1 KOMMENTARER TILL KAPITEL 7 OCH 8 Den centrala dogmen är gemensam för eukaryoter och prokaryoter. DNA transkriberas till RNA som i sin tur translateras till proteiner. Genetiska skillnader mellan prokaryoter och eukaryoter. 1. Den genetiska informationen hos prokaryoter finns samlad i en ringsluten DNA-molekyl - kärnekvivalenten 2. Eftersom prokaryoter inte har någon kärna så sker det en kontinuerlig transkription och translation hos prokaryoter. Hos eukaryoter sker transkriptionen i kärnan, därefter transporteras mrna till cytoplasman där translationen sker. 3. Introner saknas hos de flesta prokaryoter, jfr fig.7.2 4. Två st DNA polymeraser: DNA polymeras I och DNA polymeras III deltar vid replikationen hos prokaryoter 5. Prokaryoter har en enda typ av RNA polymeras 6. Hos prokaryoter kan flera gener vara samlade i ett operon som transkriberas samtidigt - det bildas då ett polycistroniskt mrna Operon: en samling gener som har en gemensam promotor KOORDINERING AV METABOLISMEN Det krävs ca 2000 kemiska reaktioner för att en bakteriecell skall kunna tillväxa och föröka sig. Det finns inte en chans att var och en av dessa 2000 oberoende kemiska reaktioner automatiskt kan samarbeta med varandra för att ge en ordnad och effektiv tillväxt. Vi skall nu se hur en cell kan undvika kaos och i stället koordinera sina metaboliska reaktioner. Koordinering av biosyntesen Syntesen av byggstenar matchar deras användning i syntesen av makromolekyler och flödet av kol genom en reaktionsväg är koordinerat med flödet genom andra reaktionsvägar.
2 Koordinering av katabola förlopp Många bakterier kan utnyttja flera olika substrat som ger olika mängder av precursorer, energi och reducerande kraft. Men en cell behöver lika stora mängder av dessa produkter så det måste finnas mekanismer som justerar proportionerna av dessa produkter från de olika energigivande reaktionerna. Koordinering vid polymerisering En cells innehåll av makromolekyler beror inte i någon större utsträckning av tillväxtmediets sammansättning. