som har bioisostera egenskaper och har hydrofoba interaktioner med HIV-proteaset. Syntes av Indinavir utan förändring i steg 7 presenteras i figur 27: [CCL2]2 CH [CH3]3CH2 Figur 27. Inga förändringar har genomförts i syntesen och detta är alltså samma reaktion som finns beskriven i avsnitt Förändring i steg 7, vilket leder till grundanalog A 01-A 03 presenteras i figur 28-30: [CCL2]2 CH [CH3]2CHH2 A 01 Figur 28. Förändring i molekyl A 01 är att reaktanten byts ut från att vara en t-butyl till en isopropyl. Dess hydrofoba egenskaper bevaras därmed. [CCL2]2 CH CH3CH2H2 A 02 Figur 29. Förändring i molekyl A 02 är att reaktanten byts ut från att vara en t-butyl till en etylgrupp. Dess hydrofoba egenskaper bevaras därmed. 22

25 [CCL2]2 CH A 03 Figur 30. Förändring i molekyl A 03 är att reaktanten byts ut från att vara en t-butyl till en fenylgrupp. Dess hydrofoba egenskaper bevaras därmed. Utifrån kunskapen om vilka metaboliter som bildas i kroppen då indinavir bryts ner, som beskrivs i avsnitt 1.3, har vi valt att designa analoger för att motverka bildningen av mindre effektiva substanser. Glukurordinering vid pyridkvävet (M1, figur 1), motverkas genom att byta ut pyridinringen mot t.ex. en bioisoster fenylring. Under pyridin--oxideringen (M2 och M4, figur 1) är det samma kväve i pyridinringen som angrips och omvandlas till en metabolit som i fallet med M1. Därför är även denna metabolit intressant att betrakta. Para-hydroxylering av fenylmetyldelen (M5, figur 1), är ett känt fenomen och som behandlas med att vätet i paraposition byts ut mot ett fluor som är bioisostert med vätet. Syntes av indinavir utan förändring i steg 1 presenteras i figur 31: Figur 31. Inga förändringar har genomförts i syntesen och är alltså samma reaktion som finns beskrivet i avsnitt Förändring i steg 1, vilket leder till grundanalogen F01, som presenteras i figur 32: F01 Figur 32. Förändring av startmaterialet inden där ett fluor är adderat och ger analog F01. I denna analog har vi utgått från indinavirs metaboliter, se avsnitt 1.3, och adderat ett fluor på den platsen för att förhindra metabolisering. Detta ger troligtvis längre duration. 23

26 Med metaboliten där 3 -hydroxylering av indanringen skett (M2, M3, M7, figur 1) i åtanke har vissa anloger skapats genom att byta ut ett väte i 3-position på indanringen till flour. Denna förändring presenteras i figur 33. F02 Figur 33. Denna analog kallad F02 fås genom att addera ett fluor i paraposition på fenylen. Även för denna analog har vi utgått ifrån metaboliterna för indinavir, se avsnitt 1.3, för att förhindra metabolisering kombinationer För att skapa flera analoger kombinerades de 19 grundanalogerna på olika sätt för att få analoger med fler än endast en förändring. Alla olika kombinationer kan ses i bilaga 1. Ett exempel på hur dessa har satts ihop kan ses nedan i figur CH3S3H, A01 1. Li[Si(CH3)3]2 2. B H2S4 C01 [CCL2]2 [CH3]2CHH2 CH A 01 Figur 34. Bilden visar fyra olika förändringar i syntesen av indinavir. 24

27 Dessa förändringar leder till kombination A01B01C01A 01 som presenteras i figur 35 nedan. Kombination, A01B01C01A 01 Figur 35. Bilden visar kombinationen av alla förändringar från figur Datasimulering av ligand-protein-interaktioner För att få en värdering av analogerna kan en datasimulering göras för att få fram hur pass bra varje analog passar i proteaset. Denna typ av datasimulering kallas dockning och kan alltså ge en bild av hur en ligand kommer att binda in till ett visst protein. Dockning är relativt svårt att genomföra och det behövs någon med kompetens och erfarenhet inom området för att kunna värdera den data man får ut. För att kunna genomföra dockningen kan antingen en konsult anlitas eller att en anställd får gå en kurs i programmet som används för analysen Konsult Då en konsult anlitas förväntas denne ha färdiga kunskaper inom programmet och kunna utföra själva körningen av alla 100 analogerna inom en vecka. Efter körningen behövs dessa utvärderas, vilket även beräknas ta ungefär en vecka. Detta resulterar i att dockningen totalt kommer att ta två veckor. Denna simulering kan med fördel genomföras av en utomstående specialist Utbildning m dockning aldrig tidigare gjorts behövs en kurs för att kunna använda sig utav programmen. Denna kurs pågår under fem veckor och detta ska ge en tillräcklig grund för att kunna utföra analysen. Kursen heter Läkemedelskemi med datorbaserad läkemedelsdesign och ges av Uppsala Universitet och är gratis för alla inom EU. Själva analysen beräknas sedan sammanlagt att ta två veckor, det inkluderar körning i programmet av alla 100 analoger, samt utvärdering av all data som fåtts fram. 25

