GenPoint omfattar teknologi som utvecklats av och licensierats från PERKIN ELMER/NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. (U.S. Patent nr 5,196,306).

Transkript

1 Dako GenPoint TM Tyramide Signal Amplification System for Biotinylated Probes Kod K ml Begränsad användningslicens GenPoint omfattar teknologi som utvecklats av och licensierats från PERKIN ELMER/NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. (U.S. Patent nr 5,196,306). Denna produkt distribueras och säljs till slutanvändaren enligt licens från PERKIN ELMER/NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. för användning av slutanvändaren vid manuell eller automatisk bearbetning, endast med instrument från Dako vad gäller objektglas eller annat stödmaterial (förutom mikrosystem och biochips) som innehåller cell- eller vävnadsprover för analys av dessa prover under mikroskop (inklusive automatiska avbildnings- och analyssystem) med syfte att detektera målnukleinsyror eller proteiner. Köpet innebär inte rätten att återsälja eller överföra denna produkt, vare sig som ensamstående produkt eller som del av en annan produkt. All annan användning av produkten som inte omnämns i licensen är strängt förbjuden utan skriftligt intyg från PERKIN ELMER/NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. Avsedd användning För in vitro-diagnostik. Dessa instruktioner gäller för GenPoint Tyramide Signal Amplification System for Biotinylated Probes. GenPoint (kod K0620) är ett mycket känsligt signalförstärkningssystem för detektion av biotinylerade prober i vävnads- och cellpreparat. Det är kompatibelt med alla typer av biotinylerade prober och kan användas för att förstärka signalen av DNA- eller RNA-hybridiseringar. Prover och biotinylerade prober måste införskaffas av användaren. GenPoint-metod 1. Hybridisering av biotinylerad prob. 2. Tillämpning av primärt streptavidin-hrp-konjugat. 3. Tillämpning av tyramidsubstrat (förstärkningsreagens). 4. Tillämpning av sekundärt streptavidin-hrp-konjugat. 5. DAB-konvertering. ( ) P04030SE_ 01_K0620/ s. 1/6

2 Sammanfattning och förklaring Ingående reagenser Metoder för hybridisering in situ (ISH) använder märkta prober för att lokalisera specifika nukleinsyresekvenser vid subcellulära nivåer. Biotin används normalt för att märka prober för icke-radioaktiv detektion. 1-6 Biotin kan visualiseras med ett antal detektionsmetoder som använder sig av avidin eller streptavidin, vilka båda har mycket hög bindningsaffinitet för biotin. 7 Normala biotindetektionssystem använder enzymkonjugat av streptavidin för att producera precipiterande färgämnessignaler från kromogena enzymsubstrat. GenPointsystemet tillhandahåller ytterligare en förstärkningsnivå för detektion av biotin. Efter en första bindning av streptavidin-peroxidas till den biotinylerade proben, katalyserar peroxidas oxideringen av biotinyl tyramid, 8 som omedelbart bildar kovalenta bindningar med aromatiska grupper i provet. Denna reaktion deponerar stora mängder biotin vid hybridiseringsplatsen. Det extra biotinet används sedan för att fånga in mer streptavidinperoxidas. Denna förstärkningscykel med streptavidin-peroxidas > biotinyl tyramid > streptavidin-peroxidas kan upprepas för att ytterligare öka ansamlingen av biotin. Signalen utvecklas slutligen genom att tillsätta det kromogena indikator-färgämnet diaminobenzidin (DAB), som oxideras av peroxidasenzymer och bildar ett mörkbrunt precipitat vid hybridiseringsplatsen. Satsens komponenter räcker till att bearbeta 65 objektglas i en enda förstärkningscykel. Kvantitet Beskrivning 30 ml Stringent tvättkoncentrat 0,2 ml Primärt streptavidin-hrp koncentrat 15 ml Primär streptavidin-hrp spädning 10 ml Biotinyl tyramid-lösning 10 ml Sekundär streptavidin-hrp 0,2 ml DAB kromogenkoncentrat 10 ml DAB substratbuffert Material som krävs men inte ingår Biotinylerade prober Hybridizer (S2450 eller S2451, 110V eller 220V) Target Retrieval Solution (kod S1699 eller S1700) Proteinase K (kod S3004 eller S3020) eller Pepsin (kod S3002) TBST Tris-Buffered Saline/Tween-20 (kod S3306) rekommenderas som tvättbuffert för manuell och automatisk färgning 0,3 % H 20 2 i metanol Alkohol-lösningar (95 % och 100 %) Avjoniserat eller destillerat vatten Monteringsmedel, t.ex. Faramount (code S3025) och Glycergel (kod C0563) Xylen eller Histoclear Kontrastfärgning (valfritt); Hematoxylin (kod S3302) rekommenderas Färgningshyllor eller Coplin-behållare Objektglas som silaniserats eller på annat sätt belagts med fästmedel; ISH-kvalificerade Slilanized Slides finns tillgängliga från Dako (kod S3003) Värmeplatta eller ugn Inkubator Ugn Vattenbad Täckglas för hybridisering (18 mm x 18 mm) Täckglas för montering ( ) P04030SE_ 01_K0620/ s. 2/6

