TOP2A IQFISH pharmdx. Kod K5733. Tredje utgåvan. För diagnostisk användning in vitro Kitet innehåller reagens som räcker till 20 tester.

Transkript

1 / TOP2A IQFISH pharmdx Kod K5733 Tredje utgåvan För diagnostisk användning in vitro Kitet innehåller reagens som räcker till 20 tester. P04092SE_02/K p. 1/37

2 Innehållsförteckning Avsedd användning... 3 Sammanfattning och förklaring... 3 Procedurprincip... 4 Reagenser... 4 Medföljande material... 4 Material som behövs men inte ingår... 5 Försiktighetsåtgärder... 6 Förvaring... 8 Provberedning... 9 Paraffininbäddade snitt... 9 BRUKSANVISNING A. Reagensberedning A.1 Pre-Treatment Solution A.2 Stringent Wash Buffer A.3 Wash Buffer A.4 Etanolserier A.5 Pepsinlösning B. Färgningsprocedur B.1 Proceduranteckningar B.2 Behandling av vävnader före färgning B.3 Färgningsprotokoll Kvalitetskontroll Tolkning av färgningen Begränsningar Allmänna begränsningar Prestandaegenskaper Analytisk sensitivitet Analytisk specificitet Härdighetsstudier Repeterbarhet Reproducerbarhet Klinisk användbarhet Pilotstudie Bekräftande studie - DBCG 89D/TOP2A Studieutformning Statistisk metodologi Resultat Diskussion och slutsats Felsökning Bilaga Bilaga Bilaga Referenser Symbolförklaringar Sida P04092SE_02/K p. 2/37

3 Avsedd användning För diagnostisk användning in vitro. TOP2A IQFISH pharmdx är avsett för att detektera amplifikationer och deletioner (ändringar av antalet kopior) av TOP2A -genen med användning av fluorescerande in situ-hybridiseringsteknik (FISH) på formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadsprover av human bröstcancer. Deletioner och amplifikationer TOP2A-genen tjänar som en markör för dålig prognos hos bröstcancerpatienter i högriskzonen. TOP2A genamplifikation, som detekteras av TOP2A IQFISH pharmdx-analysen indikeras vidare som ett hjälpmedel för att förutsäga recidivfri överlevnad hos bröstcancerpatienter i högriskzonen, som behandlas med understödjande epirubicinbaserad kemoterapi. Resultat fråntop2a IQFISH pharmdx-analysen är avsedda för användning som ett komplement till existerande klinisk och patologisk information. Sammanfattning och förklaring TOP2A-genen kodar för enzymet topoisomeras IIα (topo IIα), som katalyserar sönderbrytningen och återföreningen av dubbelsträngigt DNA, vilket leder till relaxation av DNA-superspiraler. Topoisomeraser av typ II är nödvändiga enzymer som interkonverterar topologiska former av DNA genom att göra dubbelsträngiga brott i DNAryggraden (1). Dessa enzymer spelar en viktig roll vid flera olika fundamentala nukleära processer (2), inklusive DNA-replikation, transkription, kromosomstruktur, kondensation och segregation (3). Topoisomeras IIα-genen, TOP2A, är närvarande i 2 kopior i alla normala diploida celler och lokaliseras till kromosom 17q21 (4). TOP2A-genen omfattar ett område på ca 27,5 kb och innehåller 35 exoner som kodar ett 170 kda-protein (5). Topo IIα-proteinet har känts igen som en proliferationsmarkör, och expressionen av topo IIα varierar under cellcykeln, både i normala celler och i cancerceller (6). Expressionen av topo IIα i brösttumörer korrelerar med Ki-67-expression (7-10). Inget enkelt förhållande har påträffats för topo IIα vid protein- och gennivån (7, 9, 10). Endast 20 % av överuttryckta fall av topo IIα-proteinet har TOP2A-genamplifikation men bland TOP2Agenamplifierade fallen hade 93 % överexpression av topo IIα-protein (11). Överexpression av topo IIα verkar bestå av flera bidragande faktorer, både den cancerspecifika amplifikationen och den förhöjda cellproliferationsfrekvensen. Ki-67- och topo IIα-proteinerna uttrycks parallellt, vilket kan tolkas som en bekräftelse av inflytandet av cellproliferationsfrekvensen på topo IIα-expression, även i fall med TOP2A-amplifikation (12). Topoisomeraser av typ II är mål för antracykliner såsom doxorubicin och epirubicin, som även kallas topoisomerashämmare (13-15). HER2-status som en prediktiv markör för antracykliner är en kontroversiell fråga och det har påpekats att den biologiska grunden för denna länk saknas. Vidare har det diskuterats om HER2 snarare måste ses som en surrogatmarkör eller pseudomarkör för det verkliga antracyklinmålet, topoisomeras II (16-18). Kopieantalet hos TOP2A har visat sig påverka tumörens känslighet för topoisomerashämmare (16-28). Den kliniska prestandan hos Dako TOP2AFISH pharmdx kit har undersökts i två studier, som utförts av Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) i Köpenhamn (21, 29, 30). Den senaste studien (21, 30) rapporterar TOP2A-genamplifikation i ca 10 % av bröstcancrar och deletioner med samma frekvens när både de HER2-positiva och -negativa tumörerna innefattas i studierna. Initialt antog man att onormala TOP2A-genkopienummer, som ett resultat av amplifikation eller deletion, begränsades till HER2-amplifierade tumörer (16, 31). På senare tid har kopienummerändringar hos TOP2A-genen detekterats i tumörprover med normal HER2- genstatus (21, 23, 29, 30, 32, 33). P04092SE_02/K p. 3/37

4 I DBCG-studien påträffas TOP2A-förändringar i nästan 60 % av HER2-amplifierade primära brösttumörer, medan 20 % av onormala TOP2A-tumörer har normal HER2-status (21, 23, 29, 30, 32). Studien har bekräftats av en kanadensisk studie som visar att TOP2A-genstatus (amplifikation eller deletion) är en signifikant prediktiv faktor för att dra fördel av behandling med epirubicinbaserad kemoterapi (23). Ca 35 % av patienterna i denna studie hade HER2 -amplifierade tumörer, och en statistiskt signifikant associering med HER2 -status och HER2 - avvikelser påträffades (23, 34). Huvuddelen av studierna av TOP2A-genavvikelser har varit konsekventa med hänsyn till det prediktiva värdet av TOP2A-testning (21-25, 30)(21 25, 30), som står i kontrast till de mer motstridande resultaten med TOP2A-testning (35). Även om HER2- och TOP2Agenerna är belägna i samma amplikon och vissa studier har fokuserat på samamplifikation av generna (22, 24, 25), har DBCG 89D och andra studier visat att generna ska granskas oberoende och testas separat (10, 20, 21, 26-30). Procedurprincip TOP2A IQFISH pharmdx innehåller alla viktiga reagenser som behövs för att fullborda en FISH-procedur för rutinmässigt bearbetade, formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt. Efter avparaffinering och rehydrering, värms prover upp i Pre-Treatment Solution följt av proteolytisk nedbrytning med pepsin. Efter upphettning och de proteolytiska förbehandlingsstegen, utnyttjar detta kit en icke toxisk, bruksfärdig FISH-probmix, baserad på en kombination av PNA (peptidnukleinsyra) (36) och DNA-teknik. Denna Probe Mix består av en blandning av Texas Red-märkta DNA-kosmidkloner som täcker totalt 228 kb av TOP2Aamplikonen, och en blandning av fluoresceinmärkta PNA-prober, riktade mot den centromeriska regionen i kromosom 17. Den specifika hybridiseringen till de två målen resulterar i bildande av en distinkt röd fluorescerande signal vid varje TOP2A-amplikon och en distinkt grön fluorescerande signal vid varje centromerisk region i kromosom 17. Efter en stringenttvätt monteras proverna med Fluorescence Mounting Medium innehållande DAPI och förses med täckglas. Resultaten tolkas med ett fluorescensmikroskop utrustat med lämpliga filter (se Bilaga 3). Cancerceller lokaliseras och utvärderas sedan med hänsyn till TOP2A/CEN- 17-signalförhållande. Normala celler i det analyserade vävnadssnittet tjänar som en intern positiv kontroll av förbehandling och hybridisering. Ytterligare information finns i avsnittet Tolkning av färgningen. TOP2A IQFISH pharmdx, kod K5733, är tillämpligt för manuell färgning. Reagenser Medföljande material Det material som anges nedan räcker till 20 tester (ett test definieras som ett 22 mm x 22 mm målområde). Antalet tester är baserat på användningen av 250 µl per objektglas av flaska 2 (5 8 droppar), 10 µl per objektglas av flaska 3 och 15 µl per objektglas av flaska 5. Lösningarna i flaska 3 och flaska 5 är viskösa och kan behöva centrifugeras kortvarigt i en mikrocentrifug för att man ska kunna samla upp allt medföljande reagens. Kitet ger tillräckligt med material för 10 enskilda färgningskörningar (fyra separata körningar, vid användning av pepsinnedsänkningsmetoden). TOP2A IQFISH pharmdx transporteras på kolsyreis. För att garantera att kitets komponenter inte har utsatts för hög temperatur under transporten bör kolsyreisen fortfarande finnas kvar vid leveransen. Observera att vissa kitkomponenter kan fortsätta vara ofrysta. Detta påverkar inte prestandan hos TOP2A IQFISH pharmdx. Flaska 1 Förbehandlingslösning (20x) 150 ml, koncentrerad 20x MES (2-[N-morfolino]etansulfonsyra) buffert. P04092SE_02/K p. 4/37

5 Flaska 2A Flaska 2B Flaska 3 Flaska 4 Flaska 5 Flaska 6 Pepsin 4 x 6,0 ml, bruksfärdigt Pepsinlösning, ph 2,0, innehåller stabiliseringsmedel och ett antimikrobiellt medel. Pepsin-spädningsmedel (10x) 24 ml, koncentrerad 10x Spädningsmedelbuffert, ph 2,0, innehåller stabiliseringsmedel och ett antimikrobiellt medel. TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix 0,2 ml, bruksfärdig Blandning av Texas Red-märkta TOP2A DNA-prober och fluoresceinmärkta CEN-17 PNA-prober, tillhandahålls i IQISH-hybridiseringsbuffert Stringenttvättbuffert (20x) 150 ml, koncentrerad 20x SSC- (saltlösning-natriumcitrat) buffert med tvättmedel (Tween-20). Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml, bruksfärdig Fluorescerande monteringsmedium med 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-fenylindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, koncentrerad 20x Tris/HCl-buffert. Coverslip Sealant 1 rör, bruksfärdigt Lösning för borttagbar försegling av täckglas. OBS! Följande kitreagenser: Pre-Treatment Solution (20x), Pepsin, Pepsin Diluent (10x), Stringent Wash Buffer (20x), Fluorescence Mounting Medium, Wash Buffer (20x) och motsvarande Coverslip Sealant, kan bytas mot motsvarande reagenser i Dako Histology FISHtillbehörskitet, kod K5799. Material som behövs men inte ingår Laboratoriereagenser Destillerat eller avjoniserat vatten Etanol, 96 % Xylen eller xylensubstitut Laboratorieutrustning Absorberande pappersdukar Justerbara pipetter P04092SE_02/K p. 5/37