28 2. Bindningsassay 2.1 Inledning är läkemedel ska utvecklas mot en sjukdom så riktar man in sig på något som på engelska kallas för drug target. Detta är oftast en molekyl som är specifikt för själva sjukdomsförloppet. I början tar man fram många potentiella molekyler som teoretiskt fungerar på det target som valts. Redan på ett tidigt stadium är det viktigt att värdera dessa molekyler. Men in vivo studier i detta stadium är alldeles för riskabelt. Idag finns det olika alternativ för att testa molekylernas verkning in vitro. Målet med det här projektet var att ta fram en bindningsassay för att undersöka 100 analogers affinitet till HIV-proteas. Sedan skulle även kostnaderna för bindningsassayen beräknas. I denna del av rapporten kommer vi att ta upp teorin kring den valda metoden, exempel på hur utförandet kan se ut, en tidsplan för att genomföra allting samt kostnader i form av inredning, instrument, material, kemikalier, personal och avfall. 2.2 Bakgrund För att få fram nya läkemedel mot HIV krävs ett stort urval av potentiella substanser som kan testas för att på så sätt avgöra vilka som har den önskade effekten. I industrin idag är det vanligast att man har ett mycket stort bibliotek med molekyler som man screenar för att på så sätt få fram molekyler med de egenskaper som man letar efter. Denna metod kallas för high-throughput screening (HTS). Men denna metod är alltså lämpad när det är tusentals, eller miljontals, molekyler som ska testas. I mindre skala får man använda sig av alternativa metoder. I det här projektet ska en hämmare till enzymet HIV-proteas tas fram. Idag är det vanligaste sättet att hitta sådana hämmare genom att se vilken effekt de har på proteasets aktivitet. En relativ lätt och billig metod är FRET (fluorescence resonance energy transfer). Metoden går ut på att ett substrat till HIV-proteaset märks med en fluorescerande grupp och en quenchande grupp (en grupp som släcker fluorescensen). m HIV-proteaset kan klyva substratet kommer avståndet mellan fluorescerande och quenchande grupp att bli så stort att fluorescensen från provet ökar. För att testa sitt förslag på inhibitor kan man tillsätta den till provet. Ju bättre inhibitorn fungerar desto mindre fluorescens blir det. Men i det här projektet var önskemålet att de 100 analogernas affinitet till HIV-proteaset ska undersökas, och alltså inte deras effekt på proteasets aktivitet. Valet föll då på en kompetitionsstudie med radioligand som är en relativt enkel och billig metod för att uppnå detta. Eftersom uppgiften att beräkna kostnaden för bindningsassayen även ingick i projektet så är denna metod bra på det sättet att kostnaderna går lätt att uppskatta. edan under avsnittet 2.4 beskrivs metoden mer ingående. 26

29 2.3 Arbetssätt Arbetet med det här projektet har främst varit litterära studier, studiebesök och mailkontakt med olika företag. är vi kom fram till metoden för bindningsassayen utgick vi ifrån en av våra gamla labbhandledningar. I det fallet utfördes kompetitionsstudien på en ligands affinitet till sin receptor. Men vi ansåg att den här metoden även skulle kunna anpassas till detta projekt. Så med hjälp av labbhandledningen, internet och boken Textbook of Receptor Pharmacology så kunde vi ta fram ett nytt utförande som var anpassat för vårt fall. Vi var även på ett studiebesök hos en elev på Uppsala Universitet som sysslar med en liknande metod, nämligen RIA (radioimmunologisk analys). Detta gav oss tillfälle att ställa frågor om till exempel val av buffert, kapacitet, koncentrationer och utrustning. Vi har gjort omfattande sökningar på internet och i litteratur efter källor som kan styrka att en kompetitionsstudie går att genomföra för HIV-proteaset och de olika inhibitorerna. Tyvärr så har vi inte lyckats hitta någon sådan källa. Det vi sett är att man oftast använder metoden FRET. Men vi har haft kontakt med en professor i biokemi på Uppsala Universitet och frågat henne om hon tror att det här kommer att fungera i praktiken. Hon gav då svaret att det borde fungera men att man måste ha koll på kinetiken för de olika interaktionerna med HIVproteaset. Sedan skulle även kostnaderna för bindningsassayen beräknas. är vi skulle hitta produkterna som behövs för att utföra assayen hade vi vissa krav, bland annat att: de ska vara anpassade efter laboratoriemiljö företaget ska gärna vara lokaliserat i/i närheten av Uppsala/Sverige leverantörer ska ha ett brett urval så att antalet leverantörer kan minskas det ska vara etablerade företag Även här var labbhandledningen till stor hjälp eftersom den gav riktlinjer till vilka maskiner, material och kemikalier som behövs för att kunna utföra bindningsassayen. Efter sökningar på internet kunde leverantörer hittas. För labbinredningen valdes LabRum som vi är mycket väl bekanta med. LabRum är även leverantörer till vårt universitet och därför är vi säkra på att deras produkter uppfyller de krav vi har. Företaget är lokaliserat i Stockholm, vilket kommer underlätta leverans och installering. Utifrån deras onlinekatalog har vi valt all inredning, däribland även dragskåp, diskmaskin, kyl och frys, som behövs i labbet. Dock redovisar LabRum inte sina priser på hemsidan men genom mailkontakt har vi lyckats att få tag i dessa uppgifter. är det gäller materialet valdes leverantören Fischer Scientific. Detta företag är även det lokaliserat i Sverige, nämligen i Göteborg. I deras onlinekatalog är de flesta priserna redovisade. Fischer Scientific har i sitt utbud utrustning i form av instrument och glasvaror med mera, men även vissa kemikalier. 27