3 Absorberande dukar Handskar Fuktkammare för inkubering av objektglas Vanligt ljusmikroskop Försiktighetsåtgärder 1. För professionella användare. 2. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3), en kemikalie som är synnerligen giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan NaN 3, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten vid kassering så att inte metallazider ackumuleras i avloppet. 11,12 3. Undvik mikrobiell kontaminering av reagenser, annars kan ospecifik färgning förekomma. 4. Som med alla produkter som kommer från biologiska källor måste korrekta procedurer användas vid hanteringen. 5. Bär lämplig skyddsklädsel för att undvika kontakt med ögon och hud. 6. Oanvänd lösning bör kasseras enligt lokala och nationella bestämmelser. 7. Ett säkerhetsdatablad finns tillgängligt för professionella användare på begäran. Fara Stringent Wash Concentrate: 1-5% Polyoxyethylene octyl phenyl ether; 1-5% Natriumklorid H318 Orsakar allvarliga ögonskador. P280 Använd ögon- eller ansiktsskydd. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P305 + P351 + VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur P338 + P310 eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller en läkare. Varning Primary Streptavidin-HRP Diluent: 10-30% Glycerol H320 Orsakar ögonirritation. P280 Använd ögon- eller ansiktsskydd. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P305 + P351 + P338 VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. P337 + P313 Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. Varning Biotinyl Tyramide:10-30% Glycerol H320 Orsakar ögonirritation. P280 Använd ögon- eller ansiktsskydd. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P305 + P351 + P338 VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. P337 + P313 Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. Förvaring Reagensberedning Fara DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Kan orsaka cancer. H341 Misstänks kunna orsaka genetiska defekter. P201 Inhämta särskilda instruktioner före användning. P202 Använd inte produkten innan du har läst och förstått säkerhetsanvisningarna. P281 Använd föreskriven personlig skyddsutrustning. P308 + P313 Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarvård. P405 Förvaras inlåst. P501 Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. Reagenser i GenPoint-systemet bör förvaras i mörker vid 2 8 C. Frys ej. Tris-Buffered Saline/Tween (TBST) Späd TBST Concentrate (kod S3306) 1:10 med avjoniserat eller destillerat vatten. Den utspädda lösningen håller sig stabil i en månad vid 2 8 C. Kassera bu ffert om denna är grumlig. Stringent tvättlösning Späd stringent tvättlösning 1:50 med avjoniserat eller destillerat vatten och värm till lämplig temperatur i värmebad. Kassera oanvänd, utspädd lösning. ( ) P04030SE_ 01_K0620/ s. 3/6

4 Primär streptavidin-hrp lösning Späd primär streptavidin-hrp koncentrat 1:100 med ingående primär streptavidin-hrp spädning 30 minuter före användning. Kassera oanvänd, utspädd lösning. DAB kromogen Späd DAB kromogenkoncentrat 1:50 med ingående DAB substratbuffert. Den utspädda substratbuffertlösningen är stabil i en dag vid rumstemperatur eller högst fem dagar vid 2 8 C. Procedur ISH-metod Deparaffinering Alla paraffininbäddade prover måste avparaffineras för att avlägsna inbäddningsmedlet och sedan rehydreras före hybridisering in situ och färgning. Undvik ofullständigt avlägsnande av paraffin, eftersom kvarvarande paraffin orsakar ospecifik färgning. Avparaffinering kan utföras genom att först värma vävnadssnitten vid 60 C i en ugn i 30 minuter för att göra paraffinet mjukt och sedan sänka ned objektglasen i två omgångar xylen eller Histoclear i fem minuter per