6 Kalibrerad partiell immersionstermometer (område C) Kalibrerad yttermometer (område C) Täckglas (22 mm x 22 mm) Dako Hybridizer (kod S2450/S2451)* Värmeblock eller hybridiseringsugn* Fuktig hybridiseringskammare* Pincett Dragskåp Mikrocentrifug-objektglas, Dako Silanized Slides, kod S3003, eller poly-l-lysin-belagda objektglas (se Provpreparation) Färgningskyvetter eller -bad Timer (med 2 15 minuters intervaller) Vortexblandare Vattenbad med lock (som kan hålla 37 (±2) C, 63 (±2) C och från 95 C till 99 C) Mikrovågsugn med avkänningskapacitet om förbehandling utförs med mikrovågsugn (se B3. Färgningsprotokoll. Steg 1: Förbehandling, metod B) * Värmeblock eller hybridiseringsugn för denaturering (66 (±1) C) och hybridisering (45 (±2) C) tillsammans med en fukthybridiseringskammare kan användas. Mikroskoputrustning med tillbehör Filter för fluorescensmikroskop: DAPI och FITC/Texas Red dubbelfilter, eller FITC och Texas Red monofilter - se Bilaga 3 för ytterligare information. Fluorescensmikroskop med 100 watt kvicksilverlampa som ljuskälla bör användas. Inga andra ljuskällor rekommenderas med dessa filter. Mikroskopglasfolder (kartongbricka med gångjärnsförsett lock och plats för 20 objektglas eller liknande). Försiktighetsåtgärder 1. För diagnostisk användning in vitro. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. Flaska 1, förbehandlingslösning (20x), kräver inte etiketter angående risker/faror. Datablad för säkerhet (SDS) kan beställas för yrkesanvändare. 4. Flaska 2A, pepsin, innehåller 5 < 10 % propan-2-ol, 0,1 < 0,3 % pepsin A och 0,011 < 0,1 % 5-klor-2-metyl-4-isotiazolin-3-on och 2-metyl-2H-isotiazol-3-on. Flaska 2a är märkt: Fara H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. Kan orsaka allergisk hudreaktion. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. VID INANDNING: Flytta personen till frisk luft och se till att andningen underlättas. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller en läkare. VID FÖRTÄRING: Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. Framkalla INTE kräkning. VID HUDKONTAKT (eller hårkontakt): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten eller duscha. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller en läkare. P04092SE_02/K p. 6/37

7 P305 + P310 VID KONTAKT MED ÖGON: Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. P405 Förvaras inlåst. P501 Kassera innehåll/behållare i enlighet med alla lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 5. Flaska 2B, Pepsinspädning (10x) innehåller 50 < 75 % propan-2-ol, och 5 < 10 % 2- amino-2-(hydroximetyl) propan-1,3-diol hydroklorid. Flaska 2B är märkt: Fara H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P533 P235 P501 Mycket brandfarlig vätska och ånga. Orsakar allvarlig ögonirritation. Kan göra att man blir dåsig eller omtöcknad. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Får inte utsättas för värme, heta ytor, gnistor, öppen låga eller andra antändningskällor. Rökning förbjuden. Använd explosionssäker elektrisk utrustning, ventilationsutrustning, belysningsutrustning och materialhanteringsutrustning. VID INANDNING: Flytta personen till frisk luft och se till att andningen underlättas. VID HUDKONTAKT (eller hårkontakt): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten eller duscha. Förvaras svalt. Kassera innehåll/behållare i enlighet med alla lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 6. Flaska 3, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, innehåller 10 < 25 % etylenkarbonat och 3 < 5 % natriumklorid. Flaska 3 är märkt: Varning H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj noggrant med vatten i flera minuter. Ta ut kontaktlinser om du har sådana och om det är enkelt att göra det. Fortsätt att skölja. 7. Flaska 4, Stringent tvättbuffert (20x) innehåller 10 < 25 % natriumklorid och 10 < 20 % 2-amino-2-(hydroximetyl) propan-1,3-diolhydroklorid. Flaska 4 är märkt: Varning H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Orsakar allvarlig ögonirritation. Orsakar hudirritation. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Tvätta händerna grundligt efter användning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj noggrant med vatten i flera minuter. Ta ut kontaktlinser om du har sådana och om det är enkelt att göra det. Fortsätt att skölja. 8. Flaska 6, Tvättbuffert (20x) innehåller 10 < 25 % natriumklorid och 10 < 20 % trometamol. Flaska 6 är märkt: Varning P04092SE_02/K p. 7/37

8 H319 Orsakar allvarlig ögonirritation. H315 Orsakar hudirritation. P280 Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P305 + P351 + P338 VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj noggrant med vatten i flera minuter. Ta ut kontaktlinser om du har sådana och om det är enkelt att göra det. Fortsätt att skölja. 9. Coverslip Sealant innehåller 100 % nafta (petroleum), lätt hydrobehandlad, och är märkt: Fara H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Mycket brandfarlig vätska och ånga. Kan vara dödligt vid förtäring om det kommer ner i luftvägarna. Giftigt för vattenlevande organismer med långtidseffekter. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Får inte utsättas för värme, heta ytor, gnistor, öppen låga eller andra antändningskällor. Rökning förbjuden. Använd explosionssäker elektrisk utrustning, ventilationsutrustning, belysningsutrustning och materialhanteringsutrustning. Undvik utsläpp till miljön. VID FÖRTÄRING: Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. Framkalla INTE kräkning. VID HUDKONTAKT (eller hårkontakt): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten eller duscha. Förvaras svalt. Kassera innehåll/behållare i enlighet med alla lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 10. Prover, före och efter fixering och alla substanser utsatta för dem ska hanteras som om de kan överföra infektion och de ska undanskaffas med korrekt försiktighetsåtgärder (37). Pipettera aldrig reagens med munnen och undvik att kontakta hud och slemhinnor med reagens och prover. Om reagens kommer i kontakt med känsliga områden ska du tvätta med stora mängder vatten. 11. Minimera mikrobiell kontaminering av reagenset för att undvika felaktig färgning. 12. Andra inkubationstider och temperaturer eller metoder än de som specificeras kan ge felaktiga resultat. 13. Vävnadsfixeringsmetoder och provtjocklekar som är annorlunda än de specificerade kan påverka vävnadsmorfologi och/eller signalintensitet. 14. Undvik avdunstning av TOP2A/CEN-17 IQISH Probe mix under hybridisering genom att tillförsäkra tillräcklig fuktighet i hybridiseringskammaren. 15. Reagens har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan leda till sämre funktion. 16. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. Ytterligare information finns i säkerhetsdatabladet (SDS). 17. Endast rena färgningsskålar ska användas för pepsinnedsänkningsmetoden (steg 2, metod C). Förvaring Förvara TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix (flaska 3) vid -18 C i mörker. Alla andra reagenser kan förvaras vid 2 8 C i mörker. Alla reagenser kan frysas. Frysning och upptining av reagenserna upp till 10 gånger påverkar inte resultatet. Det bruksfärdiga pepsinet, TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix, och Fluorescence Mounting Medium (flaska 2A, 3 och 5) kan påverkas negativt om de utsätts för värme. Lämna inte dessa komponenter i rumstemperatur. P04092SE_02/K p. 8/37

9 TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix och Fluorescence Mounting Medium (flaska 3 och 5) kan påverkas negativt om de utsätts för alltför höga ljusnivåer. Förvara inte dessa komponenter och utför inte analysen i starkt ljus som t.ex. direkt solljus. Använd inte satsen efter det utgångsdatum som är tryckt på satsens kartong. Om reagenserna förvaras under andra förhållanden än de som specificerats i detta produktblad måste användaren validera reagensresultaten (38). Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet hos denna produkt. Därför är det viktigt att utvärdera normala celler i det analyserade vävnadssnittet. Kontakta omedelbart Dakos tekniska service om ett oväntat fluorescensmönster observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och något problem med TOP2A IQFISH pharmdx misstänks. Provberedning Biopsiprover måste hanteras så att vävnaden bevaras för FISH-analys. Standardmetoder för vävnadsbehandling för immuncytokemisk färgning ska användas för alla prover (39). Paraffininbäddade snitt Endast vävnad som bevarats i neutralbuffrat formalin och är paraffininbäddad är lämplig för användning. Biopsiprover ska t.ex. skäras till en tjocklek på 3 eller 4 mm och fixeras i timmar i neutralbuffrat formalin. Vävnaderna bör sedan dehydreras i en graderad serie av etanol och xylen, följt av infiltrering av smält paraffin, som hålles vid högst 60 C. Korrekt fixerade och inbäddade vävnader har en obegränsad hållbarhet före snittning och montering på objektglas om de förvaras svalt (15 25 C) (39, 40). Andra fixativ är inte lämpliga. Vävnadsprover ska snittas i 4 6 µm tjocka snitt. Objektglasen som krävs för TOP2A-genavvikelsesanalys och för att bekräfta närvaro av tumör ska framställas samtidigt. Minst 3 seriella snitt rekommenderas, 1 snitt för tumörnärvaro färgat med hematoxylin och eosin (H&E-färgning) och 1 snitt för TOP2A-genavvikelsesanalys och 1 snitt i reserv. Vi rekommenderar att vävnadssnitt monteras på Dako Silanized Slides, kod S3003, SuperFrost Plus eller poly-l-lysinobjektglas. Prover ska analyseras inom 4 6 månader efter snittning om de förvaras i rumstemperatur (20 25 C) eller 2 år när de förvaras vid 2 8 C. P04092SE_02/K p. 9/37

10 BRUKSANVISNING A. Reagensberedning Följande reagenser bereds lämpligen före färgning: A.1 Pre-Treatment Solution Kristaller kan förekomma i flaska 1, men löses upp vid rumstemperatur. Kontrollera att inga kristaller finns innan reagenset prepareras. Späd en tillräcklig mängd av innehållet i flaska 1 (Pre-Treatment Solution 20x) 1:20 med destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd spädd buffert kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera bufferten om den ser grumlig ut. A.2 Stringent Wash Buffer Späd en tillräcklig mängd av innehållet i flaska 4 (Wash Buffer 20x) 1:20 med destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd spädd buffert kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera bufferten om den ser grumlig ut. A.3 Wash Buffer Späd en tillräcklig mängd av innehållet i flaska 6 (Wash Buffer 20x) 1:20 med destillerat eller avjoniserat vatten. Oanvänd spädd buffert kan förvaras vid 2 8 C i en månad. Kassera den utspädda bufferten om den är grumlig. A.4 Etanolserier Preparera tre burkar med 70 %, 85 % respektive 96 % etanol från 96 % etanollösning. Förvara täckta burkar vid rumstemperatur eller vid 2 8 C och använd lösningarna för högst 200 objektglas. Kassera om lösningarna verkar grumliga. A.5 Pepsinlösning En pepsinlösning behövs endast när pepsinnedsänkningsmetoden (metod C) används. Preparera pepsinlösning enligt följande: För en behållare för sex objektglas ska 60 ml pepsinlösning prepareras: Tillsätt 48 ml rumstempererat (20 25 C) eller avjoniserat vatten till behållaren. Tillsätt 6 ml kallt (2 8 C) Pepsinspädningsmedel (10x) (flaska 2B) till behållaren. Tillsätt 6 ml kallt (2 8 C) Pepsin (flaska 2A) till behållaren. Sätt lock på behållaren och låt pepsinlösningen anta jämvikt till 37 (±2) C i ett vattenbad. För en behållare för 24 objektglas ska 240 ml pepsinlösning prepareras: Tillsätt 192 ml rumstempererat (20 25 C) eller avjoniserat vatten till behållaren. Tillsätt 24 ml kallt (2 8 C) Pepsinspädningsmedel (10x) (flaska 2B) till behållaren. Tillsätt 24 ml kallt (2 8 C) bruksfärdigt pepsin (flaska 2A) till behållaren. Sätt lock på behållaren och låt pepsinlösningen anta jämvikt till 37 (±2) C i ett vattenbad. Pepsinlösning som antagit rumstemperatur bör användas inom 5 timmar. P04092SE_02/K p. 10/37

