Livmodern, sperman och fostret hästreproduktionsforskning under två decennier MATS H T TROEDSSON Sperma deponeras direkt in i livmodern vid betäckning/seminering hos häst. Därför måste livmodern snabbt kunna rena sig så att alla bakterier och överblivna spermier är borta när embryot cirka fem dagar senare vandrar ut i livmodern från äggledaren. Vissa ston klarar inte denna rening och drabbas därför av tidig fosterdöd. Forskarna vet idag mycket om hur reningen och immunförsvaret i livmodern fungerar. Här beskrivs också forskning om hingstsperma och smittspridning via sperma. ATG har stött forskning inom såväl stogynekologi som hingstreproduktion. Större satsningar inkluderar en undersökning av kliniskgynekologiska och endokrinologiska faktorer i samband med tidig fosterdöd hos sto, och en kartläggning av livmoderns försvarsmekanismer hos ston. Dessa studier har resulterat i internationellt uppmärksammade kunskaper och nya skötsel- och behandlingsalternativ mot tidig fosterdöd och kronisk livmoderinflammation. Dessutom har forskningsanslag utgått för projekt rörande spermieproduktion och spermiekvalitet hos hingstsperma, och smittspridning av ekvin virusarterit (EVA) via hingstsperma. ATGs stöd till hästreproduktionforskning har varit mycket produktivt. Det har resulterat i över trettio artiklar i internationella vetenskapliga tidskrifter och ett flertal föredrag vid nationella och internationella hästkonferenser. I den här artikeln har författaren försökt belysa betydelsen av forskningsresultat från selekterade projekt under de senaste 20 åren. Klinisk-gynekologiska och endokrinologiska studier över tidig dräktighet hos sto Tidig fosterdöd hos ston förekommer vid 5 20 % av alla betäckningar. Orsakerna är inte alltid helt klara, men innefattar sannolikt immunologiska, endokrinologiska, fysiska, genetiska och medicinska faktorer, samt skötsel- och miljöfaktorer. Veterinärerna Hans Kindahl och Kerstin Darenius vid Institutionen för obstetrik och gynekologi vid SLU i Uppsala, studerade några av dessa faktorer i ett forskningsprojekt med anslag från ATG. Betydelsefulla slutsatser från projektet var:
Ultraljudsundersökning är ett värdefullt instrument för tidig diagnos av fosterdöd. Om fosterdöd sker efter det att endometrial cups har bildats, fortsätter produktionen av hormonet ekvint choriongonadotropin (ecg) under lång tid, vilket förhindrar stoet från att komma i brunst och bli betäckt under den innevarande säsongen. Behandling med flunixin meglumin under den tidiga dräktigheten hämmade frisättning av det gulkroppsnedbrytande hormonet PGF 2 och resulterade i en normal utveckling och livslängd av både den primära och de sekundära gulkropparna. Man mätte progesteronkoncentrationer men kunde dock med de resultaten inte entydigt fastslå att primär dysfunktion av gulkroppen är en orsak till tidig fosterdöd. Tillskottsbehandling med allyltrenbolon som är ett syntetiskt progesteron, resulterade i fortsatt dräktighet trots tillbakabildning av den primära gulkroppen. Kronisk livmoderinflammation och degenerativa (funktionsnedsättande) förändringar i livmoderslemhinnan är en vanlig orsak till tidig fosterdöd. Inseminering med färsk, kyld eller fryst sperma påverkar inte tidig fosterdöd, men valet av hingst tycks ha betydelse för risken för tidig fosterdöd. Vissa hingstar hade signifikant högre tidig fosterdöd hos de betäckta stona än andra. Skötselfaktorer tycks ha en avgörande roll för tidig fosterdöd. Livmoderns försvarsmekanismer hos sto Kronisk livmoderinflammation är den vanligaste orsaken till fruktsamhetsstörningar hos äldre ston. Eftersom sperma deponeras direkt in i livmodern under betäckning, är kontaminering med bakterier oundviklig och ston måste ha en väl utvecklad lokal försvarsmekanism för att rena livmodern från bakterier, smuts och även sperma som