Laborationsrapport Glattmuskulatur Caroline Johansson Jenny Sjösten Matilda Lithander Stina Lindberg
2 LINKÖPINGS UNIVERSITET LINKÖPING 2014-01-30 Syfte Syftet med laborationen är att förstå hur man konstruerar en dos-responskurva genom att studera hur tensionen i glattmuskulatur påverkas av olika tillsatta agonister och antagonister. Avsikten är också att skapa förståelse för begreppen kompetitiv och non-kompetitiv receptorantagonist, samt att kunna analysera dosresponskurvor och beräkna EC50-värden. Bakgrund Läkemedel kan verka som agonist, partiell agonist och antagonist vid en receptor. Agonist: ligand som binder receptorn och producerar en respons (=affinitet med efficacy). En full agonist kan både binda till en receptor och förmedla en respons så att den totala effektintensiteten blir 100 % i systemet som studeras. Partiell agonist: ligand med affinitet och efficacy, dock mindre än 100 %. En partiell agonist kan också binda till en receptor och förmedla en respons, men effektintensiteten blir dock mindre än den en full agonist kan förmedla. Antagonist: ligand som inte aktiverar receptorn (=affinitet utan efficacy). En antagonist binder till en receptor men förmedlar ingen respons. Det finns olika typer av antagonister: reversibel kompetitiv antagonist (d v s binder till samma bindningsställe på receptorn som agonisten men bindningen är reversibel), icke-kompetitiv antagonist (d v s binder till ett annat bindningsställe än agonisten) och irreversibel antagonist (d v s binder med så hög affinitet att agonisten inte, oavsett koncentration kring receptor, kan binda). Följande definitioner gäller för att man ska förstå skillnaderna mellan dessa: Ligand är en substans (t ex läkemedel) som kan binda till, och bilda ett komplex med, en biomolekyl (t ex receptor). Affinitet ( dragningskraft ) är ett mått på sannolikheten att en ligand kommer att interagera med sin receptor och bilda ett ligand-receptor-komplex. Efficacy är ett mått på den biologiska effektiviteten hos ett ligand-receptorkomplex, d v s förmågan en ligand har att producera en respons efter att den har bundit in till receptorn.
3 LINKÖPINGS UNIVERSITET LINKÖPING 2014-01-30 Den principiellt viktigaste skillnaden i effekt mellan de olika typerna av antagonism är att den reversibla kompetitiva antagonismen är möjlig att häva genom att öka koncentrationen av agonist (leder till en högerförskjutning av agonistens dos-responskurva), medan de övriga leder till lägre effekt av agonisten, oavsett koncentration. 1 Dos-responskurva Oftast är det den direkta effekten av ett läkemedel vi är intresserade av snarare än inbindning till en receptor. Detta kan framställas grafiskt som koncentration-effekt-grafer eller dos-responsgrafer. Här kan man se vilken koncentration eller dos av ett läkemedel som krävs för att uppnå en viss effekt. E max och EC50: Med hjälp av dessa grafer kan man estimera maximal effekt, E max, och den dos som krävs för att skapa ett halverat svar, EC50. Dessa värden är användbara då man vill jämföra olika preparat med varandra. 2 Yohimbin, prazosin, noradrenalin och propranolol Blodkärlens glatta muskulatur innehåller både α-receptorer och -receptorer som båda två har undergrupperna 1 och 2. Noradrenalin (NA) har en något större affinitet till α-receptorerna än - receptorerna, men kan ändå aktivera båda två. Vasokonstriktion sker genom stimulering av α-receptorerna som är G-protein-kopplade receptorer som vid aktivering leder till ökning av den intracellulära kalciumkoncentrationen och därmed leder till en kontraktion. 3 Prazosin är en selektiv α-1-antagonist och yohimbin är en selektiv α-2-antagonist. Propranolol är en potent icke-selektiv antagonist som blockerar både -1- och -2-receptorer. NA är en agonist med en vasokonstrigerande effekt som både binder till α- och -receptorerna. 4 1 Rang HP, Dale MM, Ritter JM, Flower RJ, Hendersson G (2012). Rang and Dales pharmacology. 7:e uppl. Elsevier. 2 Rang HP, Dale MM, Ritter JM, Flower RJ, Hendersson G (2012). Rang and Dales pharmacology. 7:e uppl. Elsevier. 3 Boron,W & Boulpaep E (2012). Medical physiology: a cellular and molecular approach. 2:a uppl. Philadelphia: Saunders Elsevier. 4 Rang HP, Dale MM, Ritter JM, Flower RJ, Hendersson G (2012). Rang and Dales pharmacology. 7:e uppl. Elsevier.