11 B. Färgningsprocedur B.1 Proceduranteckningar Användaren bör läsa dessa anvisningar noggrant och bekanta sig med alla komponenter innan de används (se Försiktighetsåtgärder). Alla reagenser bör anta jämvikt vid relevant temperatur före användning enligt följande: Flaska 1, den spädda förbehandlingslösningen ska anta jämvikt vid C om vattenbad används för förbehandling (B3. Färgningsprotokoll, steg 1: Förbehandling, metod A). Om mikrovågsugn med avkänningskapacitet används för förbehandling (B3. Färgningsprotokoll, steg 1: Förbehandling, metod B) den utspädda förbehandlingslösningen bör få anta jämvikt vid rumstemperatur C. Flaska 2A, pepsin bör appliceras vid 2 8 C (B3, färgningsprotokoll, steg 2: metod A och B) och alltid hållas kallt. Flaska 2B: Pepsinspädningsmedel (10X) bör appliceras vid 2 8 C (B3, färgningsprotokoll, steg 2: Metod C). Flaska 3, TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix separeras i 2 faser medan den förvaras vid -18 C. Före användning av flaska 3 måste du säkerställa att endast en fas är närvarande genom att låta probmixen anta jämvikt till rumstemperatur (20 25 C) följt av blandning. Tina flaska 3 vid rumstemperatur (20 25 C) i minst 30 minuter (skydda från starkt ljus), virvla sedan flaskan grundligt i 15 sekunder vid r/min med användning av en vortexblandare. Förvara flaska 3 vid -18 C omedelbart efter användning. Flaska 4, utspädd Stringent Wash Buffer; en burk ska anta jämvikt vid rumstemperatur, en annan burk ska anta jämvikt vid 63 (±2) C före användning. Flaska 5, Fluorescence Mounting Medium kan appliceras vid vilken som helst temperatur från 2 25 C. Flaska 6, den spädda Wash Buffer ska anta jämvikt vid rumstemperatur C. Coverslip Sealant kan appliceras vid vilken som helst temperatur från 2 25 C. Alla steg måste utföras vid den angivna temperaturen. Proceduren inkluderar ett antal dehydreringar följt av torkning av vävnadssnitten. Se till att vävnadssnitten är helt torra innan du går vidare till nästa steg. Låt inte vävnadssnitten torka under de övriga procedurstegen. Om färgningsproceduren måste avbrytas kan glasen förvaras i tvättbuffert efter avparaffineringssteget i upp till 1 timme vid rumstemperatur (20 25 C) utan att resultatet påverkas. B.2 Behandling av vävnader före färgning Avparaffinering och rehydrering: Innan analysen utförs måste objektglasen avparaffineras för att avlägsna inbäddningsmedium och rehydreras. Se till att paraffinet är fullständigt avlägsnat. Resterande inbäddningsmedium orsakar ökad icke-specifik färgning. Detta steg ska utföras vid rumstemperatur (20 25 C). 1. Placera objektglasen i ett xylenbad och inkubera i 5 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 2. Knacka bort överskottsvätskan och placera objektglasen i 96 % etanol i 2 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. 3. Slå bort överskottsvätska och placera objektglasen i 70 % etanol i 2 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. P04092SE_02/K p. 11/37

12 4. Slå bort överskottsvätska och placera glasen i utspädd tvättbuffert (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i minst 2 minuter. Påbörja färgningsproceduren så som beskrivs i avsnitt B.3, steg 1, Förbehandling. Xylen och alkohollösningarna ska bytas efter högst 200 objektglas. Xylensubstitut kan användas. OBS! Reagenserna och anvisningarna som medföljer detta kit har utformats för att ge optimal prestanda. Ytterligare spädning av reagenserna eller ändring av inkubationstemperaturer kan ge felaktiga eller motsägelsefulla resultat. Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan göra resultaten ogiltiga. B.3 Färgningsprotokoll Steg 1: Förbehandling Förbehandling kan utföras antingen med vattenbad enligt metod A eller med mikrovågsugn med avkänningskapacitet enligt metod B. Metod A: Förbehandling med vattenbad Fyll ett färgningskärl med den spädda förbehandlingslösningen (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.1). Placera färgningskärlet med utspädd förbehandlingslösning i vattenbad. Hetta upp vattenbadet och förbehandlingslösningen till C. Mät temperaturen inuti skålen med en kalibrerad termometer för att säkerställa rätt temperatur. Täck skålen med ett lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Sänk ned de rumstempererade avparaffinerade snitten i den förvärmda förbehandlingslösningen i färgningsskålen. Kontrollera temperaturen igen och inkubera i 10 (±1) minuter vid C. Ta bort hela kärlet med objektglas från vattenbadet. Ta av locket och låt glasen svalna i förbehandlingslösning i 15 minuter vid rumstemperatur. Flytta över glasen till en skål med utspädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNINGEN, Avsnitt A.3) i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. OBS! Förbehandlingslösning är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Metod B: Förbehandling med mikrovågsugn med avkänningskapacitet Fyll en plastkyvett med spädd Pre-Treatment Solution vid rumstemperatur (20 25 C). Sänk ned de avparaffinerade snitten i förbehandlingslösning, täck över skålen med ett punkterat lock och placera den i mikrovågsugnen. Välj koksensorfunktionen och ett program som kör i 10 minuter efter att kokpunkten har uppnåtts*. Efter 10 minuters inkubation ska du ta ut skålen med objektglas ur ugnen, ta bort locket och låta den svalna i 15 minuter vid rumstemperatur. Flytta över objektglasen till en skål med spädd Wash Buffer och låt dem ligga i blöt i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. * Användning av en mikrovågsugn med avkänningskapacitet betyder att ugnen måste ha en sensor och program som initialt värmer upp Pre-Treatment Solution till kokpunkten och sedan bibehåller den nödvändiga förbehandlingstemperaturen (över 95 ºC) medan nedräkning sker av den förinställda tiden (10 (±1) minuter). Vissa mikrovågsugnar med avkänningskapacitet har eventuellt inte möjligheten att fritt ställa in nedräkningstid. Om modellen endast har förinställda program ska du se till att välja ett program som bibehåller den nödvändiga förbehandlingstemperaturen (över 95 ºC) under minst 10 (±1) minuter och manuellt stoppa programmet efter 10 (±1) minuter. OBS! Förbehandlingslösning är endast avsedd för engångsbruk. Får ej återanvändas. Steg 2: Pepsin, bruksfärdigt (RTU) eller pepsinlösning Pepsininkubation kan utföras genom direkt applicering av bruksfärdiga pepsindroppar på objektglasen, antingen vid rumstemperatur (20 25 C) (metod A) eller vid 37 C (metod B). Alternativt kan objektglasen sänkas ned i en pepsinlösning och inkuberas vid 37 (±2) C (metod C). Metod A) och metod B) P04092SE_02/K p. 12/37

13 Slå bort överskottsbuffert. Använd en luddfri duk (såsom en absorberande duk eller gasbinda) och torka försiktigt runt provet för att avlägsna all återstående vätska och för att hålla reagenserna inom det föreskrivna området. Applicera 5 8 droppar (250 µl) kallt (2 8 C) Pepsin (flaska 2) för att täcka provet. Förvara alltid pepsin vid 2 8 C. Metod A: Pepsin, bruksfärdigt - Inkubation vid C Inkubera i 5 15 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). En inkubationstid på 5 minuter är adekvat för de flesta prover, men den optimala inkubationstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort överflödigt pepsin och blötlägg snitten i utspädd Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till dehydreringen. Metod B: Pepsin, bruksfärdigt - Inkubation vid 37 C Placera provet med Pepsin på ett värmeblock vid 37 C - t.ex. Dako Hybridizer - och inkubera i 3 5 minuter. En inkubationstid på 3 minuter är adekvat för de flesta prover, men den optimala inkubationstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort överflödigt pepsin och blötlägg snitten i spädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till dehydreringen. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol. Låt vävnadssnitten lufttorka helt. Metod C: Pepsinlösning - Nedsänkning av objektglas i 37 C pepsinlösning Kitet innehåller tillräckligt med reagenser för fyra separata körningar (60 ml pepsinlösning, liten behållare för sex objektglas) eller en enda körning (240 ml pepsinlösning, stor behållare för 24 objektglas). Preparera pepsinlösningen enligt vad som beskrivs i avsnitt A.5. Sätt lock på behållaren och låt pepsinlösningen anta jämvikt till 37 (±2) C i ett vattenbad. Kontrollera att temperaturen har stabiliserats. Mät temperaturen på insidan av behållaren med en kalibrerad termometer för att garantera korrekt temperatur. Slå bort överflödig tvättbuffert. Sänk ned objektglasen i 37 (±2) C pepsinlösning och inkubera i minuter. En inkubationstid på minuter är adekvat för de flesta prover, men den optimala inkubationstiden beror på vävnadsfixering och/eller provets tjocklek och måste fastställas av användaren. Slå bort överflödig pepsinlösning och blötlägg snitten i spädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den spädda Wash Buffer och låt snitten ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Fortsätt till dehydreringen. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol. Låt vävnadssnitten lufttorka helt. Steg 3: TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix separeras i 2 faser medan den förvaras vid -18 C. Före användning av flaska 3 måste du säkerställa att endast en fas är närvarande genom att låta probmixen anta jämvikt till rumstemperatur (20 25 C) följt av blandning. Tina flaska 3 vid rumstemperatur (20 25 C) i minst 30 minuter (skydda från starkt ljus), virvla sedan flaskan P04092SE_02/K p. 13/37

