Finns det samband mellan orofarynx cancer och humant papillomvirus?

Institutionen för Kemi och Biomedicin Examensarbete Finns det samband mellan orofarynx cancer och humant papillomvirus? Isabell Persson Huvudområde: Farmaci Nivå: Grundnivå Nr: 2015:F6

Finns det samband mellan orofarynx cancer och humant papillomvirus? Isabell Persson Examensarbete i Farmaci 15 hp Filosofie kandidatexamen i Farmaci Farmaceutprogrammet 180 hp, Linnéuniversitetet, Kalmar Handledare Michael Lindberg Professor Examinator Thomas Näsström Lektor Institution för Naturvetenskap Linnéuniversitetet SE-391 82 Kalmar Institution för Naturvetenskap Linnéuniversitetet SE-391 82 Kalmar Sammanfattning Orofarynx cancer (OC) är en form av huvud och hals cancer (HNC) som är den sjätte vanligaste cancerformen i världen. Antalet fall av OC har fördubblats under de senaste 20 åren. Vanligen uppkommer cancern i skivepitelceller som klär insidan av orofarynx. Humant papillomvirus (HPV) är den vanligaste sexuella överförbara infektionen i världen. HPV smittas genom att hud eller slemhinnor kommer i kontakt med viruset. HPV delas in i högrisk (HR) och lågrisk (LR). HR typerna bär på två gener E6 och E7 som kodar för onkoproteinerna E6 och E7. Dessa två onkoproteiner krävs för utveckling av HPV-inducerad carcinogenes genom att inaktivera genetiska mekanismer som reglerar cellcykeln och apoptos. Livmoderhalscancer är den tredje vanligaste cancerformen i världen och väl känt att orsakas av HPV i cirka 98 % av alla fall. Syftet med studien var att undersöka om det förekommer liknande samband mellan HPV och OC som mellan HPV och livmoderhalscancer och att undersöka vilken HPV typ som är mest förekommande samt att studera vilka faktorer som medverkar vid utveckling av OC. Undersökningen genomfördes genom utvärdering av sex kliniska studier som hämtades från databasen PubMed. Studien visade att OC orsakades av HPV i 50 % till 83 % av fallen. HPV16 var det typ som stod för majoriteten av fallen. Rökning och alkohol var mer förknippade med HPV-negativa tumörprover jämfört med HPV-positiva tumörprover. Det finns ett samband mellan HPV-positiv OC och sexuella riskbeteenden. Slutsatsen är att det finns samband mellan HPV och OC som hos HPV och livmoderhalscancer samt att den vanligaste typen är HPV16. Miljöfaktorer som rökning och alkohol sågs inte ha någon koppling till HPV-positiva OC men däremot ses koppling till sexuella beteenden och marijuana användning. 2

SUMMARY Background- Cancer is a group of 200 different diseases that occurs when there is an imbalance between cell proliferation and apoptosis. Head and neck squamous cell cancer (HNSCC) is the sixth most common cancer worldwide. Oropharyngeal cancer (OPC) is a form of HNSCC, and causes approximately 60 000 cases worldwide per year. Oropharyngeal tissue includes four regions; tonsil, base of tongue, walls of the pharynx and the soft palate. There are over one hundred different human papillomavirus (HPV) described. HPV is the most common sexually transmitted infection and the virus is transmitted by direct contact. HPV infects squamous cells in skin and mucous tissues. The HPV that infects the mucous tissues can be divided into high-risk (HR) and low-risk (LR) types while HPV that infects the skin is only of the LR type. HR-types have two genes; E6 and E7 encoding two oncoproteins. The E6 and E7 oncoproteins are necessary for the development of carcinogenesis by inactivating the genetic mechanisms that regulate the cell cycle and apoptosis. Cervical cancer (CC) is known to be associated with HPV infections and in 98 % of the CC cases HPV genomes are found. The HPV16 type cause the majority of CC, found in about 54% of the cases while HPV18 genomes are detected in 16% of the CC cases. Objective- To investigate if there is any connection between OPC and HPV as it is between CC and HPV. If there is any connection, what is the most common HPVtype associated with OPC. If there are some environmental factors involved in the development of OPC. Methods - This is a literature study, which it is based upon six articles attempting to answer my question formulation. The articles were found through the database PubMed. Results The six studies showed that OC caused by HPV in 50 % to 83 % of the cases. HPV16 was the most common HPV-type in all studies and HPV-positive OC was more prevalent in patients who were non-smokers and drinking. In patients who were HPV-positive OC, was more associated with marijuana smoking and a high number of oral and vaginal-sex partners. Conclusions HPV was found to be involved in the development of OPC. The conclusion is that there is an association between HPV and OPC. The most common HPV-type is HPV16 as previously has been shown for CC. Environmental risk factor as smoking tobacco and drinking alcohol was more frequently in HPV-negative OPC than HPV-positive OPC. Sexually behavior and smoking marijuana was associated to HPV-positive OPC. 3

FÖRORD Detta arbete omfattar 10 veckors heltidsstudier vilket motsvarar 15 högskolepoäng. Arbetet ingår i Farmaceutprogrammet, 180 hp vid Linnéuniversitetet i Kalmar. Ett stort tack till min handledare Michael Lindberg för stöd och vägledning under dessa 10 veckor. Jag vill även tacka Tina Dalianis som har besvarat frågor samt hjälpt till med information till mitt arbete. Isabell Persson 4

INNEHÅLLSFÖRTECKNING SUMMARY... 3 FÖRORD... 4 FÖRKORTNINGAR... 7 INTRODUKTION... 8 Cancer... 8 Oropharynx cancer... 8 Symtom... 9 Stadium... 9 Undersökningar... 9 Behandlingar... 10 Livmoderhalscancer... 10 Humant papillomvirus... 10 SYFTE... 13 MATERIAL OCH METOD... 13 RESULTAT... 14 Studie 1. Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancer... 14 SYFTE... 14 STUDIEDESIGN... 14 RESULTAT... 15 Studie 2. Human papillomavirus infection as a risk factor for squamous-cell carcinoma of the head and neck... 16 SYFTE... 16 STUDIEDESIGN... 16 RESULTAT... 17 Studie 3. Human papillomavirus type 16 and squamous cell carcinoma of the head and neck... 18 SYFTE... 18 STUDIEDESIGN... 18 RESULTAT... 18 Studie 4. Tissue distribution of human papillomavirus 16 DNA integration in patients with tonsillar carcinoma... 19 5

SYFTE... 19 STUDIEDESIGN... 20 RESULTAT... 20 Studie 5. Case-control study of human papillomavirus and oropharyngeal cancer.. 20 SYFTE... 20 STUDIEDESIGN... 21 RESULTAT... 21 Studie 6. Distinct risk factor profiles of human papillomavirus type 16-positive and human papillomavirus type 16-negative head and neck cancers... 22 SYFTE... 22 STUDIEDESIGN... 22 RESULTAT... 23 DISKUSSION... 24 REFERENSER... 27 6