inte når äggledaren. Forskare från Kalifornien observerade att unga fruktsamma ston spontant renade livmodern från bakterier och blev dräktiga om de betäcktes under nästa brunst. Dessa ston klassificerades som resistenta mot livmoderinflammation. I kontrast till resistenta ston, identifierades en population av äldre ston med nedsatt fruktsamhet som saknade de resistenta stonas uppseendeväckande motståndskraft. De utvecklade istället en kronisk livmoderinflammation efter det att de var inokulerade med bakterier i livmodern, och klassificerades därför som känsliga för kronisk livmoderinflammation. Orsaken till den nedsatta motståndskraften mot livmoderinflammation hos känsliga ston var dock oklar. Forskare vid SLU lade grunden för flera års framgångsrik forskning rörande livmoderns försvarsmekanismer hos ston vid SLU (S. Einarsson, H. Rodriguez-Martinez, U. Magnusson) och vid University of California, Davis (M.H.T. Troedsson). Tre betydelsefulla komponenter av livmoderns försvar undersöktes: Immunoglobuliner (Ig, antikroppar) och komplementfaktorer, Det cellulära försvaret, vilket innefattar vita blodkroppar (bl a neutrofiler och makrofager), Det mekaniska försvaret, vilket innefattar dränering via cervix (livmoderhalsen) och lymfsystemet genom livmoderkontraktioner. Immunglobuliner och komplement i livmodern. I livmodern finns ett lokalt försvarsystem. Forskare vid SLU identifierade en lokal produktion av IgA och en sekretion av IgG till livmodern hos normala ston. Både IgA och IgG hittades i livmodersekret från ston efter inokulering av bakterier (Streptococcus zooepidemicus), men ingen skillnad observerades mellan resistenta och känsliga ston. Däremot observerades en ökad koncentration av en komplementfaktor (C3b) hos resistenta ston. Faktor C3b är ett betydelsefullt opsonin; ett ämne som underlättar vissa vita blodkroppars (neutrofilers) bindning till och uppätning (fagocytos) av bakterier. Mängden C3b ansågs ha betydelse för den olika grad av neutrofilfunktion som observerats hos resistenta respektive känsliga ston.
Det cellulära livmoderförsvaret. Funktionen hos neutrofiler från blodcirkulationen såväl som från livmodern hos resistenta och känsliga ston var jämförbar. Av intresse var emellertid att livmodersekret hos resistenta ston förbättrade fagocyteringsförmågan hos neutrofiler i jämförelse med känsliga ston. Tillsammans med observationen att resistenta ston hade högre koncentrationer av C3b i livmodersekretet, drogs slutsatsen att skillnader mellan resistenta och känsliga ston delvis kunde förklaras genom en minskad opsoniseringskapacitet i livmodersekretet hos känsliga ston. Orsaken till denna skillnad var emellertid inte helt klar. Det mekaniska livmoderförsvaret. Ett genomgående fynd i försöken rörande immunoglobuliner, komplement och neutrofilfunktion, var att känsliga ston ackumulerade mer vätska i livmodern i jämförelse med resistenta ston. Den ökade ansamlingen av vätska kvarstod också under en längre tid i livmodern hos de känsliga stona. Observationerna ledde till hypotesen att känsliga ston antingen producerade mer livmodervätska eller hade en nedsatt mekanisk reningsfunktion från livmodern. Ett försök utfördes i vilket livmodern hos såväl resistenta som känsliga ston inokulerades med bakterien Streptococcus zooepidemicus, och radioaktiva mikrosfärer. Mikrosfärerna upptäcks inte av immunförsvarets antikroppar och de är för stora för att fagocyteras av neutrofiler eller makrofager. Den enda möjligheten för mikrosfärerna att elimineras från livmodern var därför genom mekanisk utsöndring via cervix eller lymfsystemet i livmodern. Resultaten visade en signifikant nedsatt mekanisk rening från livmodern hos känsliga ston (Figur 1). Eftersom dessa fynd kunde förklara resultaten från tidigare studier av neutrofil- och komplementfunktionen