14 grundligt i 15 sekunder vid r/min med användning av en vortexblandare. Förvara flaska 3 vid -18 C omedelbart efter användning. Applicera 10 µl TOP2A/CEN-17 IQISH probmix (flaska 3) till mitten av vävnadssnittet. Placera omedelbart ett 22 mm x 22 mm täckglas över probmixen och låt det sprida sig jämnt under täckglaset. Undvik luftbubblor. Om du ser luftbubblor ska du försiktigt knacka bort dem från vävnaden med en pincett. Kom ihåg att förvara flaska 3 vid -18 C omedelbart efter användning. Försegla täckglaset med täckglasförsegling genom att klämma ut förseglingen runt täckglasets kanter. Låt täckglasförseglingen överlappa täckglas och objektglas så att en försegling bildas runt täckglaset. Se till att täckglasförsegling täcker alla kanterna på täckglaset. Preparera Dako Hybridizer* (kod S2450/S2451) för en hybridiseringskörning. Se till att Humidity Control Strips (kod S2452) är våta och optimala att använda. Starta Hybridizer och välj ett program som: Denaturerar vid 66 C i 10 minuter följt av hybridisering vid 45 C i minuter. Placera objektglasen i Dako Hybridizer, se till att locket är ordentligt stängt och starta programmet. Se användarhandboken till Dako Hybridizer för ytterligare information. * Instrument som tillåter förhållanden som är identiska med de som beskrivs ovan kan användas för denaturering och hybridisering, t.ex. enligt nedanstående beskrivning: Placera objektglasen på en plan metall- eller stenyta (värmeblock eller ett block i en hybridiseringsugn) som är förvärmd till 66 (±1) C. Denaturera i exakt 10 minuter. Placera glasen i en föruppvärmd fuktad hybridiseringskammare. Täck kammaren med ett lock och inkubera vid 45 (±2) C i minuter. Observera att en hybridiseringstemperatur på 37 C inte är lämplig för användning med proberna i detta kit. Steg 4: Stringenttvätt Fyll två färgningsskålar med utspädd stringenttvättbuffert (se BRUKSANVISNING, Avsnitt A.2). En minsta volym på 100 ml eller 15 ml per objektglas i varje skål rekommenderas. Placera en av färgningsskålarna med utspädd stringent tvättbuffert vid rumstemperatur i ett dragskåp och den andra i ett vattenbad. Hetta upp vattenbadet och den utspädda Stringent Wash Buffer till 63 (±2) C. Kontrollera att temperaturen har stabiliserat sig. Täck skålen med lock för att stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. Mät temperaturen inuti vattenbadets skål med en kalibrerad termometer för att vara säker på att temperaturen är korrekt. Stringent Wash Buffer innehåller tvättmedel och kan bli grumlig vid 63 C; detta påverkar inte resultatet. Använd pincett eller handskar och ta ut objektglasen ur hybridiseringskammaren, ta försiktigt bort täckglasförsegling och täckglaset och placera glasen i den rumstempererade skålen med stringent tvättbuffert, ett i taget. Placera inte objektglasen i Stringent Wash Buffer förrän täckglasen avlägsnats. Så snart som alla täckglas har avlägsnats ska objektglasen överföras från det rumstempererade förtvättskärlet till kärlet vid 63 (±2) C i vattenbadet. Timern bör startas omedelbart efter att objektglasen överförts till behållaren på 63 (±2) C i vattenbadet. Utför stringenttvätt i exakt 10 minuter. Ta bort glasen från den utspädda Stringent Wash Buffer och blötlägg snitten i utspädd Wash Buffer i 3 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Byt ut den utspädda Wash Buffer och låt glasen ligga i blöt i ytterligare 3 minuter. Dehydrera vävnadssnitten i en graderad serie etanolbad: 2 minuter i 70 % etanol, 2 minuter i 85 % etanol och 2 minuter i 96 % etanol. Låt vävnadssnitten torka helt. Steg 5: Montering P04092SE_02/K p. 14/37

15 Applicera 15 µl Fluorescence Mounting Medium innehållande DAPI (flaska 5) till glasets målområde och lägg på ett täckglas. OBS! Glasen kan avläsas efter 15 minuter eller inom 7 dagar efter monteringen. Om glasen utsätts för ljus eller höga temperaturer bleknar de dock. Förvara glasen i mörker vid C för att minimera blekning. Kvalitetskontroll 1. Signalerna måste vara ljusa, distinkta och lätta att bedöma. 2. Normala celler gör att man kan göra en intern kontroll av färgningskörningen. Normala celler ska ha 1-2 klart synliga gröna signaler som tecken på att CEN-17 PNA proben framgångsrikt har hybridiserats till den centromeriska regionen av kromosom 17. Normala celler ska också ha 1 2 klart synliga röda signaler som tecken på att TOP2A DNA-proben framgångsrikt har hybridiserats till TOP2A-målregionen. På grund av vävnadssnittningen kommer vissa normala celler ha färre än de förväntade 2 signalerna av varje färg. Normala celler som genomgår celldelning kan ha fler än de normala 1 2 signalerna av varje färg. Om inga signaler detekteras i normala celler är det ett tecken på att analysen misslyckats och resultaten ska anses ogiltiga. 3. Nukleär morfologi måste vara intakt vid utvärdering med ett DAPI-filter. Många spöklika celler och en allmänt dålig nukleär morfologi tyder på övernedbrytning av provet, vilket resulterar i förlust eller fragmentering av signaler. Sådana prover ska anses ogiltiga. 4. Skillnader i vävnadsfixering, behandling, och inbäddning i användarens laboratorium kan producera variabilitet i resultaten som gör regelbunden utvärdering av egna kontroller nödvändiga. Tolkning av färgningen Bedömningsbar vävnad Endast prover från patienter med invasiva karcinom bör testas. I fall med carcinoma in situ och invasivt karcinom i samma prov, ska endast den invasiva komponenten poängsättas. Undvik nekrotiska områden och områden där de nukleära gränserna är tvetydiga. Tag inte med kärnor som kräver subjektiv bedömning. Hoppa över kärnor med svag signalintensitet och ickespecifik eller hög bakgrundsfärgning. Använd DAPI-filtret för att kontrollera att kärnan har jämn färgning. Signalräkning: Lokalisera tumören inom det H&E-färgade glaset och utvärdera samma område på det FISH-färgade glaset. Undersök flera områden med tumörceller för att redovisa eventuell heterogenitet. Välj ett område med god fördelning av kärnor. Börja analysen i den övre vänstra kvadranten i det valda området och räkna antalet signaler inom kärngränserna för varje bedömd kärna enligt riktlinjerna nedan medan du skannar från vänster till höger (se även Bilaga 3). Fokusera uppåt och nedåt för att hitta alla signaler i de individuella kärnorna. Räkna två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än signalens diameter som endast en signal. I kärnor med höga nivåer av TOP2A-genamplifiering, kan TOP2A-signalerna ligga mycket nära varandra och bilda kluster av signaler. I dessa fall kan antalet TOP2A-signaler inte räknas utan måste uppskattas. Speciell uppmärksamhet måste ges åt de gröna signalerna eftersom kluster med TOP2A-signaler kan täcka de gröna signalerna och göra dem omöjliga att se. Vid tveksamhet ska du kontrollera de gröna signalerna med ett specifikt FITC-filter. Kärnor utan signal ska inte poängsättas. Poängsätt endast kärnor med en eller flera gröna referenssignaler. Registrera antalen i en tabell såsom visas i Bilaga 2. P04092SE_02/K p. 15/37

16 Signalräkningsguide 1 Räkna inte. Kärnorna överlappar, alla områden med kärnor syns inte 2 Räkna som två gröna signaler 3 Två röda signaler, poängsätt inte kärnor med endast röda signaler 4 Räkna som 3 gröna och 12 röda signaler (klusteruppskattning) 5 Räkna som 1 grön och 1 röd signal. Två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än diametern hos en signal räknas som en. 6 Räkna inte (över- eller undernedbrutna kärnor). eller Saknade signaler i mitten av kärnor (donut-formade kärnor). 7 Räkna som 2 gröna och 3 röda signaler. Två signaler med samma storlek och separerade med ett avstånd lika med eller mindre än diametern hos en signal räknas som en. 8 Räkna som 1 grön och 5 röda signaler 9 Räkna som 3 gröna (1 grön ej i fokus) och 3 röda signaler 10 Kluster med röda signaler som skymmer gröna signaler, kontrollera de gröna signalerna med ett specifikt FITC-filter eller räkna inte Signalerna kan poängsättas antingen med den konventionella metoden (41) eller med en alternativ tids- och arbetsbesparande metod (21, 29). I stället för den konventionella metoden att räkna signaler i 60 kärnor, poängsätts totalt 60 händelser, där en händelse är en röd gensignal. Med denna alternativa beräkningsmetod poängsätts ett varierande antal kärnor tills 60 röda TOP2A-signaler uppnås. De motsvarande gröna CEN-17-signalerna i samma kärna registreras. Det minsta antalet kärnor som ska poängsättas är 6. I normala prover kommer i genomsnitt 35 kärnor att vara tillräckligt för att uppnå 60 röda signaler. I amplifierade fall kommer 6 35 kärnor att innefattas. Även i fall med deletioner kommer mindre än 60 kärnor ofta att vara tillräckligt. Räkna om möjligt kärnorna från 3 tydliga tumörområden (42). Beräkna TOP2A/CEN-17- förhållandet genom att dividera antalet röda TOP2A-signaler med det totala antalet gröna CEN- 17-signaler. Prover med ett TOP2A/CEN-17-förhållande som är högre eller lika med 2 ska anses ha TOP2A-amplifikation och prover med ett TOP2A/CEN-17-förhållande på mindre än 0,8 ska anses ha TOP2A-deletion (18, 21, 29). Resultat vid eller nära tröskelvärdet (1,8 2,2 för amplifieringar och 0,7 0,9 för deletioner) bör tolkas med försiktighet. Vi rekommenderar att du kontrollerar att poängen inte inkluderar en hög andel normala kärnor. Om förhållandet faller inom någon av de två tvetydiga zonerna, eller i fall av osäkerhet, rekommenderas att provets poäng verifieras genom omräkning av en andra person, genom att räkna kärnor från 3 eller flera tumörområden och/eller räkna totalt 60 kärnor. Ett acceptanskriterium på ±10 % VK rekommenderas. Det slutliga förhållandet ska omräknas P04092SE_02/K p. 16/37