30 I bindningsassayen krävs vissa kemikalier som är så specifika att vi har varit tvungna att välja leverantörer som specialiserar sig på just det. Detta innebär att kravet att de ska ligga i eller i närheten av Sverige måste ifrångås. Den radiomärkta liganden kan American Radiolabeled Chemical Inc erbjuda. I företagets onlinekatalog finns all den nödvändiga informationen, till exempel pris och radioaktivitet. Som leverantör av HIV-proteaset valdes AnaSpec grundat på att de gav information om enzymet, förpackningsstorleken och priset. Även scintmätaren som behövs för att kunna utföra assayen måste importeras från utlandet. Valet av leverantör föll på Perkin Elmer som är specialiserade på denna typ av instrument. För att få fram kostnaderna för avfallshanteringen var vi på studiebesök på Uppsala Universitet hos en person som är ansvarig för hanteringen av radioaktivt avfall på BMC. Hon visade oss proceduren som BMC gör när det gäller avfallshanteringen. Utöver det så har vi haft kontakt med en annan anställd på BMC, som har en mer övergripande bild av hela processen och vad det kostar. Han gav oss information om hur mycket det kostar för BMC att ta hand om sitt radioaktiva avfall och vilket företag som erbjuder tjänsten. Så då tog vi kontakt med företaget som heter Ragn Sells och frågade mer specifikt om avfallet i detta projekt och vad det skulle kunna kosta. 2.4 Kompetitionsstudie Teori Med en kompetitionsstudie kan olika inhibitorers affinitet till HIV-proteas undersökas. I studien används en fix mängd av radiomärkt inhibitor. Sedan tillsätts olika koncentrationer av omärkt inhibitor. För att kompetitionsstudien ska bli lyckad bör koncentrationen av radiomärkt inhibitor vara mindre än K d, alltså inhibitorns dissociationskonstant (se jämviktssamband nedan). Den omärkta inhibitorn kommer att konkurrera mot radioinhibitorn om bindning till enzymet. Ju högre koncentration av den omärkta substansen desto mer kommer den radiomärkta substansen att konkurreras ut. Då kompetitionen fått äga rum måste bundna ligander separeras från obundna. Detta görs med hjälp av filtrering. Filtreringen ska gå snabbt men måste hålla kvar allt enzym. Det är också viktigt att tvätta med buffert för att avlägsna all obunden radioligand. Därefter ska radioaktiviteten på filtret bestämmas; i detta fall med en vätskescintillator. Ju högre radioaktivitet, desto mindre av omärkt ligand har bundit till enzymet och vice versa. I en kompetitionsstudie måste dessutom mätningar på ospecifik bindning och referensbindning göras. Referensbindningen används för att kunna bestämma den maximala mängd av radioligand som kan binda till enzymet. Den ospecifika bindningen är ett mått på hur mycket av radioliganden som binder till andra ställen än HIV-proteaset. Detta erhålls genom att tillsätta 28

31 omärkt ligand i överskott så att all radioaktiv substans konkurreras bort från bindningsstället på enzymet. Då kommer endast den ospecifika bindningen finnas kvar. Därefter kan den specifika bindningen i procent beräknas med följande formler(cpm = counts per minute, antal radioaktiva sönderfall per minut): Sedan kan en logaritmisk graf ritas upp med specifik bindning på y-axeln och den logaritmiska koncentrationen av omärkt inhibitor på x-axeln. Därefter hittas IC 50 -värdet genom att gå från 50 % på y-axeln och se vilken koncentration detta motsvarar på x-axeln. IC 50 -värdet är den koncentration av omärkt ligand som inhiberar enzymet med 50 %. Detta värde är proportionellt mot inversen av affiniteten Kort om utförandet av kompetitionsstudien Utförandet av kompetitionsstudien kan delas in i fem olika steg och dessa beskrivs nedan. Steg 1. Spädningsserie I det här inledande steget av bindningsassayen koncentrationer av omärkt ligand, det vill säga analog. tillbereds lösningar med olika Steg 2. Provserie I detta steg blandas analoglösningarna med radioligand och HIV-protes. Rätt koncentration uppnås genom spädning med buffert. Det är nu som själva kompetitionen mellan analog och radioligand börjar. Steg 3. Filtrering Det är här som obunden analog och radioligand samt buffert separeras från de molekyler som bundit till HIV-proteaset. HIV-proteaset fastnar på filterpappret. Steg 4. Mätning med vätskescintillator Här mäter man filtrens radioaktivitet så att den specifika bindningen för varje analogkoncentration kan beräknas. Steg 5. Analys I det här avslutande steget analyseras bindningsassayens resultat och i och med detta kan IC 50 -värdet för analogen erhållas. Innan den här processen kan påbörjas måste en del förberedelser utföras. Mer utförliga instruktioner för förberedelserna och bindningsassayens fem steg kan läsas i bilaga 2. 29

32 2.5 Kommentarer till kompetitionsstudien Radiomärkt ligand Kraven på radioliganden i denna kompetitionsstudie är följande: den ska vara en HIV-proteas hämmare den ska ha en radioaktivitet som kan detekteras i vätskescintillatorn det ska finnas prisinformation om den Utifrån dessa krav valdes [ 3 H]ritonavir, som är en HIV-proteashämmare precis som indinavir och de 100 analogerna. Ett företag som säljer [ 3 H]ritonavir är American Radiolabeled Chemicals, Inc. I deras katalog finns ett stort utbud av radiokemikalier och även andra HIVproteashämmare finns tillgängliga. Ritonavir hade dock högre radioaktivitet än vad andra alternativ, som t.ex. saqunavir, hade. Det är inte bara valet av radioligand som måste motiveras utan även valet av koncentrationen i provserien. Enligt teorin ska koncentrationen vara lägre än K d, som är dissociationskonstanten mellan HIV-proteas och ritonavir. Ritonavir förutspås ha ett K d på 5, M och därför sattes koncentrationen i provserien till 10-9 M HIV-proteas Koncentrationen i provserien ska vara anpassad enligt följande krav: det ska bli en kompetition mellan radioligand och omärkt ligand radioaktiviteten av bundet ritonavir ska kunna detekteras rimligt pris per analog lätt att blanda till stamlösning Det HIV-proteas som vi har valt säljs av Anaspec. En förpackning består av 5 µg enzym med molvikten kda. Detta är molvikten för en subenhet, men för att enzymet ska bli aktivt måste två subenheter gå ihop och bilda en homodimer. Enzymet är av typen wild type och är anpassat för att användas i FRET-assays. Eftersom FRET-metoden kräver att proteinet är aktivt och fungerade så borde enzymet även kunna användas till vår kompetitionsstudie. Enzymet är aktivt när det kan klyva det som binder till bindningsstället. Alltså måste bindningsstället vara intakt i detta proteas. För att det ska bli en kompetition mellan analog och radioligand om bindningsställen så får det inte finnas för mycket HIV-proteas. Dock får det inte bli för låg koncentration av HIVproteas eftersom det då finns en risk att radioaktiviteten blir för låg för att kunna detekteras. Valet av koncentration blir därför en vägning mellan de två ovanstående argumenten. Det borde vara rimligt att tänka att vid den lägsta koncentrationen av analog så ska all omärkt ligand och all radioligand kunna binda till HIV-proteaset. Men enzymet är endast aktivt när det bildar en homodimer. Så vi har utgått ifrån att substansmängden homodimer ska vara lika stor som summan av den lägsta substansmängden ritonavir och analog. Enligt våra beräkningar så kommer koncentrationen homodimer att bli 90 nm i provserien om två 30