FÖRKORTNINGAR CC = cervical cancer CDK = cyklin beroende kinas DNA = deoxiribonukleinsyra E = early E2F = elongeringsfaktorn 2 F ELISA = enzymkopplad immunoabsorberande analys HNS = huvud och hals cancer HNSCC = huvud och hals skivepitelscells cancer HPV = humant papillomvirus HR = högrisk ICH = immunohistokemi IgG = immunoglobulin G ISH = in situ hybridisering L = late LCR = long control region LR = låg risk mrna = messenger ribonucleic acid OC = orofarynx cancer OPC = oropharyngeal cancer ORF = open reading frames ORI = origin of replication p16 = protein-16 p53 = protein-53 PCR = polymerase chain reaction PET = positronemissionstomografi prb = retinoblastomprotein 7

INTRODUKTION Cancer Cancer är inte en sjukdom utan ett samlingsnamn för omkring 200 olika sjukdomar. Cirka 58 000 fall av cancer diagnostiserades under 2012. Majoriteten av cancerpatienterna är över 65 år och det är ungefär lika många kvinnor och män som drabbas [1]. Människokroppen är uppbyggd av celler. Hos en frisk vuxen människa finns det en jämn balans mellan proliferation och apoptos av kroppens celler. Om cellcykeln inte är reglerad kan cellerna växa och prolifererar okontrollerat, dessa celler kallas neoplasi och kan ge upphov till tumörer. En för låg apoptos kan också leda till tumörbildning. Om de neoplastiska cellerna är isolerade och inte invasiva kallas tumören benign. En tumör kan ha egenskaper att invadera omgiven vävnad samt att vara invasiv och kallas då för malign tumör. En malign tumör anses vara cancer. På grund av cancercellernas invasivitet har de möjlighet att ta sig ut i blodeller lymfkärl och ge upphov till sekundära tumörer, så kallade metastaser. Den vanligaste cancertypen hos människan är carcinom och den uppkommer i epitelceller. Celler kan tappa sin kontroll över celldelningen genom somatiska mutationer i arvsmassan. För att cellen skall utvecklas till cancerceller krävs många ytterligare mutationer och epigenetiska faktorer. Cellens DNA förändras och leder till förändringar av proteiner och som i sin tur leder till tappad kontroll av celldelning. Miljöfaktorer som kemikalier, strålning och virus ökar utvecklingen av tumörer. DNA virus är den vanligaste virus typen som ger upphov till cancer. DNA virus stör cellcykelns reglering och/eller hämmar apoptos genom att bilda komplex med tumörsuppressor proteiner [2]. Oropharynx cancer Huvud och hals cancer (HNC) är den sjätte vanligaste cancerformen i världen. Till huvud och hals cancer tillhör cancer i munhålan, nasofarynx, orofarynx, sinonasal, hypofarynx och larynx. [3]. Orofarynx cancer (OC) står för cirka 60 000 globala fall och cirka 200 patienter drabbas i Sverige per år. Antalet fall i Sverige har fördubblats från 1980-talet till 2000-talet. Generellt är det fler män som drabbas av denna cancerform jämfört med kvinnor[3][4][5]. Cancern uppkommer ursprungligen från de tunna platta cellerna som kallas skivepitelceller, dessa klär insidan av orofarynx [6]. I låg frekvens kan cancern även uppstå från spottkörtlar i tungbas regionen [4]. 8

Orofarynx innefattar fyra regioner i den mellersta delen av svalget; tonsiller, tungbasen, väggarna i svalget samt den mjuka delen av gommen. Dessa fyra regioner medverkar vid tal och sväljning. Tonsill och tungbasen är de vanligaste drabbade regionerna som tillsammans står för 80 % av OC [4][7]. Symtom Tidiga symtom som uppkommer vid OC är obehag i halsen samt sveda vid intag av föda. Sena symtom som uppkommer är sväljningssvårigheter, grötigt tal, sväljningssmärtor, trismus och viktnedgång. De vanligaste symtomen som en patient söker vård för är att de upplever motstånd på halsen strax under käkvinkeln samt att de har strålande värk mot örat. Patienten söker oftast inte hjälp förrän tumören har blivit stor eftersom små tumörer ger obetydliga besvär[4]. Stadium Orofarynx bedöms i olika stadium. Stadium 0 är det stadium då abnorma celler har bildats i orofarynx slemhinna. I stadium I har de abnorma cellerna bildat cancer. Cancertumören är max två centimeter och endast belägen i orofarynx region. I stadium II är cancertumören mellan två till fyra centimeter och finns endast i orofarynx. I stadium III kan cancern antingen: vara max fyra centimeter samt ha spridit sig till en lymfkörtel. Eller, kan cancern vara större än fyra centimeter och har spridit sig till struplocket eller en lymfkörtel. I stadium IVa har cancern spridits vidare till struplock, muskler som används för att flytta tungan och för att tugga eller främre delen av gommen. Spridning till en eller flera lymfkörtel kan också förekomma. I stadium IVb omger tumören halspulsådern, samt spridning till muskler och ben som används för att öppna, stänga och att röra käken, nasofarynx samt till en eller flera lymfkörtlar. I det sista stadiet, IVc, har tumören spridit sig utanför orofarynx områden som till lungor, ben eller lever [8]. Undersökningar För att ta reda på om en patient har en tumör i orofarynx börjar man med ta fysiska prover. Patientens hälsovanor, tidigare sjukdomar och behandling diskuteras sedan görs en fullständig undersökning görs av munnen och halsen samt att läkaren känner efter om det finns svullna lymfkörtlar. Datomografi är en metod som används för att få detaljerade bilder från olika vinklar inne i kroppen. Magnetisk resonastomografi används för att få en mer detaljerad bild av området med hjälp av magnetiska radiovågor. Positronemissionstomografi scan (PET scan) är en metod som används för att detektera cancer celler i kroppen. Biopsi är en metod som avlägsnar celler eller vävnad som därefter studeras i mikroskop efter tecken på cancerceller [6]. 9

Behandlingar Det finns fyra standardbehandlingar som används vid OC. Den vanligaste behandlingstypen vid alla stadium är kirurgi. Cancertumören och lite av den friska intilliggande vävnaden tas bort i en operation. Strålbehandling är en annan metod som använder röntgenstrålar för att döda cancerceller vid orofarynx cancer. Kemoterapi inkluderar cytostatika som är läkemedel som används för att döda eller stoppa cancercellerna från att dela sig. Efter ett kirurgiskt ingrepp kan patienterna även få strålbehandling eller kemoterapi för att döda de sista cancercellerna samt att det minskar risken för cancern att återkomma. Riktad terapi är en behandlingsmetod som angriper specifika cancerceller. Monoklonala antikroppar är cancerbehandling som är en typ av riktad terapi [9]. Patienter i stadium I och II behandlas med strålning eller kirurgi. I stadium III och IV görs kirurgi följt av strålning. Kemoterapi kan ges tillsammans med strålbehandling [10]. Livmoderhalscancer Globalt sett är livmoderhalscancer den tredje vanligaste cancerformen och den största delen drabbar kvinnor i utvecklingsländerna [11]. I Sverige är det cirka 450 kvinnor som får diagnosen livmoderhalscancer varje år. Kvinnans medianålder för att insjukna i livmoderhalscancer är cirka 55 år [12]. Det finns samband mellan HPV och preneoplastiska skador och tumörer på slemhinnan i de anogenitala områdena. Cirka 40 HPV-typer infekterar de anogenitala regionerna [13]. HPV orsakar livmoderhalscancer i cirka 98 % av alla fallen. HPV typerna; 16, 18, 33 och 45 har en ökad risk för cellförändringar vilket kan ge upphov till livmoderhalscancer [12]. HPV16 är den mest förekommande typen och står för cirka 54 % och HPV18 står för cirka 16 % av fallen [13]. Humant papillomvirus Humant papillomvirus (HPV) tillhör familjen Papillomaviridae. Idag finns det ett hundratal olika HPV-typer beskrivna [14]. Papillomvirus är vävnadsbegränsande samt högt värd art-specifika [15]. 10