17 baserat på alla poäng. Vid gränsfall finns det anledning att låta patologen konsultera med den behandlande läkaren. Begränsningar Allmänna begränsningar 1. FISH är en flerstegsprocess som kräver specialutbildning i val av lämpliga reagenser, vävnadsval, fixering, bearbetning, preparation av FISH-objektglaset och tolkning av färgningsresultaten. 2. FISH-resultat är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Felaktig fixering, tvättning, torkning, uppvärmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan påverka probhybridiseringen. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder eller på inneboende oregelbundenheter i vävnaden. 3. För optimala och reproducerbara resultat måste vävnadspreparat avparaffineras fullständigt. Paraffinborttagningen måste vara klar vid början av färgningsprocessen. (Se BRUKSANVISNING, avsnitt B.2). 4. Endast temperaturkalibrerat vattenbad, värmeblock, och hybridiseringsugn ska användas. Användning av andra typer av utrustning kan resultera i avdunstning av TOP2A/CEN-17 Probe Mix under hybridiseringen och måste valideras av användaren. Prestandaegenskaper Analytisk sensitivitet Känsligheten hos TOP2A/CEN-17 Probe Mix undersöktes med hjälp av 18 adenokarcinomprover från normalt humant bröstepitel. Förhållandet mellan antalet TOP2A-signaler och CEN-17 signaler beräknades baserat på en räkning av 60 kärnor per prov. TOP2A/CEN-17-förhållandet för de 18 proverna av normalt humant bröstepitel var mellan 0,97 1,11. Analytisk specificitet TOP2A-DNA proberna i TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix har ändsekvenserats och kartlagt för att bekräfta att de täcker totalt 228 kb inklusive TOP2A-genen. CEN-17 PNA-proberna i TOP2A/CEN-17 Probe Mix har testats individuellt och i kombination för att bekräfta deras specifika hybridisering till den centromeriska regionen hos kromosom 17. Studier utfördes på vävnadsprover av normalt humant bröstepitel med användning av flaska 3, innehållande hybridiseringsbufferten men utan probmixen, för att mäta analysens förmåga att ensam identifiera målsubstanserna TOP2Aoch CEN-17 utan interferens från andra substanser. Totalt 18 prover utvärderades för närvaro av signaler som inte var relaterade till probmixen. Ingen detektion av andra kromosom mål eller interferens med nära besläktade substanser observerades i något av de 18 proverna. Härdighetsstudier Härdigheten av TOP2AIQFISH pharmdx-analysen testades genom att variera förbehandlingstid, temperatur och metoder för uppvärmning av förbehandlingsbuffert (mikrovågsugn eller vattenbad), pepsininkubationstid och metod (bruksfärdigt pepsin eller nedsänkning), denatureringstemperatur och tid, hybridiseringstid samt stringenttvättid och temperatur. Inga signifikanta skillnader i resultaten observerades vid följande experimentella tillstånd: P04092SE_02/K p. 17/37

18 Förbehandlingsmetod A) Vattenbad i 10 minuter kombinerat med var och en av temperaturerna 95 C, C samt 99 C, tillsammans med 9, 10 och 11 minuter vid C. Förbehandlingsmetod B) Mikrovågsugn i 9, 10 och 11 minuter vid > 95 C. Pepsinnedbrytningsmetod A) med inkubationstider på 5, 10 och 15 minuter vid rumstemperatur (20 25 C). Pepsinnedbrytningsmetod B) med inkubationstider på 3, 4 och 5 minuter vid 37 C). Pepsin nedbrytningsmetod C) med inkubationstider på 20, 25 och 30 minuter kombinerat med var och en av temperaturerna 35, 37 och 39 C. Denaturering i 10 minuter, kombinerat med var och en av temperaturerna 65, 66 och 67 C, tillsammans med 9, 10 och 11 minuter vid 66 C. Hybridiseringstid på 60, 90 och 120 minuter vid 45 C. Stringenttvätt i 10 minuter kombinerat med var och en av temperaturerna 61, 63 och 65 C, tillsammans med 9, 10 och 11 minuter vid 63 C. Vissa av tids- och temperaturkombinationerna vid de extrema toleranserna resulterade i något minskad vävnadsstrukturkvalitet, men ingen signifikant skillnad i signalintensitet observerades. Färgningsproceduren för TOP2A IQFISH pharmdx erbjuder protokollvariabler för värmeförbehandling, pepsinnedbrytning samt hybridiseringstid. Varje unika kombinationsalternativ har validerats med hänsyn till TOP2A-genstatus. Validering utfördes på 10 FFPE humana bröstkarcinomprover för vart och ett av de 12 möjliga kombinationsalternativen. TOP2A FISH pharmdx kit (K5333) användes som referens. TOP2A/CEN-17-förhållande för varje individuellt prov visas i Figur 1. Korstabuleringar mellan de 12 testerna och referensfärgningen visade total överensstämmelse i TOP2Agenstatus på 100 % (10/10) med undre och övre two-tailed 95-procentiga konfidensgränser vid 78,3 % respektive 100 %. Kappavärde var 1,00 och McNemars test visade frånvaro av ensidighet (two-tailed p-värde på 1,00). P04092SE_02/K p. 18/37

19 Figur 1. Individuella TOP2A/CEN-17-förhållanden för 10 humana bröstkarcinomprover, som färgats med användning av de 12 kombinationsprotokollvariationerna som är möjliga med TOP2A IQFISH pharmdx (kod K5733) (Test 1 12) och TOP2A FISH pharmdx kit (kod K5333) referens (R). Den övre vågräta linjen visar tröskelvärdet på 2,0 och den undre vågräta linjen viskar tröskelvärdet på 0,8. Repeterbarhet Repeterbarheten av TOP2A/CEN-17-förhållandet undersöktes med TOP2AIQFISH pharmdx-analysen med användning av seriella snitt av nio humana bröstkarcinomprover med antingen deleterad, normal eller amplifierad TOP2Agenstatus. Tredubbla snitt av varje prov testades i samma körning. Den genomsnittliga variationskoefficienten var 3 % (varierade från 1 % till 4 %) för TOP2A-deleterade prover, 7 % (varierade från 2 % till 10 %) för normala TOP2A-prover, och 5,3 % (varierade från 4 % till 7 %) för TOP2A-amplifierade prover. Totalt fem på varandra följande snitt av humana bröstcancerprover med olika tjocklek (3, 4, 5, 6, och 7 µm) testades med TOP2AIQFISH pharmdx. Den genomsnittliga variationskoefficienten av TOP2A/CEN-17-förhållandet var 9,8 % (intervall från 6 % till 13 %). Reproducerbarhet TOP2AIQFISH pharmdx-analysen testades för reproducerbarhet mellan partier och mellan observatörer, med användning av tre partier med TOP2A IQFISH pharmdx och tre observatörer. Reproducerbarhet testades på nio olika humana bröstkarcinomprover med antingen icke amplifierad eller amplifierad TOP2A-genstatus. Den genomsnittliga variationskoefficienten för reproducerbarhet mellan olika partier var 3,7 % för TOP2A-deleterade prover (varierade från 2 % till 6 %), 10,3 % för TOP2Anormala prover (varierade från 10 % till 11 %), och 9,3 % för TOP2A-amplifierade prover (varierade från 5 % till 12 %). Den genomsnittliga variationskoefficienten för reproducerbarhet mellan olika observatörer var 13,7 % för TOP2A-deleterade prover (varierade från 7 % till 17 %), 7 % för TOP2Anormala prover (varierade från 2 % till 11 %), och 12,7 % för TOP2A-amplifierade prover (varierade från 10 % till 15 %). Klinisk användbarhet Doxorubicin och epirubicin är antracykliner som är bland de mest allmänt använda anti-tumörläkemedlen, och man har påvisat att topoisomeras IIα är det molekylära målet för den farmakologiska verkan av dessa föreningar (14, 15). Doxorubicin och epirubicin har visat sig vara effektiva i ett antal olika maligniteter, inklusive bröstcancer, där de används för både metastatisk sjukdom och i den understödjande miljön (15). För den understödjande behandlingen av bröstcancer har kliniska data visat att kemoterapiregimer som innefattar doxorubicin eller epirubicin resulterar i en statistiskt signifikant förbättring av överlevnad jämfört med regimer som inte innefattar antracyklin (43, 44). Antracykliners terapeutiska index är lågt och den ökade effektiviteten sker på bekostnad av större toxicitet jämfört med andra kemoterapiregimer, t.ex. CMF (cyklofosfamid/metotrexat/5-fluorouracil) (19, 45). Förutom den akuta toxiciteten kan behandling med doxorubicin eller epirubicin resultera i långvariga biverkningar med kardiotoxicitet och sekundär akut myeloid leukemi (AML) (6, 15). Kardiomyopati, som inducerats genom terapi, är ofta irreversibel och kan leda till kronisk hjärtinsufficiens flera månader eller år efter avslutad behandling. För att optimera den medicinska behandlingen med doxorubicin och epirubicin är det viktigt för klinikerna att ha tillgängliga verktyg som kan identifiera patienter som är mest sannolika att dra fördel av doxorubicin- och epirubicin-terapi. Den kliniska prestandan hos Dako TOP2AFISH pharmdx kit (kod K5333) har undersökts i två studier, som utförts av Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) i Köpenhamn (21, 29, 30, 46). P04092SE_02/K p. 19/37

20 Pilotstudie Den kliniska prestandan hos TOP2A FISH pharmdx kit har utvärderats i en pilotstudie av prover från 120 bröstcancerpatienter (29) i samarbete med DBCG. Totalt 20 tumörer hade nummerändringar av TOP2A-kopior, som var nästan jämnt fördelade mellan amplifikationerna (n=11) och deletionerna (n=9). TOP2A-ändringarna påträffades inte enbart i HER2-positiva tumörer, då 4 tumörer (20 % av de onormala TOP2A-fallen) var HER2-negativa. Ett förhållande (röda signaler/gröna signaler) som är större än eller lika med 2, skiljer mellan amplifierade och normala fall, medan ett förhållande på mindre än 0,8 associeras med gendeletion. Pilotstudien visade att 2 olika beräkningsmetoder gav identiska resultat: Antingen räknades signalerna i 60 kärnor eller så räknades totalt 60 röda signaler tillsammans med de gröna signalerna i samma kärna. Den senare metoden har fördelen att det högsta antalet celler kommer att räknas i de deleterade och normala fallen, medan det lägsta antalet celler kommer att räknas i de amplifierade fallen. Amplifierade fall kan ofta identifieras tydligt endast genom att titta i mikroskopet, men är mer tidskrävande att utvärdera om 60 kärnor ska poängsättas. Bekräftande studie - DBCG 89D/TOP2A På en större skala utvärderades den kliniska prestandan hos TOP2AFISH pharmdx kit baserat på tumörprover som prospektivt uppsamlats från den understödjande DBCG 89Dstudien. (21, 30, 46, 47). Studieutformning Det huvudsakliga syftet med 89D/TOP2A-studien var att undersöka om TOP2A-genavvikelser (amplifikation eller deletion) skulle kunna tjäna som en prediktiv markör för recidivfri och total överlevnad hos bröstcancerpatienter i riskzonen, som avses behandlas med understödjande epirubicinbaserad kemoterapi. I sekundärt syfte studerades de prognostiska egenskaperna hos TOP2A-genavvikelser och korrelationen mellan TOP2A och HER2. BCG 89D-studien utformades som en öppen, prospektiv, randomiserad studie. Efter operation randomiserades 980 pre- och postmenopausala kvinnor i riskzonen för invasiv bröstcancer till CMF eller CEF (cyklofosfamid/epirubicin/5-fluorouracil). Det primära effektivitetsresultatet var RFÖ (recidivfri överlevnad) med TÖ (total överlevnad) som en sekundär ändpunkt. För den biologiska substudien uppsamlades DBCG 89D/TOP2A-vävnadsblock från patienterna som deltagit i DBCG 89D-studien, från studieklinikerna och analyserades centralt retrospektivt för TOP2A- och HER2 -genavvikelser (Dako HER2 FISH pharmdx kit) såväl som överexpression av HER2 (Dako HercepTest ). Vävnadsblock var tillgängliga från 806 av de 980 patienterna som innefattades i DBCG 89D-studien. Med avseende på TOP2A and HER2-genavvikelser beräknades förhållandet som antalet signaler för genproberna dividerat med antalet signaler för centromeren 17. Fall poängsattes som HER2- eller TOP2A FISH-amplifierade när förhållandet var 2. En TOP2A-deletion ansågs närvarande när förhållandet var < 0,8. TOP2A-status kategoriserades i följande grupper: Deleterade: TOP2A/CEN-17-förhållande < 0,8 Normal: 0,8 TOP2A/CEN-17-förhållande < 2,0 Amplifierad: TOP2A/CEN-17-förhållande 2,0 För the HercepTest utsattes alla 1+, 2+ and 3+ positiva prover för HER2 FISH-analys. Poängsättningen av HER2-positivitet (48) i studien var enligt följande: Positiv: HercepTest=3+, eller HercepTest=2+ och FISH HER2-förhållande 2,0 Negativ: HercepTest=0,1+, eller HercepTest=2+ och FISH HER2-förhållande < 2,0 Den kliniska studien (DBCG 89D) och den biologiska substudien (DBCG 89D/TOP2A) utfördes enligt Helsingforsdeklarationen och godkändes av de lokala etiska kommittéerna. P04092SE_02/K p. 20/37