33 förpackningar HIV-proteas blandas med 5 ml buffert. Detta gör att resonemangen kring substansmängderna uppfylls ungefärligt. rsaken till att det blir ungefärligt är dels det att vi inte har en exakt molvikt för proteaset och även att vi vill att tillberedningen ska bli enkel. Dessutom så har vi antagit att alla monomer går ihop till homodimerer samt att enzymet inte genomgår autoprotolys. Det som är nackdelen med att köpa in HIV-proteaset från en leverantör är att det blir väldigt dyrt. Det kan mycket väl vara så att det lönar sig att framställa HIV-proteas själv istället i labbet. Detta kan man åstadkomma genom en metod som heter transfektion. Metoden går ut på att man introducerar främmande material, oftast manipulerade plasmider, antingen in vitro eller in vivo. Syftet är att få cellerna att producera ett visst protein eller att minska cellernas produktion av ett protein. Så man skulle kunna få celler att producera HIV-proteas och sedan rena fram det. Att framställa HIV-proteaset genom transfektion är något som vi tycker borde undersökas närmare. Speciellt om projektet kommer att förstoras. Vi ser att kostnaderna för att köpa in proteaset är väldigt betydande i jämförelse med andra komponenter i bindningsassayen. Vi ser stora möjligheterna att kunna sänka kostnaderna genom att utveckla en transfektionsprocess om projektet beslutas att bli mer omfattande. Till en början kommer det dock bli en stor investering att utveckla denna metod eftersom den kommer att kräva utrustning, kunnig personal och optimering. Så när det gäller ett projekt i denna storlek så tycker vi inte att detta är värt. Men som sagt, för ett större projekt så kommer kostnaderna för transfektionsprocessen att löna sig i längden jämfört med att köpa in HIV-proteaset Buffert Kraven på bufferten i bindningsassayen är att den: inte ska denaturera HIV-proteaset ska vara blandbar med alla komponenter (radioligand, omärkt ligand o.s.v) ska kunna gå att sätta ett pris på Vi utgick ifrån att det mest känsliga ämnet i assayen kommer vara HIV-proteaset. Bufferten ska därför vara anpassad för detta ämne. Vi valde att inte komma på en egen buffert utan att följa ett recept på HIV-proteas-buffert som vi hittade på Sigma-Aldrich hemsida. På hemsidan finns ett informationsblad där företaget ger exempel på utförande av kinetikstudier på HIV-proteas med substrat/inhibitor. I det här informationsbladet anger de receptet på bufferten. Eftersom kompetitionsstudien är en kinetikstudie så borde bufferten fungera i vårt fall Kravet på koncentrationsintervallet för analogerna i provserien är det gäller koncentrationerna av analog i provserien så finns huvudsakligen två krav: IC 50 -värdet för analogerna ska finnas inom intervallet det ska vara ett brett intervall så en bra kurva erhålls IC 50 -värdet hos våra analoger kan troligtvis jämföras med IC 50 -värdet för indinavir eftersom dessa är me too -preparat. Indinavir har ett IC 50 -värde runt 10-6 M. Men troligen kan vissa 31

34 analoger skilja sig från indinavir till det bättre/sämre och därför är det bra att välja ett ganska brett intervall. Utifrån detta valde vi att i provserien ha fem koncentrationer av analogerna i intervallet M. 2.6 Tidsplan Syntesdesign AB har önskat en tidsplan för projektet kring bindningsassayen. Eftersom Syntesdesign AB endast bistår med lokal så är det vår uppgift att ge företaget ett fungerande labb där bindningsassayen kan utföras. Så vi har tagit hänsyn till det här i vår uppskattning av tidsåtgången. är labbet är installerat kan optimering av metoden för bindningsassayen påbörjas. Därefter kan det riktiga försöket göras. Detta innebär laborativt arbete, analys och validering. Första steget i processen blir: Installering av el, vatten och ventilation Leverans och montering av labbinredning Leverans och installering av nödvändiga instrument Leverans av kemikalier och engångsmaterial/labbutrustning Detta anser vi bör ta en till två månader. Därefter kan optimering av metoden påbörjas. ptimeringen är nödvändig eftersom alla de mängder som är angivna i beskrivningen är valda ur ett teoretiskt perspektiv. Vi har inte haft möjligheten att testa detta i verkligheten. Så i teorin borde utförandet fungera, men optimeringen behövs för att den även ska fungera praktiskt. är optimeringen ska utföras så bör man utgå från beskrivningen i bilaga 2. ågra av de faktorer som med sannolikhet behövs kontrolleras är: koncentration och ph för bufferten koncentrationer av analogen i spädningsserien mängden radiomärkt ritonavir mängden av HIV-proteas Vi beräknar att det kommer att ta ungefär en till två månader för en väl insatt person att göra det här. är det kommer till själva bindningsassayen har vi genom diskussioner kommit fram till att om metoden är väl fastställd bör det ta ca två veckor för två personer att utföra det laborativa och analysen för 100 analoger och indinavir. Men för att få resultaten så trovärdiga som möjligt rekommenderar vi att metoden utförs tre gånger, alltså tre genomkörningar, för alla analoger och indinavir. I och med detta innebär det att det kommer ta ca sex veckor för själva bindningsassayen. Utöver detta tycker vi att två veckor även ska ägnas åt att validera resultaten som erhålls. Grundat på den grova tidsplanen ovan så beräknar vi att det från början till slut kommer att ta runt ett halvår. 32