Metod 4 Kärlpreparatet, ca 1 cm brett, hade öppnats longitudinellt och monterats i organbad som innehöll Krebs bikarbonatbuffert, glukos och jämviktades med 95 % 0 2 och 5 % CO 2 vid 37. Detta för att preparatet skulle ha gott om näring och få en så autentiskt miljö som möjligt. Kärlpreparatet fixerades i ena änden i organbadet, den andra änden bands till en tensionsgivare. Tensionsgivaren var ansluten till en förstärkare som överför signalen från givaren till en bläckskrivare som momentant registrerade utslagen i vårt preparat. Tensionsförändringen mättes i gram som svarade till den tyngd artärväggens kontraktion skulle orkat lyfta. Totalt användes sex olika organbad med Krebs bikarbonatbuffert. Till dessa organbad hade man tillsatt propranolol. Material rtärpreparat Krebs bikarbonatbuffert: 40 ml stam I + 20 ml stam II + 940 ml destillerat vatten + 1 g glukos; landningen äm iktas med % CO2 och 95 % O2 vid 37 grader C. Noradrenalin (NA) 50 mg Prazosin: α-1-receptor-antagonist. Färdig lösning 10-3 M. Yohimbin: α-2-receptor-antagonist. Färdig lösning 10-3 M. Propranolol, receptor-antagonist. Färdig lösning. Utförande Vi ska studera dos-responssambandet för NA, med och utan olika adrenerga receptorantagonister. Vi hade sex olika organbad, till 3 av dem tillsattes 30 μl av prazosin och till två tillsattes 30 μl yohimbin så att slutkoncentrationerna i organbaden blev: Organbad 1: 10-9 M prazosin Organbad 2: 10-8 M prazosin Organbad 3: 3*10-8 M prazosin Organbad 4: 10-8 M yohimbin Organbad 5: 3*10-8 M yohimbin
Organbad 6: Kontroll Koncentrationerna vi skulle ha var angivna och vi fick fram dem genom att göra en spädningsserie på prazosin och yohimbin. Sedan gjorde vi ytterligare en spädningsserie på NA och fick fram 11 olika koncentrationer: 10-9, 3x10-9, 10-8, 3x10-8, 10-7, 3x10-7, 10-6, 3x10-6,10-5, 3x10-5 och 10-4 M. För att undersöka tensionsändringar tillsatte vi NA med ungefär två minuters mellanrum i en kumulativ dos i organbaden. Avslutningsvis tillsattes kalium för att få ett maxvärde på muskulaturens kontraktion. Värdena vi avläste användes sedan för att rita en dosresponskurva som nyttjades för att avgöra om antagonisterna är kompetitiva eller nonkompetitiva. 5 Resultat
6 EC50-värde Prazosin 10^-9 Prazosin 10^-8 Prazosin 3*10^-8 4,0*10^-6 1,5*10^-5 8,5*10^-5 Kontroll (NA) ------ EC50-värde Yohimbin 10^-8 Yohimbin 3*10^-8 4,5*10^-5 1,3*10^-5 Kontroll (NA) ------
Diskussion 7 Dos-responskurvorna ovan visar läkemedlens effekt, i detta fall graden av kontraktion, uttryckt i procent av max på Y-axeln. Denna står i relation till dosen av läkemedlet, i detta fall uttryckt som koncentration i lösning. Responsökning tillsammans med dosökning är alltså att vänta. Enligt teorin bör kontrollen med enbart NA ha gett högre respons, d v s större kontraktion, än yohimbin och prazosin vid motsvarande dos. I vårt fall har dock detta inte skett vilket kan bero på en mängd felkällor (se nedan). Bortser man från kontrollkurvan och istället jämför kurvorna för antagonister vid olika koncentrationer kan vi dock anta kvalificerade gissningar om vilken typ av antagonister vi behandlat med. Enligt grafen för Prazosin ser vi, om vi bortser från kontrollkurvan som vi antagit avviker från hur den borde uppträda, en högerförskjutning vid ökad koncentration, men effekten tycks inte uppgå till samma maxvärde utan faktiskt har ett högre maxvärde. Detta tror vi beror på att kontrollkurvan inte stämmer och borde uppnå samma eller högre maxvärde som graferna med antagonist. Prazosin skulle därför kunna vara en icke-reversibel kompetitiv antagonist som därmed inte kan konkurreras ut med ökad koncentration