Det finns fem genus av HPV som infekterar människan; alfa, beta, gamma, mu och nu. Alfa släktet är de HPV typerna som omfattar hud och slemhinna. HPV infekterar skivepitelceller. Alfa-HPV typerna som smittar huden anses vara lågrisk (LR) medan de som smittar slemhinnan kan vara både LR och högrisk (HR) [16]. De vanligaste högrisktyperna är HPV 16 och HPV 18 och de vanligaste lågrisktyperna är HPV 6 och HPV 11. De som tillhör gruppen HR-HPV anses kunna orsaka cancer i livmoderhalsen, vulva, vagina, anal, penis, munhåla och svalg. Medan gruppen LR- HPV utgör kondylom, papillom och andra vanliga hudvårtor som inte är förknippade med cancer [14]. I hela världen klassas HPV som den vanligaste sexuellt överförbara infektionen. HPV smittas genom att hud eller slemhinnor kommer i kontakt med varandra. LR- HPV Infektion orsakar vårtor på händer och fötter eller i underlivet medan HR-HPV infektion ger inga symtom, alltså märks oftast inte en HR-HPV infektion [17]. HPV har ett cirkulärt dubbelsträngat deoxiribonukleinsyra (DNA) virus som består av 6800-8400 baspar. Viruspartikeln är 55 nm i diameter och bär inget hölje. HPV innehåller 9-10 open reading frames (ORF) som delas in i tidiga regioner (E= early) och sena regioner (L= late) [7][15]. Fem proteiner kodas av alla kända papillomvirus: E1, E2, E4, L1 och L2. Det finns en lång kontrollregion (LCR) hos alla papillomvirus och den är belägen mellan L1 och den första E kodande regionen [18]. I figur 1 visas HPV16 genomstruktur. Proteiner som kodar av L-ORF representerar strukturella virusproteiner. L1 och L2 utgör virus kapsiden. E-ORF representerar icke-strukturella proteiner. E1 och E2 initierar replikationen av virus genomet genom att binda till ett unikt origin of replication (ORI). E4 binder till cytoskelettets specifika strukturer. E5, E6 och E7 inducerar cellulär DNA-replikation [15]. HR HPV har E6 och E7 gener som kodar för onkoproteinerna E6 och E7. Papillomvirus som tillhör släktena; delta, alfa och kappa innehåller generna E5, E6 och E7 [18]. E6 och E7 onkoproteiner krävs för utveckling av HPV-inducerad carcinogenes. Onkoproteinerna har egenskaper som leder till inaktivering av genetiska mekanismer som reglerar cellcykeln och apoptos [19]. Hos värdcellen binder E6 och E7 till två viktiga tumörsuppressor proteiner[2]. E6 proteinet binder till tumör-supressor proteinet; p53 och bryter ner det. P53 är med i kontrollpunkten mellan G1 och S- fasen i cellcykeln genom att syntisera cyklin hämmare (p16, p21 och p27) som binder cyklin CDK komplex vid DNA-skador vilket blockerar övergången från G1 till S fas i cellcykeln. E7 onkoprotein binder och inaktiverar retinoblastomprotein (prb) vilket är en apoptos/tumör-suppressor protein. Vanligtvis binder prb till elongeringsfaktorn 2F (E2F) och hämmar transkriptionen av gener. Då E7 inaktiverar prb kommer proteinet inte kunna binda till E2F och transkriptionen kommer då att öka och cellen går in i S-fas [19]. 11

Figur 1. HPV16 genomstruktur, [7] Eftersom det inte går att odla HPV in vitro finns det utvecklade metoder för att detektera HPV-DNA i tumörprover. De mest använda teknikerna som använd för att detektera viralt DNA är polymeras chain reaction (PCR), in situ hybridisering (ISH) eller P16 immunohistokemi (IHC) [20]. I första hand analyseras HPV-DNA genom användning av formalinfixerade och paraffinbäddade vävnader [5]. Den metod som används mest för detektering och genotyping av HPV är PCR-amplifiering av DNA-sekvenser följt av hybridisering med dedikerade sonder. Detektering av HPV-DNA med PCR kan göras med konsensus primeruppsättning som binder till konservativa regioner, vilket möjliggör identifiering av många olika HPV-typer, medan vissa amplifierar en typspecifik DNA-sekvens [20]. Detektering av E6 och E7 messenger ribonucleic acid (mrna) görs för att analysera HPV biologiska aktivitet i tumörvävnader genom omvänd transkription som sedan genomgår realtids PCR [5]. ISH är en signalamplifierings metod som baserar sig på märkta sonder som binder till en eller flera typspecifika sekvenser av HR HPV-DNA. De vanligaste sonderna som används är för att identifiera HPV16/18 eller flera olika typer av HR-HPV [20]. P16 är ett protein som kodas av en tumör-suppressor gen som kallas CDKN2A. p16 är inblandad i reglering av negativ celltillväxt genom att hämma CDK4 som då inte kan fosforylera prb. Ett kännetecken vid en HR-HPV-relaterad cancer är överuttryck av p16. Därför kan p16 ICH analys användas som en surrogatmarkör för HPV transkription [20]. 12