35 2.7 Kapacitet Beställaren, Syntesdesign AB, har en önskan att en genomkörning av bindningsassayen för de 100 analogerna ska utföras på ca tio arbetsdagar. Vi har tagit hänsyn till detta och för att detta ska vara möjligt har vi följande rekommendationer. Utför allt det laborativa först Detta borde ta fem arbetsdagar. Det innebär att bindningsassayen ska utföras för 20 analoger per dag. Grundat på detta anser vi att två personer bör arbeta i labbet. Ett exempel på arbetsgång kan vara: Utför alla förberedelser Blanda till spädningsserierna för de tio analogerna Göra provserien för de tio analogerna Filtrera proverna Mät radioaktiviteten för proverna Ägna även en dag till att utföra beredning och mätning på indinavir, samt för proverna med ospecifik och referensbindning. Här räcker det med en person som utför arbetet. Vi rekommenderar en körning på indinavir. Eftersom själva huvuduppgiften för det här projektet är att hitta analoger till indinavir är det av intresse att få fram IC 50 -värdet för denna substans. I och med detta går det att jämföra analogerna med indinavir och se om deras affinitet till HIV-proteas är bättre eller sämre i jämförelse. För denna anledning har vi även bifogat priset på indinavir, se tabell 5 i avsnitt är det gäller ospecifik och referensbindning är de körningarna absolut nödvändiga för att resultaten som bindningsassayen ger ska kunna analyseras. I den här rapporten har vi räknat med att dessa endast behöver göras en gång för varje genomkörning. Detta har vi grundat på att både ospecifik och referensbindning är helt oberoende av analogen. Det är ju förstås möjligt att lägga till prover för ospecifik och referens för varje analog. Men det innebär i sig att tidsplanen måste förlängas och att kostnaderna ökar. Avsluta med analysen av de 100 analogerna De återstående dagarna, alltså fyra dagar, kan användas för att analysera de 100 analogerna samt proverna för indinavir och ospecifik och referensbindning. Detta görs med hjälp av en dator med programmet Excel. Även under detta moment bör två personer arbeta. Det ultimata är om samma person som utfört det laborativa även får analysera sina prover. För att effektivisera analysen kan en grundmall i Excel skapas. I grundmallen kan t.ex. en x-axel definieras eftersom den är samma för alla 100 analoger. Ett exempel på arbetsgång kan vara: Två dagars beräkningar av medelvärde och specifik bindning i procent Två dagars inmatning och plottning i Excel 33

36 2.8 Kostnader Inredningskostnader I tabell 1 nedan redovisas alla inredningsprodukter som behövs i labbet. Under tabellen finns även bilder på produkterna. är det gäller labbinredningen har vi tagit hänsyn till att de två personer som ska utföra bindningsassayen ska ha gott om plats. Var och en har tillgång till arbetsplats och dragskåp. Men vi har beställt mer inredning än vad som krävs. Detta ger möjligheten att utöka projektet om det skulle önskas. I dragskåpen kan fyra personer arbeta samtidigt medan åtta personer utan svårighet skulle kunna jobba vid borden. Utöver arbetsborden har även vanliga bord beställts där utrustning och instrument kan placeras. Bordskonstruktionerna och högskåpen kan användas för att förvara kemikalier som inte behöver kylas och annan laboratorieutrustning. Dessutom har vi utrustat labbet med diskbänk för grovdisk och en nöddusch för eventuella olyckor. Tabell 1. Kostnader och övrig information för nödvändig labbinredning Produkt Produktnamn Mått (mm) St pris (SEK) Leverantör Antal Totalt (SEK) Dragskåp ptimal 1500 VP 1500x800x LabRum Diskbänk DD x LabRum Tungbord LB x LabRum Labbord LBB x LabRum Överskåp ÖG x330x LabRum Hylla med bakkantlist HB x LabRum Installationshylla IH x LabRum IH x LabRum Kombinerad Art. r kropps- och 30 ögondusch LabRum Skåphurts S x555x Labrum Högskåp ST x450x LabRum Stativgavel SG 637 LabRum Stödbock SB 530 LabRum Golvtakståndare GS 1035 LabRum Mellanslag för tungbord MTÖ 383 LabRum MT 383 LabRum Förstärkningsram FI 467 LabRum Hängskena HS LabRum Sarg med näsa S LabRum S LabRum Hyllkonsol K LabRum Totalt: SEK 34

37 Tungbord Labbord Diskbänk Högskåp Dragskåp Instrumentkostnader I tabell 2 nedan redovisas de instrument och maskiner som behövs för att utföra bindningsassayen. Kostnaderna är investeringskostnader och är alltså oberoende av projektets storlek. Dessa instrument kan utöver att användas i detta projekt även användas i kommande. Datorerna, Excel-programvaran och skrivaren behövs för själva analysen och valideringen av de 100 analogerna och indinavir. Destillationsapparaten har vi valt för att kunna tillverka avjoniserat vatten som behövs vid bland annat spädningsserien och bufferten. Filterenheten har 12 porer och underlättar och effektiviserar filtreringen av alla prover. Frysen och kylen behövs för att förvara kemikalier och protein som har speciella krav på förvaringstemperaturen. är analogerna ska jämviktas med HIV-proteaset bör temperaturen ligga runt 37 o C. För detta krävs en inkubator. Vågen behövs för att kunna mäta upp rätta mängder. Eftersom det i detta projekt kommer att handla om mikrogram behövs en specialvåg; varpå priset blir så pass högt. Även diskmaskinen är ganska dyr. Detta beror på att den utöver diskfunktionen även kan användas som desinfektör och den har även en 35