hos resistenta och känsliga ston, inriktades fortsatta studier på att undersöka mekanismen bakom den nedsatta mekaniska reningen hos känsliga ston. Utsöndring av vätska genom cervix eller via livmoderns lymfsystem kräver effektiva livmoderkontraktioner. En modell utvecklades för att mäta livmoderkontraktioner genom multiple site elektromyografi (EMG). Inga skillnader kunde upptäckas mellan resistenta och känsliga ston vad beträffar vilokontraktioner hos livmodern under brunstcykeln. Inokulering av bakterier i livmodern utlöste kraftiga kontraktioner i två faser hos resistenta ston. Den första var en snabb reaktion till följd av frisättning av oxytocin och prostaglandin i samband med inokuleringen, och den andra en fördröjd reaktion till följd av den resulterande inflammationen. Känsliga ston hade ett nedsatt kontrak- 10 8 % radioaktivitet 6 4 2 0 24 48 96 Känsliga Resistenta Timmar efter inokulering Fig 1. Utsöndring av radioaktivt märkta mikrosfärer från livmodern hos ston som klassificerats som resistenta eller känsliga för kronisk livmoderinflammation. Känsliga ston hade en signifikant långsammare mekanisk rening av mikrosfärer från livmodern i jämförelse med resistenta ston.
70 60 EMG aktivitet (%) 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Timmar efter inokulering Känsliga Resistenta Fig 2. Elektromyografisk (EMG) livmoderaktivitet efter bakteriell inokulering av livmodern hos en grupp ston som klassificerats som resistenta och en grupp ston som klassificerats som känsliga för kronisk livmoderinflammation. Aktiviteten (EMG-aktivitet per tidsenhet uttryckt i procent) var signifikant högre hos resistenta ston i jämförelse med känsliga ston. tionsmönster efter inokulering av bakterier i livmodern (Figur 2). Försöken visade att livmoderkontraktioner spelar en avgörande roll i elimineringen av bakterier, inflammatoriska produkter, och vätska från livmodern. Vidare studier visade ett likartat förlopp när ston inseminerades med bakteriefri sperma, samt att livmoderkontraktioner stimulerades efter betäckning när ston tilläts ha fortsatt kontakt med en hingst. Dessa observationer var intressanta med tanke på den moderna hästhållningen i vilken hingsten ofta befinner sig på en annan ort, och stoet insemineras med transporterad färsk eller fryst sperma utan någon kontakt med en hingst. Som en uppföljning av dessa försök utfördes behandlingsförsök, i vilka det konstaterades att livmodersköljning med koksalt, eller behandling med prostaglandin eller oxytocin är effektiva alternativ till antibiotika som behandling av en akut livmoderinflammation efter betäckning. Behandlingen bör dock utföras mellan 6 och 24 timmar efter inseminering för att vara effektiv. Senare forskning har visat att livmoderinflammation efter betäckning/inseminering är orsakad av spermier lika väl som bakterier. Inflammationen är fysiologisk (normal) snarare än patologisk (sjuklig) med funktionen att rena livmodern från överblivna spermier, sädesvätska och bakteriell kontaminering i samband med betäckning. Ett problem uppstår emellertid hos känsliga ston, eftersom de saknar förmågan att fysiskt rena livmodern från inflammationen innan embryot gör sin entré in i livmodern cirka 5 dagar efter det att stoet släppt sitt ägg (ovulerat). Detta har rönt den största uppmärksamheten i skötseln av äldre känsliga ston med fertilitetsstörningar. Av intresse är också att sädesvätska tycks ha en avgörande roll i regleringen av betäckningsorsakad livmoderinflammation. Sädesvätska har visat sig kunna reglera komplementaktivering, fagocytos och förflyttning av neutrofiler från blodcirkulationen in i vävnader. Den kraftigare inflammationen som vanligen ses efter betäckning med fryst sperma kan möjligen förklaras med att sädesvätskan till största delen har tagits bort eftersom den är skadlig för spermier när de lagras. Ännu icke publicerade resultat indikerar att sädesvätska förkortar tiden som livmodern är inflammerad, och dessutom skyddar spermier från fagocytos av neutrofiler när ston insemineras mer än en gång under samma brunst. Typer av livmoderinflammation. En re-klassificering av livmoderinflammationer hos ston har föreslagits baserat på resultaten från ATG-stödd forskning om livmoderns försvarsmekanismer. 1. Venerisk livmoderinflammation. Orsakad