21 Statistisk metodologi Den primära ändpunkten för studien var RFÖ, definierat som tiden från randomisering till en händelse eller censurering. Den sekundära ändpunkten var TÖ, definierat som tiden från randomisering till död eller censurering. Effekten av behandling med CEF jämfört med CMF på RFÖ och TÖ kvantifierades beträffande riskförhållande och uppskattades med användning av Cox proportionella riskmodell. Cox proportionella riskmodell justerades enligt resultaten av goodness-of-fitprocedurerna och undersökningen av interaktion, så att den grundläggande multivariata Cox-modellen för analys av RFÖ och TÖ definierades. Riskförhållandet (HR), det 95 % konfidensintervallet och p-värdet av Wald-testet gavs för varje kovariat och interaktionsuttryck i Cox-modellen. Riskförhållandet för behandling med CEF kontra behandling med CMF i varje TOP2A-undergrupp (och HER2-undergrupp) härleddes från resultaten och visades med en Forrest-plot. Efter Cox proportionella riskmodell för RFÖ och TÖ justerats enligt resultaten av goodness-of-fit-procedurerna och undersökningsinteraktioner, utfördes 3 typer av sekundära analyser. Multivariat uppskattning i de 3 TOP2A-undergrupperna: Deleterade, normala, amplifierade. Multivariat uppskattning i de 2 TOP2A-undergrupperna: Negativa, positiva. Enhetlig multivariat uppskattning för alla patienter inklusive TOP2Aoch HER2- interaktion. Korrelationer mellan TOP2A-status och kliniska och patologiska variabler, inklusive HER2-status, testades med χ2-test. Uppföljningstid kvantifierades med hänsyn till en Kaplan-Meier-uppskattning av potentiell uppföljning. Analyser utfördes för möjlig selektionsbias med användning av χ2-testet och loggranktest. Patienter med saknade värden, förutom receptorstatus, uteslöts från de multivariata analyserna i Cox proportionella riskmodell. Resultat TOP2A FISH-analysen var framgångsrik på 773 av de 806 (96 %) bröstcancerproverna. Den totala fördelningen av TOP2A-status bland kvalificerade patienter visas i Tabell 1. Amplifiering av TOP2A sågs hos 92 (11,9 %) av de 773 kvalificerade patienterna och deletion hos 87 (11,3 %). Tabell 1. Fördelning av TOP2A-status TOP2A-status n (%) Deleterad Normal Amplifierad 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) Totalt 773 (100) Fördelningen av TOP2A-amplifikationer och deletioner i förhållande till HER2-status, visas i Tabell 2. Tabell 2. Fördelning av HER2-status i förhållande till TOP2A-status TOP2A N n (%) Deletera d n (%) Normal n (%) Amplifiera d n (%) Negativt 527 (100) 26 (4,9) 487 (92,4) 14 (2,7) (p-värde) χ 2 P04092SE_02/K p. 21/37

22 HER2- status Positivt 246 (100) 61 (24,8) 107 (43,5) 78 (31,7) p < 0,0001 Totalt 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) Vid betraktande av HER2-status påträffades fler TOP2A-avvikelser bland de HER2- positiva tumörerna. TOP2A-avvikelser sågs i 139 (56,5 %) av de 246 HER2-positiva tumörerna och i 40 (7,6 %) av de 527 HER2-negativa tumörerna. Sålunda skulle 40 (22,3 %) patienter med TOPTOP2A-avvikelser förbisetts om enbart de HER2-positiva proverna analyserats. Fördelningen av TOP2A-avvikelser i förhållande till HER2 FISH-status, visas i Tabell 3. En signifikant korrelation med TOP2A-status påträffades för HER2-status. Tabell 3. Fördelning av HER2 FISH-status i förhållande till TOP2A-status HER2 FISH TOP2A N n (%) Deletera d n (%) Normal n (%) Amplifiera d n (%) Normal 539 (100) 31 (5,8) 493 (91,5) 15 (2,8) Amplifiera 234 (100) 56 (23,9) 101 (43,2) 77 (32,9) d Totalt 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) (p-värde) χ 2 p < 0,0001 Fördelningen av TOP2A-avvikelser i förhållande till HercepTest -poäng visas i Tabell 4. En signifikant korrelation med TOP2A-status påträffades för HER2-status. Tabell 4. Fördelning av HercepTest -poäng i förhållande till TOP2A-status HercepTes t TOP2A N n (%) Deletera d n (%) Normal n (%) Amplifiera d n (%) (100) 11 (5,3) 192 (91,9) 6 (2,9) (100) 13 (5,1) 238 (92,6) 6 (2,3) (100) 3 (3,9) 65 (83,3) 10 (12,8) (100) 60 (26,2) 99 (43,3) 70 (30,6) Totalt 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) (p-värde) χ 2 p < 0,0001 Sex av de 773 patienterna med tillgängliga TOP2A-data saknade kliniska data, vilket uteslöt dem från de multivariata analyserna. För patienterna med tillgängliga TOP2A-testresultat var den potentiella uppföljningstiden för RFÖ 9,4 år och motsvarande antalet händelser var 371. Medianen av den potentiella uppföljningstiden för TÖ var 11,1 år och antalet händelser var 336. Kaplan-Meier-kurvor för RFÖ med hänsyn till de två behandlingsgrupperna i var och en av de tre TOP2A-grupperna visas i Figur 2 4. P04092SE_02/K p. 22/37

23 Figur 2. RFÖ för CMF- och CEF-behandlade patienter med TOP2A-amplifierade tumörer Figur 3. RFÖ för CMF-och CEF-behandlade patienter med TOP2A-normala tumörer Figur 4. RFÖ för CMF-och CEF-behandlade patienter med TOP2A-deleterade tumörer Både i den TOP2A-amplifierade och i den TOP2A-deleterade patientgruppen visade sig behandlingen med CEF vara överlägsen behandling med CMF. För de TOPTOP2A-amplifierade patienterna var skillnaden signifikant (p=0,037). Ingen sådan P04092SE_02/K p. 23/37

24 skillnad kunde detekteras för den normala TOP2A-patientgruppen. För den primära studieändpunkten (RFÖ) visade analyserna som använde Cox proportionella riskmodell ett signifikant prediktivt värde för TOP2A-genavvikelser (p=0,016). Patientgruppen med TOP2A-amplifikationer hade en relativ riskminskning på mer än 60 % vid behandling med CEF jämfört med CMF (HR=0,389, p-värde=0,0017). Även för TOP2A-deletionerna fann man en riskminskning, även om den inte var statistiskt signifikant (HR=0,608, p-värde=0,0828). I Figur 4 visas den relativa effekten av CEF i var och en av TOP2A- och HER2-undergrupperna med hänsyn till RFÖ. Figur 5. Relativ effekt av CEF i varje TOP2A- och HER2-undergrupp på RFÖ (Forrestkurva) För TÖ visades liknande resultat som för RFÖ, men dessa var inte signifikanta (p=0,14). Patienterna med TOP2A-amplifikationer upplevde en riskminskning på mer än 50 % vid behandling med CEF jämfört med CMF (HR=0,485, p=0,0142). Beträffande RFÖ fann man en icke-signifikant riskminskning för TOP2A-deletioner (HR=0,678, p-värde=0,155). Figur 6 visar den relativa effekten av CEF i var och en av TOP2A- och HER2-undergrupperna med hänsyn till TÖ. P04092SE_02/K p. 24/37

25 Figur 6. Relativ effekt av CEF i varje TOP2A- och HER2-undergrupp på TÖ (Forrestkurva) Det prediktiva värdet av HER2-status undersöktes också och data visade ingen signifikant effekt med hänsyn till behandlingsinteraktioner, varken för RFÖ eller för TÖ. Det prediktiva värdet av HER2-status undersöktes också och data visade ingen signifikant effekt med hänsyn till behandlingsinteraktioner, varken för RFÖ eller för TÖ. En analys av distributionen av TOP2A-avvikelser med hänsyn till baslinjeegenskaperna, visade en signifikant associering med flera av de etablerade histopatologiska prognostiska faktorerna. Vidare påvisade data att proportionen kvinnor med TOP2A -avvikelser ökade med ålder, vilket resulterade i en högre frekvens bland postmenopausala kvinnor jämfört med premenopausala kvinnor. De univariata överlevnadsanalyserna indikerade en negativ signifikant effekt på både RFÖ och TÖ, då patienter med amplifikationer och deletioner hade en signifikant minskning i överlevnad jämfört med patienter med normal TOP2A -status. Överlevnadskurvorna indikerade även att patienter med deletioner hade en ännu sämre prognos än patienter med amplifierad eller normal TOP2A -status. Överlevnadkurvorna för patienter med amplifierad, normal eller deleterad TOP2A -status visas i Figur 7. P04092SE_02/K p. 25/37

26 Figur 7. TOP2A-status med hänsyn till RFÖ och TÖ (N=767) Förutom associeringen med de etablerade kliniska prognostiska faktorerna visades att TOP2A -avvikelser hade ett oberoende prognostiskt värde. Med användning av Cox proportionella riskmodell påvisades att en TOP2A -genavvikelse associerades med en betydligt sämre prognos, både med hänsyn till RFÖ (p=0,0169) och TÖ (p=0,0118). HR och de 95-procentiga konfidensgränserna, baserat på Cox-modellen för RFÖ och TÖ, visas it Tabell 5 och 6. P04092SE_02/K p. 26/37