SYFTE Syftet med detta arbete var att undersöka om det finns liknande samband mellan HPV och orofarynx cancer som mellan HPV och livmoderhalscancer. Om det finns samband mellan HPV och orofarynx cancer vilken HPV-typ är då vanligast och om det finns andra riskfaktorer som kan medverka med HPV att utveckla orofarynx cancer. De vetenskapliga frågeställningarna var således: - Finns det samband mellan HPV och orofarynx cancer? - Vilken HPV-typ är vanligast förekommande i orofarynx cancer? - Finns det andra faktorer som medverkar i utveckling av orofarynx cancer? MATERIAL OCH METOD Detta arbete är en litteraturstudie som omfattar sex studier. Litteratursökning gjordes via databasen PubMed genom Linnéuniversitetets bibliotek. Genom litteratursökningen erhölls matchande artiklar till frågeställningen. Sökorden som användes var human papillomavirus AND orofaryngeal cancer då sökningen begränsades till free full text erhölls 413 artiklar. Då sökorden human papillomavirua AND head and neck cancer användes och sökningen begränsades till free full text erhölls 1040 artiklar. Endast artiklar där patienter med OC medverkade inkluderades samt att de skulle undersöka om HPV fanns i tumörproverna med hjälp av detekteringsmetoder. Tabell I visare en översikt över de sex artiklar jag använt för att besvara mina vetenskapliga frågeställningar. Tabell I. Översikt över de artiklar som valdes ut. Nr: Referens: Rubrik: Syfte: 1 [21] Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers Klargöra den roll HPV har för att utveckla HNSCC. Samt att studera patienternas riskfaktor profiler. 2 [22] Human papillomavirus infection as a risk factor for squamous-cell carcinoma of the head and neck 3 [23] Human papillomavirus type 16 and squamous cell Utvärdera HPV-infektionen som en riskfaktor för utveckling av HNSCC. Undersöka förekomst och typ av HPV I HNSCC samt studera 13

carcinoma of the head and neck 4 [24] Tissue distribution of human papillomavirus 16 DNA integration in patients with tonsillar carcinoma 5 [25] Case-control study of human papillomavirus and oropharyngeal cancer 6 [26] Distinct risk factor profiles for human papillomavirus type 16-positive and human papillomavirus type 16- negative head and neck cancers eventuella riskfaktorers association med tumörerna. Urskilja sannolikhet samt tidpunkt för HPV integration under tumörbildningen i de övre luftvägarna. Undersöka vilka molekylära bevis det finns för att HPV orsakar OC. Jämföra riskfaktorer hos HPVpositiva och HPV-negativa patienter med HNSCC. RESULTAT Studie 1. Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancer [21]. SYFTE Studiens syfte var att genom virologisk analys av tumörprover klargöra den roll HPV har för att utveckla HNSCC, samt att studera patienternas riskfaktor profiler. STUDIEDESIGN I denna kliniska studie deltog 253 patienter med ny diagnostiserad eller återkommande HNSCC i USA. Studien gjordes från juni 1987 till oktober 1998. Majoriteten av deltagarna var män med en medianålder på 63 år. Från deltagarna togs tumörprover som studerades i mikroskop för att säkerhetsställa att proverna innehöll mer än 70 % DNA från tumörvävnad. DNA renades från proverna och sedan gjordes HPV detekteringsanalyser. 14

Genom användning av PCR-amplifiering med konsensus degenererade primers komplementära till L1 regionen på HPV, detekterades HPV genomsekvenser. För att identifiera olika HPV typer användes 33 typspecifika sonder för HPV samt HPV sonder som var en allmän blandning av; HPV16, 18, 51 och 66. De PCR-produkter som inte kunde typ specificeras men var positiva för HPV genomgick amplifiering och sekvensering. Alla tumörer DNA amplifierades för E7 regionen med typspecifika primers för att studera om de var positiva för HPV16 eller HPV18. Korstabeller och logistiska regressionsmodellering användes för att studera vilka faktorer som var förknippade med HPV. Genom logistisk regressionsmodell analyserades faktorer för synergisktiska effekter på HPV-statusen. RESULTAT Genom PCR-amplifiering med komplementära primers till L1-regionen av HPV, detekterades 55 (22 %) av 253 HPV-positiva tumörprover. Av de 55 HPV-positiva proverna var 49 identifierade som HPV16, tre tumörer som HPV33 och en tumör var både identifierad som HPV16 och 31. Från den allmänna blandningen av HPV sonder var två tumörer positiva för HPV. Den ena identifierades som HPV11 genom kloning och sekvensering av amplifierat DNA, den sista gick inte att typ specificeras. Ytterligare sju tumörer identifierades genom användning av typspecifika primers för E7 regionen. HPV16 stod för sex av sju fall och HPV18 för ett fall. Totalt fann de 62 (25 %) av 253 tumörer prover innehållande HPV-DNA, tabell II. HPV16 orsakat majoriteten av fallen, 56 (90 %) av 62. En HPV16 positiv tumör var även positiv för HPV31. De resterande 6 proverna som var HPV16 negativa men HPV positiva identifierades som; tre var HPV33, en var HPV18, ett prov från en laryngeal tumör förblev typ lös och den sista identifierades som HPV11 och var detekterad i en orofarynx tumör. HPV var mer sannolikt belägen i orofarynx tumörer. Tabell II. Patienterna resultat vid HPV detektering. Region Totalt (n=253) HPV-positiva (n=62) HPV-negativa (n=191) Orofarynx 60 (24 %) 34 (54 %) 26 (14 %) Munhålan 84 (33 %) 10 (16 %) 74 (39 %) Hypofarynx 21 (8 %) 2 (3 %) 19 (10 %) Larynx 86 (34 %) 16 (26 %) 70 (37 %) nasofarynx 2 (1 %) 0 (0 %) 2 (1 %) 15

Icke rökare var vanligare hos patienter som var HPV-positiva än HPV-negativa. De som räknades till gruppen rökare var nästan lika många bland båda grupperna. Patienter som inte drack eller hade en liten konsumtion av alkohol var vanligare hos HPV-positiva orofarynx. Men det fanns ingen statistiskt signifikans, tabell III. Tabell III. Översikt över patienternas faktorer. Miljöfaktorer HPV-positiv orofarynx (n=34) HPV-negativ orofarynx (n=26) Icke-rökare 7 1 Rökare (före detta och 27 24 nuvarande) Okänd - 1 Alkoholintag <10 29 11 Alkoholintag 10 5 11 okänd - 4 Alkoholintag var beräknad på intag av whiskey per vecka, en enhet var definierad som 10g alkohol. Studie 2. Human papillomavirus infection as a risk factor for squamous-cell carcinoma of the head and neck [22]. SYFTE Studiens syfte var att studera om HPV-infektioner medverkar som en riskfaktor i utvecklingen av HNSCC. STUDIEDESIGN I denna fall-kontroll studie ingick 292 patienter varav majoriteten av deltagarna var män. Det fanns en kontrollgrupp på 1568 personer som var fria från HNSCC. 16