av t ex CEM (contagious equine endometritis, Taylorella equigenitalis), Pseudomonas spp och i viss mån Klebsiella spp och E. coli. Infektionen överförs från hingsten under betäckning. Denna typ av livmoderinflammation behandlas bäst med antibiotika och lämplig betäckningshygien. 2. Kronisk infektiös livmoderinflammation. Vanligen orsakad av Streptococcus zooepidemicus, E. coli, Pseudomonas spp, Klebsiella spp samt olika typer av jäst och svamp. Infektionen är resultatet av en kontaminering av livmodern i kombination med en nedsatt kapacitet hos livmoderns försvarsmekanismer. Denna typ av livmoderinflammation drabbar ofta ston med nedsatt yttre livmoderförsvar till följd av att de t ex suger in luft i vagina, lätt får pölar av urin kvar i vagina eller har skador på livmoderhalsen. Samtliga komponenter av livmoderns försvarsmekanismer är inblandade, men livmoderkontraktioner spelar förmodligen en central roll i spontan rening av mikroorganismer från livmodern. Om behandling sätts in inom 24 timmar efter föroreningen rekommenderas förebyggande behandling med oxytocin och/eller livmodersköljning med fysiologisk koksaltlösning. Behandling senare under sjukdomsförloppet bör innefatta lämpligt antibiotikum kombinerat med livmodersköljningar om stoet har en vätskeansamling i livmodern. 3. Kronisk betäckningsinducerad livmoderinflammation. Orsakad av fördröjd eller otillräcklig fysiologisk reaktion mot spermier. Dessa ston ska begränsas i antalet betäckningar per brunstcykel eftersom varje betäckning innebär en utmaning för livmodern. Onormal vätskeansamling i livmodern diagnostiseras med ultraljud 6 24 timmar efter betäckning (normala ston eliminerar vätska från livmodern inom 6 12 timmar efter betäckning). Om vätska observeras, insätts behandling med oxytocin och/eller livmodersköljning med fysiologisk koksaltlösning beroende på graden av vätskeansamling. Antibiotikabehandling är inte nödvändig för den här formen av livmoderinflammationer. De
Ston blir ibland dräktiga med två foster. En tvillingfödsel kan innebära stor risk för stoet och att ett eller båda fölen dör. Därför har forskarna utvecklat en metod för att abortera ett av fostren. Bilden visar abortering genom ultraljudsguidad hjärtinjektion i dag 115 av dräktigheten. rekommenderade skötsel- och behandlingsrutinerna har visat sig förbättra dräktighetsresultaten hos känsliga ston. 4. Kronisk degenerativ livmoderinflammation. Ses ofta hos äldre ston och karaktäriseras av fibrotiska förändringar (ökad mängd bindväv) i livmoderslemhinnan, framförallt runt körtlarna. Upprepade livmoderinflammationer kan ge upphov till degenerativa förändringar, och nyare forskningsrön pekar mot att dessa förändringar också är åldersrelaterade och kanske till och med en följd av normalt åldrande. Möjligen finns också en genetisk komponent. Behandling med mekanisk eller kemisk curretage (vävnadsretande substans, t ex klorhexidin) har föreslagits, men ingen behandling har visat en konsekvent förbättring av de patologiska förändringarna. Ston med kronisk degenerativ livmoderinflammation har dock högre risk att utveckla en kronisk infektiös eller betäckningsinducerad livmoderinflammation, och ska alltid betraktas som känsliga ston när de betäcks. Spermieproduktion och spermiekvalitet hos hingst En medveten avelsinriktning med avseende på prestation hos avkomman har