38 inbyggd varmluftstork. Scintmätaren är en betamätare och det krävs eftersom det i bindningsassayen kommer att mätas på tritierad substans. Tabell 2. Kostnader och övrig information för nödvändiga instrument och maskiner Produkt Produktnamn Styckpris (SEK) Leverantör Antal Totalt (SEK) Dator MSi Wind Top Elgiganten Destillationsapparat GFL Fischer Scientific Diskmaskin Miele G LabRum Excel-programvara ffice Home & Student Elgiganten Filterenhet Millipore Fischer Scientific Frys BioCompact II RF LabRum Inkubator Incucell Fischer Comfort 22 L Scientific Kyl BioCompact II RR LabRum Scintmätare Mikrobeta 2 plate counter PerkinElmer Skrivare Canon Pixma MP Elgiganten Våg Mikrovåg Fischer Competence Scientific CPA2P Sartorius Materialkostnader Totalt: SEK Investering I tabell 3 nedan ses de material som behövs i bindningsassayen, men som inte ses som engångsartiklar eftersom de är oberoende av antal prover. Dispenserpipetten är ett effektivt sätt att pipettera eftersom den fylls upp och sedan kan en konstant mängd av innehållet pipetteras ut innan pipetten måste fyllas på igen. Detta är att föredra eftersom det är ganska många prover som ska göras, och det är samma mängd av de flesta komponenter som ska tillsättas till proverna. Automatpipetterna används i de fall när mängden som ska pipetteras ut måste varieras eller i de fall där volymerna är för små för dispenserpipetten. Bägare, mätglas och mätklovar har valts för att kunna användas i tillberedning av de lösningar som behövs i bindningsassayen. Vi har valt ett antal storlekar på dessa för att få möjlighet att tillbereda ett brett intervall av volymer. 36

39 Tabell 3. Kostnader och övrig information om nödvändiga material Produkt Produktnamn Mått Antal/fp Pris (SEK) Automatpipett Finnpipette 2 20 µl Finnpipette µl Bägare Pyrex LMMP 25 ml Pyrex LMMP 100 ml Pyrex LMMP 250 ml Pyrex LMMP 600 ml Dispenserpipett HandyStep Mätglas Kl A Pyrex 5 ml Mätkolv Kl A Pyrex 25 ml Kl A Pyrex 100 ml Kl A Pyrex 250 ml Pyrex volymet certboro PP Pyrex volymet certboro PP 5 ml ml Pincett L = 13 cm 1 70 Provrörsställ Trådställ Epox 4x15 rör Leverantör Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Antal Totalt (SEK) Totalt: SEK 37

40 Engångsartiklar I tabell 4 kan de engångsartiklar som krävs i assayen ses. Filterpapprena är utvalda eftersom de lämpar sig extra bra vid proteinrening och scintmätning. Provrören är också anpassade till vår metod eftersom rörens material har låg affinitet till proteiner. Scintrören är valda så att de ska passa till scintmätaren. Tabell 4. Kostnader och övrig information för nödvändiga engångsartiklar. Produkt Produktnamn Mått Antal/fp Filterpapper Provrör Whatman glasfiberfilter GF/F Immuno MiniSorp Pris (SEK) D = 25 mm ml Provrörskorkar Dispstopper PE Scintrör 4 ml Spetsar till pipetter PD-Tips 12,5 ml PD-Tips 5 ml Finntip 20 0,2 20 µl Finntip µl Leverantör Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Fischer Scientific Antal Totalt (SEK) Totalt: SEK Tabell 4 ovan är grundad på hur mycket material som krävs för en körning av 100 analoger och indinavir om man utgår från instruktionerna i bilaga 2. Men vi har kommit fram till att det borde göras tre körningar på varje analog. Det innebär grovt att priset ovan måste multipliceras med tre. Sedan kommer ju även dessa material behövas i optimeringen av metoden. Hur mycket som kommer att gå åt i optimeringen är mycket svårt att förutsäga, i alla fall exakt. Men det som vi kan säga är att vi anser att optimeringen kommer ta runt två månader att utföra. Grundat på hur många prover man hinner göra på en dag innebär det att en person hinner göra två körningar på alla analoger på två månader. Så slutligen innebär det att priset för engångsartiklarna kan multipliceras med fem för att få fram ett troligt pris på optimering och tre körningar av analogerna. Slutpris för engångsmaterial = SEK Kemikaliekostnader I tabell 5 nedan ses alla de kemikalier som behövs i bindningsassayen. Dessa kemikalier är grundade på det teoretiska utförandet. I optimeringsprocessen kan det upptäckas att dessa måste bytas ut mot andra, men det kan inte vi ta hänsyn till nu. 38

41 DTT, EDTA, glycerol, natriumacetat och natriumklorid är beståndsdelarna i bufferten. HIVproteaset är det enzym som analogerna ska binda till i kompetitionsstudien. Ritonavir är den radiomärkta liganden som borde teoretiskt fungera i bindningsassayen. Scintvätskan behövs för att scintmätaren ska kunna uppfatta radioaktiviteten i de prover den mäter på. Indinavir är redovisat i denna tabell eftersom en körning på indinavir är nödvändigt för att kunna jämföra analogernas affinitet med indinavirs. Tabell 5. Kostnader och övrig information för nödvändiga kemikalier. Produkt Koncentration Mängd Leverantör Pris/fp (SEK) Antal Totalt (SEK) DTT 1 M 50 ml Sigma-Aldrich EDTA 0,5 M 2500 ml Fischer Scientific Glycerol 99,9 % 100 ml Sigma-Aldrich HIV-proteas 5 µg Anaspec Indinavirsulfat 1 mg American radiolabeled chemicals, inc atriumacetat 3 M 1000 ml Fischer Scientific atriumklorid 5 M 1000 ml Fischer Scientific American Radiomärkt Ci/mmol, radiolabeled ritonavir 1 mci/ml chemicals, inc Scintvätska 5000 ml Sigma-Aldrich Totalt: SEK De mängder av kemikalier som är redovisade i tabellen ovan är grundad på hur mycket som krävs för en genomkörning av 100 analoger och indinavir. Precis som för engångsartiklarna under avsnittet ovan kan priset multipliceras med fem för att få en ungefärlig bild av hur mycket kemikalierna för detta projekt kommer att kosta. Slutpris: SEK Personalkostnader ptimering/utvecklingsperiod Under den här perioden anser vi att det räcker gott och väl med en anställd. Denna person får gärna vara erfaren när det gäller både att arbeta i labb och som varit med och utvecklat liknande metoder. En professor inom detta område borde ha tillräcklig kompetens och kan säkerligen göra optimering så effektiv som möjligt. Medellön för professor: SEK/mån Tid för utförande av optimering: 2 mån Antal anställda: 1 39