Detektering av antikroppar mot HPV gjordes genom att använda standardenzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA), med baculovirusuttryckta kapsider innehållande proteinerna L1 och L2 (HPV16, 18 och 33) eller bara L- proteinet (HPV73). Användning av en biokemisk markör, kotinin, gjordes för att identifiera icke-rökare samt de som var måttligt till tunga rökare. Kotinin nivån mättes genom användning av en kvantitativ komparativ enzym immunoanalys metod. Med PCR-analys detekterades HPV-DNA i formalinfixerade paraffinbäddade tumörer hos de 160 patienterproverna. E6 och E7 typspecifika primers för HPV6, 11, 16, 18 och 33 testades för alla HPV-positiva prover. Negativa HPV-DNA prover testades för HPV16 med specifika primers. Statistisk analys gjordes enligt logistiska regressionsmodellen och Fischers exakta test användes. RESULTAT Seropositivitet för HPV16 bland patienterna var 12 % och hos kontrollpersonerna 7 %. De andra HPV typerna var lika bland patienter och kontrollpatienter, tabell IV. Försöket med kotinin visade en signifikant association med HPV16 seropositivitet, detta samband observerades inte hos HPV typerna; 18, 33 och 73. Oddskvoten för HNSCC ökade med ökade nivåer av kotinin. Det var endast HPV16 som visade sig vara en riskfaktor för HNSCC genom analysen med antikroppar. Tabell IV. Patienternas resultat vid ELISA för detektion av antikroppar för fyra HPV-typer. Antikroppar mot HPV Patienter kontroller Seropositiv för HPV16 35 (12 %) 102 (7 %) Seropositiv för HPV18 17 (6 %) 101 (6 %) Seropositiv för HPV33 22 (8 %) 154 (10 %) Seropositiv för HPV73 14 (5 %) 111 (7 %) Enligt PCR-analysen detekterades HPV16 DNA i 15 (9 %) av 160 patienter. HPV6 identifierades i ett fall, HPV11 i två fall och HPV33 i ett fall. Andra typer av HPV orsakade 14 fall. Tumörer innehållande HPV16 DNA var mest förekommande i orofarynx, tabell V. Tabell V. Patienternas resultat vid HPV detektering. 17

Region Totalt (n=160) HPV16-positiva (n=15) HPV16-negativa (n=145) Läppar 32 0 (0 %) 32 (100 %) Tungan 29 4 (14 %) 25 (86 %) Gommen 15 0 (0 %) 15 (100 %) Munhålan 15 0 (0 %) 15 (100 %) Orofarynx 18 9 (50 %) 9 (50 %) Nasofarynx 7 1 (14 %) 6 (86 %) Hypofarynx 8 0 (0 %) 8 (100 %) Näsa och bihålor 4 0 (0 %) 4 (100 %) Larynx 32 1 (3 %) 31 (97 %) Studie 3. Human papillomavirus type 16 and squamous cell carcinoma of the head and neck [23]. SYFTE Syftet med studien var att undersöka HPV förekomst och HPV typ i HNSCC. Samt att studera faktorers association med tumörerna. STUDIEDESIGN I denna kliniska studie medverkade 89 patienter från USA med HNSCC mellan 1994 och 1998. Majoriteten av patienterna som deltog var män och medianåldern var 59 år. Patienterna medverkade i en intervju där information om patientens riskfaktorer registrerades. Patientintervju användes för att undersöka riskfaktorernas koppling till HPV genom användning av X 2 och Fishers exakta test. Från tumörproverna extraherades DNA som sedan genomgick PCR amplifiering för att detektera HPV. PCR amplifiering gjordes av den virala L1-regionen med specifika primers. Sedan typspecificerades de PCR produkter som var positiva för HPV. RESULTAT 18

18 (20 %) av 89 tumörer var positiva för HPV. HPV16 stod för alla fallen. Orofarynx stod för 15 (83 %) av de 18 HPV16 positiva tumörerna. De resterande tre tumörerna som var positiva för HPV återfanns i munhålan och struphuvudet, tabell VI. Analysen av patientintervjun visade att HPV16 var förknippad med en mindre mängd intag av alkohol och mindre antal personer som röker jämfört med HPV-negativa gruppen, tabell VII. Tabell VI. patienternas resultat vid HPV detektering. Region Totalt (n=89) HPV-positiva (n=18) HPV-negativa (n=71) Munhålan 41 (46,1 %) 2 (11,1 %) 39 (55 %) Orofarynx 29 (32,6 %) 15 (83,3 %) 14 (19,7 %) Hypofarynx 4 (4,5 %) 0 (0 %) 4 (5,6 %) Larynx 10 (11,2 %) 1 (5,6 %) 0 (12,7 %) Andra 5 (5,6 %) 0 (0 %) 5 (7,0 %) Tabell VII. Översikt över patienternas riskfaktorer. Riskfaktorer HPV-positiva (n=18) HPV-negativa (n=71) Rökare 9 (50 %) 39 (54,9 %) Före detta och aldrig rökare 9 (50 %) 32 (45,1 %) Liten alkohol konsumtion 15 (93,8 %) 29 (7,1 %) Stor alkohol konsumtion 1 (6,2 %) 22 (52,9 %) Studie 4. Tissue distribution of human papillomavirus 16 DNA integration in patients with tonsillar carcinoma [24]. SYFTE Syftet med denna studie var att urskilja sannolikheten samt tidpunkten för HPV integration i tumörbildning i de övre luftvägarna. 19

STUDIEDESIGN I denna kliniska studie medverkade 176 patienter. Patienterna hade HNSCC från olika delar av huvud hals regionen. HPV16 in situ hybridisering med HPV16 typ specifik sond användes för att detektera HPV16 DNA. Hos åtta tumörprover från tonsiller gjordes en fördjupad utvärdering av HPV distribution. Dessa åtta valdes ut efter detektion av skivepitelcancer som var positiva för HPV16 genom in situ hybridisering, tonsill epitel med dysplasi samt patienter som genomgått bilateral tonsillektomi. Åtta kontrollpatienter var åldersmatchande och hade genomgått tonsillektomi utan neoplastisk sjukdom. En p16 immunohistokemi gjordes eftersom p16 är en surrogatmarkör för HPV16 infektioner. Statistisk analys gjordes för att studera vilka faktorer som är förknippade med orofarynx tumörer genom användning av Fishers exakta test. RESULTAT Orofarynx stod för 45 av 176 tumörer. Genom in situ hybridisering detekterades HPV16 i 38 (22 %) av 176 tumörprover. 37 av 38 tumörer med HPV16 DNA fanns i orofarynx och en hittades i en nonorofarynx region. 17 stycken HPV16 positiva tumörer uppstod i den bakre delen av tungan och 20 stycken HPV16 positiva tumörer uppstod i tonsillerna. p16 färgning var positiv i 31 av de 38 HPV16 positiva tumörerna och nio var p16 positiva hos de HPV16 negativa tumörproverna. 28 av 31 som var p16 positiva var detekterade i orofarynx tumörer. Hos de åtta patienter med tonsill tumörer med dysplasi fanns närvaro av HPV16 i alla fallen. Alla invasiva tonsill karcinom och dysplasier var p16 positiva. Studie 5. Case-control study of human papillomavirus and oropharyngeal cancer [25]. SYFTE Syftet med denna studie var att undersöka vilka molekylära bevis det finns för att HPV orsakar OC. 20