inneburit att genetiska anlag för fruktsamhet hos hingstar har ignorerats inom aveln. Resultatet är att variationen i dagens hingstpopulation är stor med avseende på spermieproduktion och spermiekvalitet. Forskare vid SLU (L. Malmgren och H. Rodriguez-Martinez) har genomfört ett projekt avseende spermieproduktion och spermiekvalitet hos hingstar. Nya laboratoriemetoder för bedömning av spermakvalitet och fertilitet utarbetades och utvärderades i samarbete med forskare vid Veterinärhögskolan i Utrecht, Holland. Normalvärden för fluorescensfärgning och datoriserad bildanalys av spermier etablerades och har använts i vidare fertilitetsstudier hos svenska och internationella hingstar, samt för spermabedömning av färsk transportsperma under olika förutsättningar. Smittspridning från kroniskt EVA-smittad hingst via sperman vid olika betäckningsformer Ekvin virusarterit (EVA) kan spridas via sperman
från en smittad hingst till ett sto genom betäckning. Om det smittade stoet uppvisar kliniska luftvägssymptom, kan hon föra smittan vidare till högdräktiga ston som kan abortera. Sperma från symptomfria hingstar med kroniskt EVA-smittad sperma får därför inte exporteras inom EU eller till Canada, Australien, Sydafrika m fl länder. En stor andel av den svenska populationen av varmblod och travhästar har förhöjda antikroppstitrar mot EVA, och ett flertal populära avelshingstar har kroniskt smittad sperma. Veterinär Ann Gånheim vid Flyinge AB har tillsammans med forskare från Uppsala och USA (B. Klingeborn, P.J. Timoney, M.H.T. Troedsson) utfört en studie avseende smittspridning av EVA-smittad färsk, kyld och fryst sperma. Det kliniska, virologiska och serologiska svaret hos ston som inseminerats med smittad sperma undersöktes, och fertiliteten hos ett stort material av ston som inseminerats med smittad och icke-smittad sperma jämfördes. Samtliga ston smittades oavsett typ av sperma, och samtliga ston visade också milda kliniska symtom. Upprepade provtagningar från nässlemhinnan visade stora variationer med avseende på virusodling och s k PCRtest, medan samtliga ston fick antikroppar mot EVA efter betäckning. Dessa intressanta fynd väcker frågan om vilken den säkraste metoden att identifiera en smittad hingst är att leta efter virus eller efter antikroppar mot virus hos provbetäckta ston. Dräktighet, tidig fosterdöd, och levande föl-resultat påverkades inte av betäckning med smittad sperma. Sammanfattning Internationellt uppmärksammade, kliniskt betydelsefulla resultat inom stogynekologi och hingstreproduktion har producerats under de senaste 20 åren med hjälp av forskningsanslag från ATG. Detta har också möjliggjort internationella samarbeten mellan forskare i Sverige och utomlands, vilket har ökat synligheten av svensk hästreproduktionsforskning hos den internationella hästreproduktionskretsen av forskare och kliniker. LÄSA MER Håkansson A, Albihn A, Magnusson U, Rodriguez-Martinez H & Einarsson S. Nedsatt fruktsamhet hos sto: Nya metoder för att studera försvarsmekanismerna i livmodern. Svensk VetTidn 1991, 43, 107 110. Troedsson M H T. Uterine clearance and resistance to persistent endometritis in the mare. Theriogenology 1999, 52:3,461 471. Troedsson M H T, Scott M & Liu I K M. Comparative treatment of mares susceptible to chronic uterine infection. Am J Vet Res 1995, 4, 468 472. Darenius K. Early foetal death in the mare: Histological, bacteriological and cytological findings in the endometrium. Acta vet Scand 1992, 33, 147 160. Malmgren L. Sperm morphology in stallions in relation to fertility. Acta vet Scand 1992, Suppl 88, 39 47. Gånheim A, Troedsson M H T, Gånheim A E, Timoney P J, McCollum W H & Klingeborn B. Transmission of equine arteritis virus by a persistently infected stallion using raw, fresh-cooled and frozen semen. (Inskickad till Equine vet J).