27 Tabell 5. HR för RFÖ - TOP2A och behandlingsinteraktion inkluderad Varierar Menopaus Pre Post Tumörstorlek per ökande cm Positiva lymfnoder TOP2A-status Deleterad Normal Amplifierad HER2-status Negativt Positivt > 0,0001 > 0,0001 0,0169 0,2998 HR 1 1,26 95 % KI (0,99 1,60) 1,15 (1,09 1,22) 1 2,01 4,16 1,66 1 1,56 (1,39 2,91) (2,88 6,02) (1,12 2,45) (1,00 2,42) 1 1,15 (0,88 1,49) Tabell 6. HR för total överlevnad - TOP2A och behandlingsinteraktion inkluderad Varierar Menopaus Pre Post Tumörstorlek per ökande cm Positiva lymfnoder TOP2A-status Deleterad Normal Amplifierad HER2-status Negativt Positivt (pvärde) 0,0576 (pvärde) 0,0124 > 0,0001 > 0,0001 0,0118 0,0519 HR 95 % KI 1 1,37 (1,07 1,75) 1,16 (1,10 1,23) 1 2,62 5,50 1,82 1 1,37 (1,70 4,04) (3,58 8,45) (1,22 2,71) (0,87 2,16) 1 1,31 (1,00 1,72) När riskförhållandet för de olika variablerna i Tabell 12 (RFÖ) rangordnas med hänsyn till det prognostiska värdet är listan enligt följande: antal positiva lymfkörtlar > TOP2A - status > menopausal status > HER2-status och tumörstorlek. Från denna rangordning ser det ut som antalet positiva lymfkörtlar är den variabel som har den största prognostiska inverkan följt av TOP2A -status, menopausal status, tumörstorlek och HER2-status. Om rangordningen upprepades för TÖ (Tabell 6) var resultaten liknande RFÖ, vilket indikerade ett starkt prognostiskt värde av TOP2A -statusen. Det prognostiska värdet av HER2-status undersöktes också och de univariata överlevnadsanalyserna indikerade en signifikant negativ effekt på både RFÖ och TÖ, då P04092SE_02/K p. 27/37

28 HER2-positiva patienter hade en minskning i överlevnad jämfört med patienter med en normal HER2-status. Den primära analysen av RFÖ med användning av Cox proportionella riskregressionsanalys visade ingen signifikant effekt av HER2-statusen. Vid upprepning av analysen med hänsyn till TÖ, visade den positiva HER2-statusen en signifikant negativ inverkan på överlevnad. Diskussion och slutsats DBCG 89D/TOP2A -studien har påvisat signifikanta prediktiva och prognostiska värden för TOP2A -genavvikelser. Baserat på jämförelser med HER2-status kan man dra slutsatsen att HER2-status och TOP2A-status inte är utbytbara, varken för det prediktiva eller prognostiska värdet. TTOP2A är det molekylära målet för den farmakologiska verkan av epirubicin och studien har påvisat att en TOP2A-genavvikelse, speciellt amplifikationer, är användbar som en prediktiv markör för respons på epirubicin. Antracyklinbaserad kemoterapi med doxorubicin eller epirubicin är bland de mest aktiva regimerna för bröstcancer. Dessa föreningar har emellertid signifikanta akuta och långvariga allvarliga biverkningar, såsom kardiotoxicitet och leukemi. Jämförande studie mellan TOP2A FISH pharmdx kit och TOP2A IQFISH pharmdx Dako TOP2A IQFISH pharmdx (kod K5733) har jämförts med Dako TOP2A FISH pharmdx kit (kod K5333) i en jämförande studie av 80 bröstvävnadsprover av humant bröstkarcinom. Korstabulering av TOP2A-status, som erhållits av de två analyserna, gav en total överensstämmelse på 100 % med undre och övre gränser för det 95-procentiga konfidensintervallet vid 96,9 % och 100 %. Kappavärdet var 1. P04092SE_02/K p. 28/37

29 Felsökning Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Inga signaler eller svaga signaler 1a. Kitet har utsatts för höga temperaturer under transport eller förvaring. 1a. Kontrollera förvaringsförhållandena. Kontrollera att kolsyreis fanns närvarande när leveransen togs emot. Kontrollera att flaska 3 har förvarats vid -18 C i mörker. Kontrollera att flaskorna 2A och 5A har förvarats vid högst 2 8 C och att flaskorna har förvarats i mörker. 1b. Mikroskopet fungerar inte korrekt - olämpligt filter insatt - fel lampa - kvicksilverlampan för gammal - smutsiga och/eller spruckna kollektorlinser - olämplig immersionsolja 1b. Kontrollera mikroskopet och att de använda filtren är lämpliga för användning med kitets fluorokromer och att kvicksilverlampan är korrekt och inte har använts längre än sin förväntade livslängd. (se Bilaga 3). Kontakta mikroskopförsäljaren vid tveksamhet. 1c. Blekta signaler 1c. Undvik lång mikroskopundersökning och minimera exponeringen för starka ljuskällor. 1d. Felaktiga förbehandlingsförhållanden 1e. Avdunstning av probmix under hybridiseringen 1d. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen och tiden för förbehandling har använts. 1e. Kontrollera fuktighetsnivån i hybridiseringskammaren 2. Inga gröna signaler 2a. Fel stringenttvättförhållanden 2a. Kontrollera att den rekommenderade stringenttvättemperaturen används och att täckglasen tas bort innan stringenttvätten utförs 3. Inga röda signaler 3a. Felaktiga förbehandlingsförhållanden 3a. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen och tiden för förbehandling har använts 4. Områden utan signal 4a. Probvolymen är för liten 4a. Se till att probvolymen är tillräckligt stor för att täcka området under täckglaset 4b. Luftbubblor infångades under probmixappliceringen eller monteringen 4b. Undvik luftbubblor. Om du ser luftbubblor, knacka försiktigt bort dem med en pincett P04092SE_02/K p. 29/37

30 Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 5. Överdriven bakgrundsfärgning 5a. Olämplig vävnadsfixering 5a. Se till att endast formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt används 5b. Paraffinet har inte avlägsnats fullständigt 5c. Stringenttvättemperaturen är för låg 5d. Långvarig exponering av hybridiserat snitt för starkt ljus 5b. Följ de avparaffineringsoch rehydreringsprocedurer som beskrivs i avsnitt B.2 5c. Se till att stringenttvättemperaturen är 63 (±2) C 5d. Undvik lång mikroskopundersökning och minimera exponeringen för starkt ljus 6. Dålig vävnadsmorfologi 6a. Felaktig pepsinbehandling 6a. Följ de rekommenderade inkubationstiderna för pepsin. Se avsnitt B.3, steg 2. Se till att pepsinet hanteras vid korrekt temperatur. Se avsnitt B.1 6b. Felaktig förbehandling kan resultera i otydligt eller grumligt utseende 6c. Alltför lång pepsinbehandling eller mycket tunna snitt kan göra att spökceller eller donut-celler visas. 6b. Kontrollera att den rekommenderade temperaturen och tiden för förbehandling har använts 6c. Förkorta inkubationstiden för pepsin. Se avsnitt B.3, steg 2. Se till att snittjockleken är 4 6 µm 7. Hög nivå av grön autofluorescens på objektglaset, inklusive områden utan FFPE-vävnad 7. Användning av utgångna eller ej rekommenderade objektglas 7. Säkerställ att det belagda objektglaset (Dako Silanized Slides, kod S3003, eller poly-llysinbelagda objektglas) inte har gått ut. OBS! Om problemet inte kan hänföras till någon av ovanstående orsaker eller om de föreslagna åtgärderna inte löser problemet, kontakta Dakos tekniska service för ytterligare hjälp. P04092SE_02/K p. 30/37

31 Bilaga 1 TOP2A IQFISH pharmdx, kod K5733 Protokoll - checklista Datum för körningen: TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 parti: Prov-ID: Utrustnings-ID: Färgningskörning logg-id: Datum för utspädning/utgångsdatum för 1x tvättbuffert (flaska 6 utspädd 1:20): / Vävnad fixerad i neutralbuffrat formalin Ja Nej Steg 1: Förbehandling Datum för spädning/utgångsdatum för Pre-Treatment Solution (flaska 1 spädd 1:20) / Uppmätt temperatur av Pre-Treatment Solution (95 99 C) C Förbehandling (10 minuter), och avkylning (15 minuter) Tvätt i Wash Buffer (flaska 6 spädd 1:20) (2 x 3 minuter) Steg 2: Pepsin Varaktighet av pepsinbehandlingen (flaska 2) vid 37 C eller minuter Varaktighet av pepsinbehandlingen (flaska 2) vid rumstemperatur eller minuter Varaktighet av pepsinnedsänkning vid 37 (±2) C minuter Tvätt i Wash Buffer (flaska 6 spädd 1:20) (2 x 3 minuter) Dehydrera glasen (3 x 2 minuter) i graderad serie etanol och lufttorka Steg 3: TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix Applicera probmix (flaska 3), täckglas och förslut med täckglasförsegling Uppmätt denatureringstemperatur (66 ±1 C) C Denaturering i 10 minuter Uppmätt hybridiseringstemperatur (45 ±2 C) C Hybridisering över natten (skydda från ljus) Steg 4: Stringenttvätt Datum för utspädning/utgångsdatum för stringenttvättbuffert (flaska 4 utspädd 1:20) / Uppmätt temperatur för stringent tvättbuffert (63 ±2 C) C Stringenttvätt (10 minuter) efter borttagning av täckglas Tvätt i Wash Buffer (flaska 6 spädd 1:20) (2 x 3 minuter) Dehydrera glasen (3 x 2 minuter) i graderad serie etanol och lufttorka Steg 5: Montering Applicera 15 µl Fluorescence Mounting Medium (flaska 5) och förse med täckglas Kommentarer: Datum och namnteckning, Tekniker: P04092SE_02/K p. 31/37

32 Bilaga 2 TOP2A IQFISH pharmdx, kod K5733 Poängschema Datum för körningen: Färgningskörning - logg-id: TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 parti: Prov-ID: Kärna nr TOP2A -poäng CEN-17 -poäng Kärna nr TOP2A -poäng CEN-17 -poäng Kärna nr TOP2A -poäng CEN-17 -poäng Totalt (1 20) Totalt (21 40) Totalt (41 60) För bestämning av TOP2A/CEN-17-förhållandet, räkna antalet TOP2A-signaler och antalet CEN-17-signaler i antingen 60 kärnor eller antalet kärnor som krävs för 60 TOP2A-signaler (se avsnittet Tolkning av färgning). Dividera det totala antalet TOP2A-signaler med det totala antalet CEN-17-signaler. Om TOP2A/CEN-17-förhållandet är ett gränsfall (0,7 0,9 eller 1,8 2,2), ska du räkna om provet beräkna förhållandet på nytt baserat på antalet räknade celler. Antal räknade celler TOP2A-signaler CEN-17-signaler TOP2A/CEN-17-förhållande TOP2A gendeletion (förhållande < 0,8) Normal TOP2A genstatus (0,8 förhållande < 2) TOP2A genamplifiering (förhållande 2) Datum och namnteckning, Tekniker: Datum och namnteckning, Patolog: Kommentarer: För riktlinjer för poängsättning: se Tolkning av färgning. P04092SE_02/K p. 32/37