STUDIEDESIGN Denna studie är en fall-kontroll studie som gjordes i USA mellan 2000 och 2005. 100 patienter med diagnostiserad skivepitelcancer i orofarynx och 200 kontrollpatienter medverkade i studien. Majoriteten av deltagarna bestod av män och var mellan 50-64 år gamla. Data insamling gjordes genom att alla patienter fick genomgå en intervju där de fick besvara frågor om munhygien, rökning, alkohol, sjukdomshistoria, sexuella beteende med mera. Patienterna gjorde munsköljprover samt att den bakre orofarynxväggen penslades med en cytologi borste. Tumörprover från alla deltagare med OC genomgick in situ hybridisering för att detektera HPV16. DNA från orala proverna och prover från tumörerna renades och sedan analyserades för 37 typer av HPV. De använde sig då av en multiplex PCRanalys riktat mot det virala genomets L1-region med hjälp av specifika primers och därefter hybridisering till ett linjärt sondsystem. Genom användning av en realtids- PCR som var riktad till den E6 kodande regionen detekterades HPV16 virusmängd i de renade DNA:t. Serologisk analys gjordes genom användning av ELISA för att detektera serum antikroppar mot HPV16 L1 protein. Med ELISA detekterades även antikroppar mot HPV16 E6 och E7 onkoproteiner. Statistiska analyser av riskfaktorer kopplade till HPV-positiva prover gjordes med hjälp av logistiska regressionsmodeller samt användning av sannolikhetenförhållandetest för bestämning av statistisk signifikans. RESULTAT Genom in situ hybridisering detekterades HPV16 DNA hos 72 (72 %) av 100 patienter med OC. HPV33 identifierades i två prover, HPV35 i ett prov och i två prov identifierades både HPV16 och 33. Hos 64 (64 %) patienter med OC fann man hög förekomst av antikroppar för E6, E7 eller för båda, som är HPV16 onkoproteiner. Infektion med HPV16 var starkt associerat till OC. 57 av deltagarna med orofarynx tumör var seropositiva för HPV16 L1 protein. Antalet vaginala och orala sexpartners var starkt associerat med OC då analysen begränsades till tumörer som var positiva för HPV16. HPV16 positiv OC var förknippat med tidig sexdebut, tillfälliga partners och samlag utan kondom. Patienter som var seropositiva för HPV16 L1 eller hade en oral HPV16 infektion var förknippade med OC oavsett om de hade historia av tobak och alkohol eller inte. Inga tecken på synergi mellan HPV och tobak eller alkohol för utveckling av OC. 21

Studie 6. Distinct risk factor profiles of human papillomavirus type 16-positive and human papillomavirus type 16-negative head and neck cancers [26]. SYFTE Syftet med studien var att jämföra riskfaktorer hos HPV positiva och HPV negativa patienter med HNSCC. STUDIEDESIGN Denna studie är en fall kontroll studie som gjordes i USA mellan maj 2000 till juni 2006. 240 patienter medverkade i studien som hade fått en diagnos av HNSCC. 322 kontrollpatienter utan någon cancerdiagnos medverkade i studien. 100 av 240 patienterna med diagnos av HNSCC och 196 av 322 kontroll patienterna deltog i en tidigare studie, case- controll study of human papillomavirus and oropharyngeal cancer. Innan patienterna påbörjade sin behandling togs skölj prover från munnen och venöst blod från fall patienterna och på kontroll patienterna vid inskrivningen. Separering av serum från venöst blod och orala exfolerade celler från orala sköljprover genom centrifugering. Från patienterna erhölls formalinfixerande paraffinbäddade tumörprover och biopsiprover för detektering av HPV. I de paraffinbäddade tumörproverna detekterades HPV16 DNA genom in situ hybridisering. Proverna hybridiserades både till en DNA sond specifik för HPV16 och en plasmid-sond som negativ kontroll. DNA från tumörprover renades och screenades för 37 olika HPV typer genom multiplex PCR med specifika primers för L1 regionen. Med realtids konsensus PCR utformad för att amplifiera E6 och E7 regioner av det virala genomet, användes för att mäta HPV virusmängd för typerna 31, 33 och 35 i tumörprover. De orala sköljproven renades på DNA från fall- och kontrollpersonerna. För att detektera HPV16 DNA i proverna användes en realtids PCR metod som amplifierar det virala genomets E6 region. Genom ELISA analyserades serum för immunoglobulin G (IgG) antikroppar mot L1 proteiner för fyra HPV typer (HPV16, 18, 31 och35). 22

Alla patienter som medverkade i studien fick genomgå en intervju med uppgifter om riskbeteende. Användning av regressionsmodellen för att uppskatta oddskvoter för HPV16 positiva och negativa HNSCC associerad med riskfaktorer. RESULTAT Genom in situ hybridisering detekterades HPV16 DNA hos 92 av 240 tumörer. 82 av 92 tumörer som innehöll HPV16 DNA återfanns i orofarynx. Det fanns totalt 114 tumörer belägna i orofarynx, 72 % hade HPV16 DNA, tabell VIII. Två patienter som var HPV16 positiva var även positiv för antingen HPV33 eller HPV35. Fem patienter som var negativa för HPV16 var positiva för andra HPV typer. En var positiv för HPV31, två för HPV33, en för HPV35 och en för HPV59 genom konsensus PCR. Tabell VIII. Region Totalt (n=240) HPV16-positiva (n=92) HPV16-negativa (n=148) Orofarynx 114 82 (72 %) 25 (28 %) Bihålan 7 1 (14 %) 6 (86 %) Struphuvud 49 3 (6 %) 46 (94 %) Munhålan 54 2 (4 %) 52 (96 %) Hypofarynx 7 0 (0 %) 7 (100 %) Nasofarynx 3 0 (0 %) 3 (100 %) Annat 6 4 (67 %) 2 (33 %) De fann att alkohol och rökning ökar oddskvoten att drabbas av HPV16 negativ OC och oddskvoten ökade med ökande antal rökta cigaretter per dag eller intag av alkohol. Samt att oddskvoten minskade med ökad tid efter rökstopp. Detta var inget samband man fann hos patienter som var HPV16 positiva. Däremot var marijuanarökning starkt associerat med HPV16 positiva HNSCC och svagare associerat för HPV16 negativa patienter. Inga resultat visade att användandet av marijuana, alkohol och tobak hade någon synergisk effekt hos HPV16 positiva eller HPV16 negativa patienter. Det fanns samband mellan kronisk dålig munhygien med HPV16 negativa patienter men inte med HPV16 positiva patienter. Det fanns starka samband mellan HPV16 positiva tumörer och sexuella beteende som ökat antal vaginal eller orala sexpartner men inte hos patienter med HPV16 negativ tumörstatus. 23