omgång. Kvarvarande xylen eller Histoclear kan sedan avlägsnas genom att sänka ned objektglasen i två omgångar 100 % alkohol, följt av tre omgångar 95 % alkohol, i en minut per omgång. Objektglasen rehydreras sedan med flera omgångar vatten. Förbehandling av prover Cell- och vävnadsprover förberedda med korslänkande fixeringsmedel som formalin kräver förbehandling för att ge hybridiseringsproben åtkomst till målnukleinsyresekvenser. Förbehandling på provet kan utföras med en av följande metoder: 1. Förbehandling för målåtervinning: Sänk ned objektglasen i uppvärmd Target Retrieval Solution (kod S1700) i minuter vid 97 C (±2 C) följt av 20 minut er nedkylning i lösningen. Skölj objektglasen flera gånger med destillerat vatten för att avlägsna Target Retrieval Solution. 2. Förbehandling med pepsin: Sänk ned objektglasen i 0,4 % 0,8 % Pepsin (kod S3002, lös upp paketet i ml 0,2 N saltsyra) vid 37 C i 1 10 minuter. Skölj sedan objektglasen flera gånger med destillerat vatten för att avlägsna kvarvarande pepsin. 3. Förbehandling med målåtervinning och pepsin: Behandla objektglasen med Target Retrieval Solution enligt anvisningarna ovan följt av mild pepsinbehandling. Allmänt sett räcker förbehandling med 0,005 % 0,01 % pepsin i 0,2 N saltsyra i minuter vid rumstemperatur. 4. Förbehandling med Proteinase K: Behandla objektglasen med Proteinase K, RTU (kod S3020) i minuter vid rumstemperatur. Skölj objektglasen flera gånger med destillerat vatten för att avlägsna kvarvarande Proteinase K. Bästa förhållanden för förbehandling, vare sig med Target Retrieval, proteasdigestion eller en kombination av båda, måste fastställas för varje typ av prov. För många prover räcker förbehandling med antingen Target Retrieval eller proteolytisk digestion. Allmänt sett kräver cytologiska prover mindre aggressiv behandling än vävnad. Prover som förberetts med icke-korslänkande fixeringsmedel som aceton kräver vanligtvis ingen förbehandling. Om förbehandling krävs, skall denna vara mild eftersom sådana prover lätt kan skadas. För förbehandling av vätskebaserade cytologiprover rekommenderas följande procedur: Objektglasen genomdränks med 50 % alkohol i 30 minuter följt av postfixering i 10 % neutralbuffrat formalin i 30 minuter. Skölj objektglasen i flera byten med avjoniserat vatten och inkubera med Proteolytic Enzyme (kod S3007) vid rumstemperatur i 3 minuter. Efter digestion skall vävnadssnitten sköljas i flera byten med avjoniserat vatten och därefter nedsänkas i 0,3 % H 2O 2 i metanol i 5 minuter, och sköljas i flera byten med avjoniserat vatten. För bakgrundsreduktion kan objektglasen inkuberas med Biotin Blocking System (kod X590). Applicera Avidin Block i 10 minuter, följt av Biotin Block i 10 minuter (skölj i flera byten med avjoniserat vatten före och efter varje steg). Objektglasen skall hållas fuktiga före probapplicering. Rekommendationer för hybridisering och stringenstvätt inkluderas i probspecifikationerna. Följ instruktionerna nedan för detektion med följande undantag; späd Primär streptavidin-hrp 1:100 1:300 för en minuters inkubation. Bakgrundshämmande Detta steg är användbart för att reducera bakgrunden i vissa vävnader genom att förstöra endogen streptavidinbindande aktivitet och undertrycka all peroxidasaktivitet som förekommer i provet. En typisk metod innefattar exponering av objektglaset till 0,3 % H 2O 2 i metanol vid rumstemperatur i minst 20 minuter. Detta bör följas av tvätt i destillerat vatten i 10 minuter. Hybridisering och stringent tvätt Optimala temperaturer för hybridisering och stringent tvätt för Dako biotinylerade prober anges i instruktionerna som medföljer varje prob. Optimala temperaturer för hybridisering och stringent tvätt måste fastställas för användarens egna prober. Som allmän regel är den optimala temperaturen för hybridisering 25 C under beräknad T M (den hybridiserade probens smälttemperatur) och temperaturen för stringent tvätt är mellan C under beräknad T M. Formler för beräkning av T M finns i Current Protocols in Molecular Biology. 10 För enkelsträngade prober och mrna-mål finns det mindre anledning att denaturera materialet före hybridisering. Denaturering krävs för dubbelsträngade prober och/eller DNA-mål. Denaturering av målets och/eller probens DNA uppnås normalt genom att värma proben och/eller objektglasen vid 90 C till 95 C i 5 minuter på en värmeplatta. ( ) P04030SE_ 01_K0620/ s. 4/6