agonist. Men detta är svårt att säga helt säkert då vi inte ser kurvorna plana ut och därmed inte med säkerhet kan säga om vi uppnått maxrespons. Eftersom EC50-värdena är ett mått på hur bra antagonisterna fungerar kan man med dessa jämföra de olika antagonisterna i olika koncentration. Enligt de avläsningar som gjorts kan man se att potensen ökar med ökande koncentration i prazosins fall. Detta är så det borde vara då högre koncentration medför ett större antal aktiva molekyler som kan blockera agonistens effekt. Vi har inte antagit något EC50-värde för kontrollen med endast NA då denna är så pass opålitlig eftersom kurvan inte uppnår det maxvärde som den borde göra och för att kontrollen inte reagerade först på den ökande koncentrationen NA. Av dessa anledningar valde vi att endast jämför de olika antagonisternas EC50-värden med varandra. I yohimbins fall borde kurvan och EC50-värdena bete sig likadant som i prazosins fall, alltså högerförskjutas och EC50-värdena borde stiga med stigande koncentration NA, då samma mekanism ligger bakom, yohim in konkurrerar med N om α-1-receptorn precis som prazosin
8 LINKÖPINGS UNIVERSITET LINKÖPING 2014-01-30 gör med α-2-receptorn. Resultatet som uppnåddes var dock det motsatta, att en lägre koncentration yohimbin skulle ha högst potens och att en vänsterförskjutning av kurvan skett. Detta skulle kunna bero på att vi blandat ihop preparaten eller att andra störningar påverkade yohimbin 10^-8 så att full kontraktion ej uppnåddes. Under mätningen kunde stundtals en minskad kontraktion observeras i preparaten trots stigande koncentration av NA. En trolig förklaring till detta är att endotelet frisätter kvävemonoxid som svar på den inducerade kontraktionen. En observation som vi gjorde under studien var att i det organbad som vi tillsatt lägst koncentration av prazosin, reagerade med kontraktion före vår kontroll, d v s det organbad med bara NA. Detta borde teoretiskt inte inträffa då prazosin är en antagonist och borde hämma effekten av NA. Troligtvis beror detta på någon av felkällorna som kan uppstå vid försöken. Som man kan läsa ur kurvorna verkar något ha hänt med kontrollen då den efter tillsats av den näst starkaste koncentrationen vänder nedåt för att sedan vända uppåt igen. Detta kan bero på en felräkning i den volym NA som behövs för att uppnå de två högsta koncentrationerna. Felkällor Maximal respons vid varje koncentrationshöjning hade kanske inte nåtts innan nästa dos tillsattes. Mänskliga faktorn vid avläsning, t ex att man har glömt att ta i beaktning att sensibiliteten har ställts om. Eftersom det var flera utslag per koncentration var det svårt att veta vilken topp man skulle räkna på. Vi valde att räkna på maxtoppen. Vävnadspreparatens fysiologiska variationer för kontraktion. Fel vid uppsättning av organbad och preparat. Vår spädningsserie, avrundningsfel när vi räknade på den samt att det kan ha blivit fel med pipetteringen. Pipetteringsfel vid tillsättning av noradrenalin i organbad. Tekniska fel med bläckskrivaren, bläcket var svagt på vissa ställen och vi råkade stöta till den någon gång.
Noradrenalinets egenskaper, det hydrolyseras lätt av ljus och värme, därför skulle man linda in provrören med noradrenalin i aluminiumfolie och förvara det i is. Vi använde inte aluminiumfolie. 9
Referenser 10 Boron,W & Boulpaep E (2012). Medical physiology: a cellular and molecular approach. 2:a uppl. Philadelphia: Saunders Elsevier. Rang HP, Dale MM, Ritter JM, Flower RJ, Hendersson G (2012). Rang and Dales pharmacology. 7:e uppl. Elsevier. Robbins and Cotran (2010). Pathologic basis of disease. Åttonde upplagan. Philadelphia: Saunders Elsevier.