DISKUSSION HNSCC är den sjätte vanligaste cancerformen i världen [3]. Förekomsten av HNSCC varierar kraftigt i världen. Cirka 405 000 fall av HNSCC inträffade under 2012 där majoriteten av fallen förekommer i utvecklingsländerna. På grund av HNSCC inträffade 21 100 dödsfall [18]. Under de tre senaste decennierna har HNSCC minskat men samtidigt har incidens av OC ökat i USA och Europa. Detta har lett till att HNSCC representeras av en högre andel av OC. Det är framförallt personer i åldern 40-55 år där ökningen ses [27]. I detta arbete har sex vetenskapliga studier använts för att besvara de vetenskapliga frågeställningarna. Den första studien [21] var en klinisk studie där metoden PCR användes för att detektera och typspecificera HPV hos patienter med HNSCC. Samt gjordes undersökning för att studera ifall det fanns riskfaktorer förknippade med HPV. I studien kom författarna fram till att totalt 62 tumörprover av 253 analyserade, innehöll HPV DNA. HPV16 tillhör högrisk grupp av HPV och det var den mest förekommande typen i proverna (56 av 62). De identifierade HPV16 främst i orofarynx tumörer. Samband mellan riskfaktorerna rökning och alkohol med HPVnegativ orofarynx var mer förekommande än hos patienter som var HPV-positiva. Dessa resultat tyder på att det finns en koppling mellan HPV och en delmängd av HNSCC. 54 % av HPV-positiva HNSCC fallen uppstod i orofarynx regionen. Den andra studien [22] var en fall-kontroll studie där patientprover analyserades med PCR för detektering och typspecificera HPV i proverna. Samt att detektering av antikroppar mot HPV gjordes genom ELISA. Författarna redovisade att seropositiviteten för HPV var nästan dubbelt så högre hos patienterna jämfört med kontroll patienterna. Genom PCR detekterades totalt 29 HPV-positiva tumörer. 15 var HPV16 och 9 av dessa detekterades i orofarynx. De andra 14 HPV-positiva tumörer som inte var HPV16-positiva, redovisades inte var de var belägna eller vilken HPV-typ de var. Den tredje studien [23] var en klinisk studie där patientproverna genomgick PCR för detektering och typspecificering av HPV patienterna fick genomgå en patientintervju som analyserades. Resultatet visade att 18 av 89 prover var positiva för HPV och alla fallen var av HPV typ 16. Orofarynx stod för 83,3 % av fallen. Analysen visade att HPV16 var associerad med en mindre mängd alkoholintag. Rökningen var lika i både HPV-positiva som negativa patienter. Den fjärde studien [24] var en klinisk studie där detektering av HPV16 genomfördes med in situ hybridisering i patienter med HNSCC. Åtta patienter med dysplasi i tonsillerna gjordes en fördjupad utvärdering av HPV. Resultatet visade att HPV16 var detekterat i 38 av 176 HNSCC prover. 37 HPV16 positiva tumörer återfanns i orofarynx. Hos de åtta patienter med dysplasi var positiva för HPV16 samt positiva för p16 vid ICH. 24

Den femte studien [25] var en fall kontroll studie där patienter med OC medverkade. Patienterna genomgick en patientintervju för analys av riskfaktorer. För att detektera HPV16 användes in situ hybridisering. De orala proverna analyserades med en multiplex PCR analys för 37 typer av HPV. Författarna kom fram till att genom in situ hybridisering detekterades 72 av 100 HPV16 positiva orofarynx tumörer. En infektion av HPV16 visade sig vara associerat med OC. Antalet vaginala och orala sexpartners var starkt förknippat med OC. Men inga kopplingar till varken alkohol eller tobak sågs. Den sjätte studien [26] var en fall kontroll studie där de jämförde riskfaktorer hos HPV positiva och HPV negativa patienter med HNSCC. HPV16 detekterades i tumörproverna genom in situ hybridisering. Samt gjordes en multiplex analys för 37 olika HPV typer. Realtids PCR användes för att detektera HPV16 i de orala sköljproverna. Alla patienter genomgick en intervju som analyserades för riskfaktorer. HPV16 detekterades hos 92 patienter av 240 prover med in situ hybridisering. 82 HPV16 positiva tumörer detekterades i orofarynx. två HPV16 positiva var även positiva för HPV33 eller HPV35. Fem patienter som var HPV16 negativa var positiva för andra HPV-typer. Alkohol och rökning och kronisk dålig munhygien var mer förknippat med HPV16 negativa OC. marijuanarökning var associerat med HPV16-positiva tumörer. Det fann starka samband mellan sexuellt beteende och HPV16 positiva tumörer. HPV kan orsaka cancer inte bara i orofarynx utan även på andra platser i kroppen som penis, livmoderhalsen, anal, munhåla, vulva och vagina [14]. I studierna 2, 5 och 6 gjordes analyser av förekomst av antikroppar för HPV i serum. Denna serologiska analys visar inte i vilka celltyper HPV infektionen har förekommit och därför kan riskuppskattningarna ha påverkats. En studie har undersökt om det finns samband mellan HPV, tobak och alkohol. Författarna till den ena studien [27 ] kom fram till att HNC som var positiva för HR- HPV var oberoende av patienternas historia av alkohol och tobak. Författarna till en annan studie [28] kom fram till att detektering av HPV var mer vanligt förekommande hos patienter som var icke-rökare. Resultaten från dessa två studier stämmer bra överens med resultaten från de studier jag använde för att besvara mina frågeställningar. En annan studie kom fram till att 26 % av de analyserade HNSCC fallen var HPV positiva där prelevansen var signifikant högre bland orofarynx fallen. HPV16 var den vanligaste förekommande HPV typen som detekterades, den stod för 86,7 % av all HPV positiva OC [29]. HPV16 har bekräftats från fler studie [30] att vara den vanligaste förekommande typen hos patienter med OC. Liknande resultat är framtagna från andra studier [31], där HPV16 var den mest förekommande HPV typen samt att HPV positiva OC har ökat. Från 16 % under 1984-1989 till 70 % under 2000-2004 i USA. Författarna beräknar att om incidentrenden fortsätter i USA kommer HPV-positiv OC fall vara fler än antalet livmoderhalscancrar år 2020. 25

HPV16 och HPV18 står för 70 % av livmoderhalscancer fallen. Den vanligaste typen är HPV16 som står för cirka 54 % och HPV18 står för cirka 16 % av fallen [13]. Detta visar att det är samma högrisk HPV som står för majoriteten av HPV-positiva livmoderhalscancrar fall och orofarynx fallen. Vid livmoderhalscancer finns det framtaget två globala vacciner; Cervarix (mot HPV16/18) och Gardasil (mot HPV6/11/ 16/18) som förebygger infektioner med HPV och därmed minskar utvecklingen av cancer [32]. Eftersom HPV16 står för majoriteten av livmoderhalscancer och OC, varför skulle inte vaccinerna ha en god effekt för att motverka HPV-infektioner på andra anatomiska regioner som orofarynx också? En studie [33] undersökte om HPV vaccin för livmoderhalscancer har samma effekt på orala HPV infektioner. Det var en dubbelblind kontrollerad randomiserad studie som gav kvinnor mellan 18-25 år antingen HPV16/18 vaccin och kontrollerna gavs hepatit A vaccin. Resultatet visade att HPV prelevansen efter vaccinationen var lägre bland kvinnorna som fått vaccin jämfört med kontrollgruppen. Detta resultat visar att vaccination ger ett starkt skydd mot oral HPV16/18 infektioner. Detta kan vara en bra förebyggande metod för HPV inducerad OC. I de sex studier som jag använde för att besvara min frågeställning var majoriteten av patienterna med OC män. I en randomiserad placebokontrollerad dubbelblind studie [34] gavs pojkar och män mellan 16-25 år, HVP-vaccin eller placebo. Resultatet visade att effekten av vaccinet förhindrar HPV-infektioner även hos män och där med kan incidensen av HPV-positiv OC förebyggas till en stor del. SLUTSATS Det finns samband mellan HPV och OC. Den vanligaste HPV typen är HPV16 som står för majoriteten av orofarynx fallen. Sexuella riskbeteende var mer associerat till HPV-positiv OC medan tobak och alkohol var mer associerat till HPV-negativ OC. 26