5 Färgningsmetod Obs! Protokoll för användning med instrument från Dako kan skaffas från Dako:s tekniska support. STEG 1 PRIMÄR STREPTAVIDIN-HRP Det Primära streptavidin-hrp koncentratet bör spädas 1:100 i ingående Primär streptavidin-hrp spädning före användning. Förbered cirka 150 µl primär streptavidin-hrp lösning per objektglas. Efter stringent tvätt skall objektglasen sköljas flera gånger i TBST-tvättbuffert. Knacka av kvarvarande TBST-tvättbuffert och torka försiktigt runt provet för att avlägsna all vätska. Tillsätt 3 4 droppar utspädd Primär streptavidin-hrp lösning så att det täcker provet och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Skölj objektglasen i TBST tvättbuffert och placera i tre nya bad med TBST tvättbuffert i 5 minuter var för att avlägsna kvarvarande primär streptavidin-hrp lösning. STEG 2 STEG 3 STEG 4 STEG 5 STEG 6 BIOTINYLTYRAMID (FÖRSTÄRKNINGSREAGENS) Knacka av kvarvarande TBST-tvättbuffert och torka försiktigt runt provet för att avlägsna all vätska. Tillsätt 3 4 droppar biotinyl tyramid för att täcka provet och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Skölj objektglasen i TBST tvättbuffert och placera i tre nya bad med TBST tvättbuffert i 5 minuter var för att avlägsna kvarvarande biotinyl tyramid-lösning. SEKUNDÄR STREPTAVIDIN-HRP Knacka av kvarvarande TBST-tvättbuffert och torka försiktigt runt provet för att avlägsna all vätska. Tillsätt 3 4 droppar sekundär streptavidin-hrp lösning så att det täcker provet och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Skölj objektglasen i TBST tvättbuffert och placera i tre nya bad med TBST tvättbuffert i 5 minuter var för att avlägsna kvarvarande sekundär streptavidin-hrp lösning. KROMOGENREAKTION Späd DAB kromogenkoncentrat 1:50 med DAB substratbuffert precis före användning. Förbered cirka 150 µl kromogen per objektglas. Knacka av kvarvarande TBST-tvättbuffert och torka försiktigt runt provet för att avlägsna all vätska. Tillsätt 3 4 droppar utspädd DAB kromogen för att täcka provet och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter. Stoppa kromogenreaktionen genom att sänka ned objektglasen i vatten i 1 minut. Skölj noggrant med flera omgångar vatten för att avlägsna kvarvarande DAB. KONTRASTFÄRGNING Hematoxylin (kod S3302) bildar en blå nukleär kontrastfärgning som syns tydligt mot de bruna DAB-signalerna och är permanent i antingen vattenbaserat eller organiskt monteringsmedel. Sänk ned objektglasen i ett bad med hematoxylin. Inkuberingstiden beror på styrkan av hematoxylinet som används. Om Hematoxylin används (kod S3302), brukar en inkuberingstid på 1 4 minuter räcka. Skölj objektglasen i TBST och sedan flera gånger i vatten före montering. MONTERING Täck proverna med täckglas med antingen vattenbaserat eller permanent monteringsmedel. Som vattenbaserat monteringsmedel rekommenderas Glycergel (kod C0563). Kvalitetskontroll Skillnader i vävnadsbearbetning och tekniska metoder i användarens laboratorium kan ge en markant skillnad i resultaten, vilket gör det nödvändigt att utföra regelbundna interna kontroller. Om färgningsmetoden utförs med lämpliga kontroller visas det hur reagenser och tekniska procedurer bör fungera. Positiv kontrollvävnad och/eller positiv kontrollprob Kända positiva kontrollvävnader för testproben och/eller kända positiva kontrollprober för proven bör användas för att övervaka korrekt funktion av bearbetad vävnad, testprober och reagenser. Positive Control (Human DNA) Biotinylated DNA Probe (kod X1414) kan användas för att påvisa genomisk DNA i cellkärnor. Specificiteten av detektionsreagenser kan demonstreras genom att utföra hybridiseringsmetoden utan prob; närvaro av bakgrund med denna kontroll indikerar ospecifik bindning av detektionsreagenser. Detta problem kan förekomma om snitten tillåts torka under detektion. Negativ kontrollprob Använd en negativ kontrollprob istället för en testprob med ett snitt från varje prov för att utvärdera ospecifik färgning samt specificitet för hybridiseringsreaktion med testproben. För att fastställa specificitet