42 Lönekostnader * Lön Semesterlön Arbetsgivaravgifter Totalt (lön och skatt) Genomsnittlig månadskostnad Totalt: SEK SEK SEK SEK SEK x 2 = SEK Bindningsassay Under den här perioden har vi kommit fram till att två personer räcker väl för att kunna utföra arbetet på ett bra sätt. Medellön för laboratorieassisten: SEK/mån Tid för utförande av bindningsassay: 2 mån Antal anställda: 2 Lönekostnader * Lön Semesterlön Arbetsgivaravgifter Totalt (lön och skatt) Genomsnittlig månadskostnad Totalt: Slutsumma för personalkostnader: SEK SEK SEK SEK SEK x 4 = SEK = SEK Lön Månadslönen x 11 månader. Denna beräkning avser lön för tid i arbete Semesterlön Månadslönen x 11 månader x 12 %. Denna beräkning avser lön vid semester enligt semesterlagens villkor, men med viss förenkling. Semesterlagen anger en rätt till 25 dagars semester och semesterlön beräknad med 12%. I denna beräkning har det förenklats med 25 dagar likvärdigt en kalendermånad semester. Arbetsgivaravgifter (Lön + semesterlön) x aktuell procentsats arbetsgivaravgift. I detta fall har beräkningen förenklats med den allmänna procentsatsen för arbetsgivaravgifter. Genomsnittlig månadskostnad Totala kostnaden för lön och skatt/12 månader *: exklusive kollektivavtal och avtalsförsäkringar 40

43 2.8.6 Avfallskostnader I utförandet av bindningsassayen används [ 3 H]ritonavir. Detta farliga avfall måste tas om hand och det uppkommer då avfallskostnader. Ragn Sells är ett företag som är specialister på detta och det är från dem vi fått de aktuella priserna. Då tritium är en betastrålande radioaktiv nuklid krävs särskild kunskap vid omhändertagandet. Först måste avfallsentreprenören ha ett tillstånd för hantering, transport och mellanlagring av radioaktiva strålkällor. Steg två blir att avgöra hur mycket aktivitet som tritiumet innehåller, med hänsyn till halveringstider. Därifrån får man läsa i föreskrifterna från Strålsäkerhetsmyndigheten (SSM) och se hur avfallet ska behandlas. Till sist så ska avfallet transportmärkas enligt lagen om transport av farligt gods (ADR). Hänsyn tas då till aktivitet och fysisk beskaffenhet för att avgöra typ av kolli och etikettering. Behandlingsmässigt är det absolut vanligaste att tritiumavfallet förbränns och energi utvinns. Dock kan det även finnas lägen då aktiviteten är så pass hög att det måste tas omhand som radioaktivt material. I dessa lägen finns idag ett stort problem. Det finns i dagsläget bara en mottagning för radioaktivt material i Sverige. Det är Studsvik utanför yköping. Men där tar de inte emot tritierat avfall, då de saknar bra behandlingsmetoder för detta. Så hantering av det tritierade avfallet kan bli en ganska komplex fråga. Eftersom det i vårt projekt är en fråga om lågradioaktivt avfall så är förbränningsalternativet den bästa metoden för avfallshantering. Innan Ragn Sells gör sin uppgift så måste avfallet paketeras i avfallskartonger och märkas med ettiket. Uppgiften för Ragn Sells är att utföra all dokumentation kring avfallet. Dessutom är deras uppgift hämtning, transport och omhändertagande av avfallet samt sortering och transportförberedelse av det radioaktiva avfallet. Ett standardjobb tar ca en timme på plats och ca en timme går åt för att transportera godset. Kostnaden blir lite missvisande eftersom Ragn Sells oftast tar hand om mycket material, inte kilovis som i tabellen nedan. Vanligen har kunden samlat på sig mera avfall vid samma tillfälle. I vårt fall kommer material, som till exempel kartonger, och behandlingsavgift att vara beroende av hur mycket avfall som vi producerar och resten kommer att vara en engångsavgift, då vi antar att en körning räcker. Kostnaderna, grovt räknade, kan ses nedan Framkörning: Godstransport: Specialist radioaktivt: Mätinstrument: Dokumentation Radioaktivt avfallskartong: Innersäck till kartongen: Buntband till säcken: Radioaktivt avfallsetiketter: Behandlingsavgift: 1060 SEK/st 1200 SEK/tim 1100 SEK/tim 700 SEK/st 150 SEK/st SEK/st 4.10 SEK/st SEK/st ca 3 SEK/st 25 SEK/kg 41