REFERENSER 1. https://www.cancerfonden.se/om-cancer/om-cancer ( Hämtad: 25-02-2015) 2. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Cancer. In: Molecular biology of the cell. 5. ed. New York: Taylor & Francis; 2008. p.1205-1266 3. Dalianis T. Human papillomavirus (HPV) and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Presse Med. 2014. 43: e429-e34. 4. http://www.cancercentrum.se/global/ocvast/cancersjukdomar/huvudhals/va rdprogram/huvudhals_regionalt_vp_nov2011.pdf (Hämtad: 20-01-2015) 5. Ramqvist T, Dalianis T. Oropharyngeal cancer epidemic and human papillomavirus. Emerg Infect Dis. 2010. 16: 1671-7. 6. http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/oropharyngeal/patient/pag e1. (Hämtad: 20-01-2015) 7. Dalianis T. Human papillomavirus and oropharyngeal cancer, the epidemics, and significance of additional clinical biomarkers for prediction of response to therapy. Int J Oncol. 2014. 44: 1799-805. 8. http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/oropharyngeal/patient/pag e2 (Hämtad: 22-01-2015) 9. http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/oropharyngeal/patient/pag e4 (Hämtad: 22-01-2015) 10. http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/oropharyngeal/patient/pag e5 (Hämtad: 22-01-2015) 11. Pedroza-Torres A, Lopez-Urrutia E, Garcia-Castillo V, Jacobo-Herrera N, Herrera LA, Peralta-Zaragoza O, et al. MicroRNAs in cervical cancer: evidences for a mirna profile deregulated by HPV and its impact on radioresistance. Molecules. 2014. 19: 6263-81. 12. https://www.cancerfonden.se/om-cancer/livmoderhalscancer (Hämtad: 25-02- 2015) 13. Ciesielska U, Nowinska K, Podhorska-Okolow M, Dziegiel P. The role of human papillomavirus in the malignant transformation of cervix epithelial cells and the importance of vaccination against this virus. Adv Clin Exp Med. 2012. 21: 235-44. 14. http://www.sahlgrenska.se/sv/su/omraden/4/verksamhetsomraden/laborato riemedicin/klinisk-mikrobiologi/analyslista-a-o/informationagens/humant-papillomvirus/ (Hämtad: 22-01-2015) 15. Bernard HU, Burk RD, devilliers EM, Hausen H. Papillomaviridae. In: King A, Adams M, Carstens E, Lefkowitz E. Virus taxonomy : ninth report of the 27

International Committee on Taxonomy of Viruses. 9.ed. Oxford: Elsevier; 2011. 235-239 16. Garbuglia AR. Human papillomavirus in head and neck cancer. Cancers (Basel). 2014. 6: 1705-26. 17. http://www.1177.se/kalmar-lan/fakta-och-rad/sjukdomar/hpv--vartvirus/ (Hämtad: 26-01-2015) 18. http://www.who.int/immunization/documents/hpvbgpaper_final_03_04_20 09.pdf?ua=1 (Hämtad: 10-02-2015) 19. Feller L, Wood NH, Khammissa RA, Lemmer J. Human papillomavirusmediated carcinogenesis and HPV-associated oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Part 1: human papillomavirus-mediated carcinogenesis. Head Face Med. 2010. 6: 14. 20. Mirghani H, Amen F, Moreau F, Guigay J, Ferchiou M, Melkane AE, et al. Human papilloma virus testing in oropharyngeal squamous cell carcinoma: what the clinician should know. Oral Oncol. 2014. 50: 1-9. 21. Gillison ML, Koch WM, Capone RB, Spafford M, Westra WH, Wu L, et al. Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers. J Natl Cancer Inst. 2000. 92: 709-20. 22. Sudbo J. Human papillomavirus infection as a risk factor for squamous-cell carcinoma of the head and neck. N Engl J Med. 2001. 345: 376-7. 23. Ringstrom E, Peters E, Hasegawa M, Posner M, Liu M, Kelsey KT. Human papillomavirus type 16 and squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Cancer Res. 2002. 8: 3187-92. 24. Begum S, Cao D, Gillison M, Zahurak M, Westra WH. Tissue distribution of human papillomavirus 16 DNA integration in patients with tonsillar carcinoma. Clin Cancer Res. 2005. 11: 5694-9. 25. D'Souza G, Kreimer AR, Viscidi R, Pawlita M, Fakhry C, Koch WM, et al. Case-control study of human papillomavirus and oropharyngeal cancer. N Engl J Med. 2007. 356: 1944-56 26. Gillison ML, D'Souza G, Westra W, Sugar E, Xiao W, Begum S, et al. Distinct risk factor profiles for human papillomavirus type 16-positive and human papillomavirus type 16-negative head and neck cancers. J Natl Cancer Inst. 2008. 100: 407-20. 27. Smith EM, Ritchie JM, Summersgill KF, Hoffman HT, Wang DH, Haugen TH, et al. Human papillomavirus in oral exfoliated cells and risk of head and neck cancer. J Natl Cancer Inst. 2004. 96: 449-55. 28. Herrero R, Castellsague X, Pawlita M, Lissowska J, Kee F, Balaram P, et al. Human papillomavirus and oral cancer: the International Agency for Research on Cancer multicenter study. J Natl Cancer Inst. 2003. 95: 1772-83. 28

29. Kreimer AR, Clifford GM, Boyle P, Franceschi S. Human papillomavirus types in head and neck squamous cell carcinomas worldwide: a systematic review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005. 14: 467-75. 30. D'Souza G, Gross ND, Pai SI, Haddad R, Anderson KS, Rajan S, et al. Oral human papillomavirus (HPV) infection in HPV-positive patients with oropharyngeal cancer and their partners. J Clin Oncol. 2014. 32: 2408-15. 31. Chaturvedi AK, Engels EA, Pfeiffer RM, Hernandez BY, Xiao W, Kim E, et al. Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States. J Clin Oncol. 2011. 29: 4294-301. 32. http://www.lakemedelsverket.se/hpv (Hämtad: 10-03-2015) 33. Herrero R, Quint W, Hildesheim A, Gonzalez P, Struijk L, Katki HA, et al. Reduced prevalence of oral human papillomavirus (HPV) 4 years after bivalent HPV vaccination in a randomized clinical trial in Costa Rica. PLoS One. 2013. 8: e68329. 34. Giuliano AR, Palefsky JM, Goldstone S, Moreira ED, Jr., Penny ME, Aranda C, et al. Efficacy of quadrivalent HPV vaccine against HPV Infection and disease in males. N Engl J Med. 2011. 364: 401-11. 29

391 82 Kalmar Tel 0480-446200 info@lnu.se Lnu.se 30