33 Bilaga 3 TOP2A IQFISH pharmdx, kod K5733 Specifikationer för fluorescensmikroskop Dako rekommenderar att följande utrustning används med TOP2A IQFISH pharmdx, K5733: 1. Mikroskoptyp Epifluorescensmikroskop. 2. Lampa 100 watt kvicksilverlampa (håll reda på brinntiden). 3. Objektiv För screening av vävnaden kan fluorescens torr 10X eller fluorescens oljeimmersion 16X objektiv användas. För högre förstoring och räkning av signaler rekommenderas endast fluorescens oljeimmersionsobjektiv, t.ex. 100X. 4. Filter Filter är individuellt utvecklade för specifika fluorokromer och måste väljas därefter. Dako rekommenderar användning av ett specifikt DAPI filter i kombination med ett Texas Red-/FITCdubbelfilter av hög kvalitet. DAPI-filter. Texas Red/FITC, dubbelfilter. Texas Red och FITC enkla filter kan användas för bekräftelse. Fluorokrom Excitationsvåglängd Emissionsvåglängd FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filter är specifika för varje mikroskoptyp och användning av rätta filter är mycket viktigt för tolkningen. Om du vill ha detaljerad information kontakta din mikroskopleverantör eller din Dakorepresentant. 5. Olja Icke-fluorescerande olja Försiktighetsåtgärder En 50 W kvicksilverlampa rekommenderas inte. Rhodaminfilter kan inte användas. Trippelfilter rekommenderas inte. Ett icke-optimerat mikroskop kan ge problem vid avläsning av fluorescenssignalerna. Det är viktigt att ljuskällan inte har passerat utgångsdatum och att den är riktigt inriktad och fokuserad. Kunden ska övervaka och följa tillverkarens rekommendationer för kvicksilverlampan. Mikroskopet ska underhållas och kvicksilverlampan ska vara rätt inriktad innan du försöker tolka resultaten. Man ska sträva efter att exponera provet så lite som möjligt för excitationsljuset för att minimera att fluorescensen bleknar. Vi rekommenderar att du diskuterar uppställningen av ditt särskilda mikroskop med tillverkaren innan du börjar med fluorescerande in situ hybridisering, eller tittar i litteraturen. P04092SE_02/K p. 33/37

34 Referenser 1. Wang JC. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol 2002;3: Austin CA, Marsh KL. Eukaryotic DNA topoisomerase II beta. Bioessays 1998;20: Roca J. The mechanisms of DNA topoisomerases. Trends Biochem Sci 1995;20: Tsai-Pflugfelder M, Liu LF, Liu AA, Tewey KM, Whang-Peng J, Knutsen T, et al. Cloning and sequencing of cdna encoding human DNA topoisomerase II and localization of the gene to chromosome region 17q Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85: Sng JH, Heaton VJ, Bell M, Maini P, Austin CA, Fisher LM. Molecular cloning and characterization of the human topoisomerase IIalpha and IIbeta genes: evidence for isoform evolution through gene duplication. Biochim Biophys Acta 1999;1444: Smith K, Houlbrook S, Greenall M, Carmichael J, Harris AL. Topoisomerase II alpha coamplification with erbb2 in human primary breast cancer and breast cancer cell lines: relationship to m-amsa and mitoxantrone sensitivity. Oncogene 1993;8: Petit T, Wilt M, Velten M, Millon R, Rodier JF, Borel C, et al. Comparative value of tumour grade, hormonal receptors, Ki-67, HER-2 and topoisomerase II alpha status as predictive markers in breast cancer patients treated with neoadjuvant anthracycline-based chemotherapy. Eur J Cancer 2004;40: Nakopoulou L, Lazaris AC, Kavantzas N, Alexandrou P, Athanassiadou P, Keramopoulos A, et al. DNA topoisomerase II-alpha immunoreactivity as a marker of tumor aggressiveness in invasive breast cancer. Pathobiology 2000;68: Durbecq V, Desmed C, Paesmans M, Cardoso F, Di Leo A, Mano M, et al. Correlation between topoisomerase-iialpha gene amplification and protein expression in HER-2 amplified breast cancer. Int J Oncol 2004;25: Mueller RE, Parkes RK, Andrulis I, O'Malley FP. Amplification of the TOP2A gene does not predict high levels of topoisomerase II alpha protein in human breast tumor samples. Genes Chromosomes Cancer 2004;39: Callagy G, Pharoah P, Chin SF, Sangan T, Daigo Y, Jackson L, et al. Identification and validation of prognostic markers in breast cancer with the complementary use of array-cgh and tissue microarrays. J Pathol 2005;205: Cardoso F, Durbecq V, Larsimont D, Paesmans M, Leroy JY, Rouas G, et al. Correlation be tween complete response to anthracycline-based chemotherapy and topoisomerase II-alpha gene amplification and protein overexpression in locally advanced/metastatic breast cancer. Int J Oncol 2004;24: Hande KR. Topoisomerase II inhibitors. Cancer Chemother Biol Response Modif 2003;21: Tewey KM, Rowe TC, Yang L, Halligan BD, Liu LF. Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian DNA topoisomerase II. Science 1984;226: Hortobagyi GN. Anthracyclines in the treatment of cancer. An overview. Drugs 1997;54 Suppl 4: Järvinen TA, Tanner M, Rantanen V, Barlund M, Borg A, Grenman S, et al. Amplification and deletion of topoisomerase IIα associate with ErbB-2 amplification and affect sensitivity to topoisomerase II inhibitor doxorubicin in breast cancer. Am J Pathol 2000;156: Coon JS, Marcus E, Gupta-Burt S, Seelig S, Jacobson K, Chen S, et al. Amplification and Overexpression of Topoisomerase IIalpha Predict Response to Anthracycline-based Therapy in Locally Advanced Breast Cancer. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Gancberg D, Larsimont D, Tanner M, Jarvinen T, Rouas G, et al. HER-2 amplification and topoisomerase IIalpha gene aberrations as predictive markers in nodepositive breast cancer patients randomly treated either with an anthracycline-based therapy or with cyclophosphamide, methotrexate, and 5-fluorouracil. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Cardoso F, Durbecq V, Giuliani R, Mano M, Atalay G, et al. Predictive molecular markers in the adjuvant therapy of breast cancer: state of the art in the year Int J Clin Oncol 2002;7: Park K, Kim J, Lim S, Han S. Topoisomerase II-alpha (topoii) and HER2 amplification in breast cancers and response to preoperative doxorubicin chemotherapy. Eur J Cancer 2003;39: P04092SE_02/K p. 34/37

35 21. Knoop AS, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen BB, Overgaard J, Nielsen KV, et al. Retrospective analysis of topoisomerase IIa amplifications and deletions as predictive markers in primary breast cancer patients randomly assigned to cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil or cyclophosphamide, epirubicin, and fluorouracil: Danish Breast Cancer Cooperative Group. J Clin Oncol 2005;23: Tanner M, Isola J, Wiklund T, Erikstein B, Kellokumpu-Lehtinen P, Malmstrom P, et al. Topoisomerase IIalpha gene amplification predicts favorable treatment response to tailored and dose-escalated anthracycline-based adjuvant chemotherapy in HER-2/neu-amplified breast cancer: Scandinavian Breast Group Trial J Clin Oncol 2006;24: O'Malley F, Chia S, Tu D, Shepherd L, Levine M, Huntsman D, et al. Prognostic and predictive value of topoisomerase II alpha in a randomized trial comparing CMF to CEF in premenopausal women with node positive breast cancer (NCIC CTG MA.5). Journal of Clinical Oncology, 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement): Press MF, Mass RD, Zhou JY, Sullivan-Halley J, Villalobos IE, Lieberman G, et al. Association of topoisomerase II-alpha (TOP2A) gene amplification with responsiveness to anthracycline-containing chemotherapy among women with metastatic breast cancer entered in the Herceptin H0648g pivotal clinical trial. In: ASCO Annual Meeting; Abstract No Slamon D, Eiermann W, Robert N, al. e. Phase III randomized trial comparing doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel (AC-T) with doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel and trastuzumab (AC-TH) with docetaxel, carboplatin and trastuzumab (TCH) in HER2 positive early breast cancer patients: BCIRG 006 study. Breast Cancer Res Treat 2005; 94: S5 (Abstr 1). 26. Harris L, Dressler L, Cowan D, Berry D, Cirrincione C, Broadwater G, et al. The role of HER- 2 + Topo IIa Amplification in predicting benefit form CAF dose escalation CALGB ASCO Annual Meeting; Abstract no Park K, Han S, Gwak GH, Kim HJ, Kim J, Kim KM. Topoisomerase II-alpha gene deletion is not frequent as its amplification in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2006;98(3): Villman K, Sjostrom J, Heikkila R, Hultborn R, Malmstrom P, Bengtsson NO, et al. TOP2A and HER2 gene amplification as predictors of response to anthracycline treatment in breast cancer. Acta Oncol 2006;45: Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Balslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol 2004;43: Knoop A, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen B, Overgaard J, During M, et al. TOP2A aberrations as predictive and prognostic marker in high-risk breast cancer patients. A randomized DBCG Trial (DBCG89D). In: Journal of Clinical Oncology, ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement), 2006: Järvinen TAH, Tanner M, Bärlund M, Borg Å, Isola J. Characterization of Topoisomerase IIα Gene Amplification and Deletion in Breast Cancer. Genes Chromosomes Cancer 1999;26: Jarvinen TA, Liu ET. Topoisomerase IIalpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer--more common than anticipated. Cytopathology 2003;14: Bofin AM, Ytterhus B, Hagmar BM. TOP2A and HER-2 gene amplification in fine needle aspirates from breast carcinomas. Cytopathology 2003;14: Pritchard KI, Shepherd LE, O'Malley FP, Andrulis IL, Tu D, Bramwell VH, et al. HER2 and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy. N Engl J Med 2006;354: Sledge GW, Jr. Is HER-2/neu a predictor of anthracycline utility? No. J Natl Cancer Inst Monogr 2001: Nielsen KV, Müller S, Poulsen TS, Gabs S, Schonau A. Combined Use of PNA and DNA for Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). In: Nielsen PE, editor. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. 2 ed. Norfolk: Horizon Bioscience; p P04092SE_02/K p. 35/37

36 37. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule C, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92: Ellis IO, Bartlett J, Dowsett M, Humphreys S, Jasani B, Miller K, et al. Best Practice No 176: Updated recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2004;57: Poole CJ, Earl HM, Hiller L, Dunn JA, Bathers S, Grieve RJ, et al. Epirubicin and cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil as adjuvant therapy for early breast cancer. N Engl J Med 2006;355: Group EBCTC. Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005;365: Kelleher M, Miles D. 21. The adjuvant treatment of breast cancer. Int J Clin Pract 2003;57: Jørgensen JT, Nielsen KV, Ejlertsen B. Pharmacodiagnostics and Targeted Therapies - A rational approach for individualizing medical anti-cancer therapy in breast cancer. Oncologist 2007;12: Ejlertsen B, Mouridsen HT, Jensen MB, Andersen J, Cold S, Edlund P, et al. Improved outcome from substituting methotrexate with epirubicin: Results from a randomised comparison of CMF versus CEF in patients with primary breast cancer. Eur J Cancer 2007;43: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16: P04092SE_02/K p. 36/37

37 Symbolförklaringar Katalognummer Temperaturbegränsning Batchkod In vitro diagnostisk medicinsk apparat Läs instruktionema för användning Får ej förvaras i direkt solljus (se avsnittet Förvaringsförhållanden) Innehållet räcker till <n> tester Använd före Tillverkare Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Revision Tillverkad av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tel Fax P04092SE_02/K p. 37/37