44 Det är svårt att uppskatta mängden avfall som behöver omhändertagas i vårt projekt. Så vi har gjort en grov uppskattning. I denna uppskattning beräknar vi att det kommer behövas ungefär 20 kartonger som grovt kommer att väga ca 20 kg totalt. Detta innebär att Ragn Sells bara behöver göra en hämtning för det här projektet. Kostnaderna för avfallshanteringen kan ses i tabell 6. Tabell 6. Kostnader för avfallshantering. Pris per hämtning (SEK) Timkostnad (SEK) Styckpris (SEK) Kilopris (SEK) Totalt pris (SEK) Framkörning Godstransport Specialist radioaktivt Mätinstrument Dokumentation Radioaktivt avfallskartong 19, Innersäck till kartongen 4,10 82 Buntband till säcken 0,438 8,76 Radioaktivt avfallsetiketter 3 60 Behandlingsavgift Slutsats Totalt: SEK Slutsatser av bindningsassayen Som redovisats ovan så valdes en kompetitionsstudie med radioligand som metod för att ta fram de 100 analogernas affinitet till HIV-proteas. Som radioligand valdes ritonavir, som precis som indinavir är en hämmare till enzymet. Rent teoretisk så är vår övertygelse stark att det här kommer att fungera. Vi har haft kontakt med en professor som är väl insatt i liknande metoder och även hon tycker att det borde gå. Med en väl utförd optimering så tror vi att detta även kan fungera praktiskt Kostnad för bindningsassay I tabell 7 och 8 nedan redovisas kostnaderna för en genomkörning av 100 analoger, prov med indinavir samt ospecifik och referensbindning. 42

45 Kemikalier Tabell 7. Kostnader för kemikalierna som behövs för en genomkörning av bindningsassayen. Produkt Mängd per anlog Pris per analog (SEK) Total mängd Totalt pris (SEK) DTT 0,07 ml 0,9 7,3 ml * 86 EDTA 0,14 ml 0,1 14,6 ml * 11 Glycerol 7,2 ml 18,4 2,2 liter * 1870 HIV-proteas 3 µg ,3 mg * Indinavirsulfat 0,71 mg 790 atriumacetat 2,4 ml 2,5 244 ml * 254 atriumklorid 14,4 ml 15,6 1,46 liter * 1582 Radiomärkt ritonavir 10,9 ng 12,9 1,1 µg * 1310 Scintvätska 3 ml 28,9 4,6 liter* 2930 Totalt: SEK Material Tabell 8. Kostnaderna för engångsartiklar som behövs för en genomkörning av bindningsassayen. Produkt Antal per analog (st) Styckpris (SEK) Totalt antal (st) Totalt pris (SEK) Filterpapper 15 8, * Provrör 15 0, * 1247 Provrörskork 15 0, * 642 Scintrör 15 0, * 1080 Spetsar 1 (12,5 ml) 7, (5 ml) 7, (1000 µl) 0, * (20 µl) 1, * 121 Totalt: SEK * : motsvarar 100 analoger, provet med indinavir samt ospecifik och referensbindning 43

46 Kostnad för en genomkörning: = SEK Personal: SEK Baserat på tidigare motivering i avsnitt 2.6 så rekommenderar vi att det bör utföras tre genomkörningar efter optimering slutförts. Vi har beräknat att optimeringen motsvarar två genomkörningar. Detta innebär att priset ovan för en genomkörning måste multipliceras med fem för att få den slutgiltiga kostnaden för bindningsassayen. På detta ska även personalkostnaderna adderas, som ovan redan är redovisade med hänsyn till fem genomkörningar. Slutsumma: x = SEK SEK Totalkostnad för hela projektet I tabell 9 nedan kan en sammanställning av projektets olika kostnader ses. Alla summor är avrundade uppåt. Tabell 9. Översikt av projektets kostnader Typ av kostnad Kostnad (SEK) Inredning Instrument Material Investering Engångsartiklar Kemikalier Personal Avfall Totalt: SEK 44

47 3. Referenser 3.1 Analoger Yurkanis, Bruice, Paula (2006), Essential rganic Chemistry, Person Education International, internationell upplaga Claesson, A, Danielsson, B, Svensson, U (2005), Läkemedelsboken, Apotekarsociteten, 3:e upplagan Danielsson, Bengt, Svensson, Uno (2006), rganisk-kemisk nomenklatur, Apotekarsociteten, 3:e upplagan Clayden, Jonathan, Greeves, ick, Warren, Stuart, Wothers, Peter (2001), rganic Chemistry, xford University Press, tryckt 2009 Anställd på Uppsala universitet, univ.adj. vid institutionen för läkemedelskemi, avdelningen för organiska farmaceutisk kemi. s/drugs/tabid/1168/default.aspx %2F25%2F1997&_sk= &view=c&wchp=dGLzVtzzSkzk&md5=937c8c98ac987c97a443c55a7a9a8487&ie=/sdarticle.pdf %2F25%2F1997&_sk= &view=c&wchp=dGLzVtzzSkzk&ie=%2Fsdarticle.pdf&_valck=1&md5=1f35e684de0d18c0e82c2d54fdf639f2&ie=/sdarti cle.pdf le/ett%20liv%20med%20hiv%201_sv.pdf 45

48 3.2 Bindningsassay C. Foreman, John, J. Gibb, Alasdair, Johansen, Torben (2011), Textbook of Receptor PharmacologyEs S. Furfine, Eric (2000), Identifying and characterizing HIV protease inhibitors Xinying Xie, Wei Huang, Xiaohong Liu, G. Frutos Anthony, Corning Analysis of protein/small molecule interactions using the Corning Epic system Labbhandledning Farmakologi och läkemedelskemi VT 2011 (Receptorbindning förträngningsstudie K3) Anställd på Uppsala Universitet, prof. i biokemi vid Institutionen för biokemi och organisk kemi Anställd på Uppsala Universitet, miljökemist vid Biomedicinska centrum (BMC); BMCintendenturen Anställd på Uppsala Universitet, strålskyddskemist vid Biomedicinska centrum (BMC); BMCintendenturen Apotekarstudent vid Uppsala Universitet Kemist/säkerhetsrådgivare hos Ragn Sells AB Anställd hos LabRum, MSc (HIV-proteas) (kemikalier) (indinavir och radiomärkt ritonavir) 46

49 4. Bilagor 47

50 2011 Analoger Projektet Me-too läkemedel 48