för hybridiseringsreaktionen kan en prob märkt icke-hybridiserande användas som negativ kontroll, dvs Negative Control (Plasmid DNA) Biotinylated DNA Probe (kod X1415). Tolkning av färgningsresultat Positiva kontrollprover bör undersökas först för att fastställa att alla reagenser fungerar ordentligt. Positiva signaler som motsvarar hybridiseringsområden visas som bruna eller svarta områden inuti individuella celler. Frånvaro av specifik färgning i negativa kontrollprover bekräftar testprobens specificitet. Om ospecifik färgning förekommer, har det ett prickliknande eller diffust utseende. GenPoint TM -systemets höga känslighet beror på den höga förstärkningsnivån; all ospecifik bakgrundsfärgning kommer också att förstärkas. Därför rekommenderas användning av negativa kontrollprober på prover för att underlätta tolkning av färgningsresultat. ( ) P04030SE_ 01_K0620/ s. 5/6

6 Begränsningar Negativa resultat kan orsakas av felaktiga inkuberingstemperaturer och -tider, felaktig spädning av reagenser, samt mindre än optimala förhållanden för fixering eller förbehandling. Lämpliga förhållanden för fixering och förbehandling måste fastställas av användaren för varje typ av prov. Detektionssystemets höga känslighet möjliggör detektion av lågkopiegener och lågförekommande mrna-mål. Detektion av enstaka kopiegener eller mycket lågförekommande mrna-mål med detektionssystemet beror på hur väl testproberna är märkta (dvs densiteten av biotinmärkningen per prob) och även storleken av proberna och målen. Endogen peroxidas- eller pseudoperoxidasaktivitet kan förekomma i hemoproteiner som hemoglobin, myoglobin, cytokrom, och katalas, samt hos vissa leukocyter. 7 Denna aktivitet kan elimineras genom att inkubera prover med 3 % väteperoxid i 5 minuter vid rumstemperatur (Steg 1 i färgningsmetoden) innan proben tillämpas. Vävnad som innehåller hepatit B ytantigen (HbsAg) kan uppvisa ospecifik färgning med horseradishperoxidase (HRP). 13 Felsökning Problem Möjlig orsak Föreslagen lösning 1. Ingen signal. 1a. Sekvenser med lågkopiemål eller låg hybridiseringseffektivitet. 1b. Mindre än optimal behandling. 1a. Öka probkoncentrationen. Öka hybridiseringstiden. Öka antalet förstärkningscykler. 1b. Titrera fixerings- och/eller förbehandlingstider. 2. Hög bakgrund. 2a. Överutveckling av signal. 2b. Endogen peroxidasaktivitet. 2a. Öka spädning av Primär streptavidin- HRP. Minska utvecklingstiden för DAB. 2b. Utför peroxidundertryckning. OBSERVERA: Om problemet inte kan tillskrivas någon av orsakerna ovan, eller om den föreslagna lösningen inte avhjälper problemet, kontakta Dakos tekniska support för mer hjälp. Referenser 1. Al-Hakim AH and Hull R. Chemically synthesized non-radioactive biotinylated long-chain nucleic acid hybridization probes. Biochem J 1988; 251: Saffran WA, et al. Preparation and characterization of biotinylated psoralen. Nuc Acids Res 1988; 16: Levenson C, et al. Biotinylated psoralen derivative for labeling nucleic acid hybridization probes. Methods Enzymol 1990; 184: Nelson PS, et al. Oligonucleotide labeling methods 3. Direct labeling of oligonucleotides employing a novel, non-nucleosidic, 2-aminobutyl-1,3-propanediol backbone. Nuc Acids Res 1992; 20: Gebeyeju G, et al. Novel biotinylated nucleotide analogs for labeling and colorimetric detection of DNA. Nuc Acids Res 1987; 15: Langer PR, et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: Novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: Green NM. Avidin. Adv Prot Chem 1975; 9:85 8. Bobrow M, et al. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to immunoassays. J Immunol Meth 1989; 125: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of laboratory workers from infectious diseases transmitted by blood, body fluids, and tissue. (Tentative guideline; Second Edition) Villanova, PA Order code M29-T2 10. Preparation and analysis of DNA. In: Ausubel FM (eds.). Current Protocols in Mol Biol. New York: John Wiley & Sons, Inc., 1999: Chapter Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Centers for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, Omata M, Liew C-T, Ashcaval M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 Edition 07/15 ( ) P04030SE_ 01_K0620/ s. 6/6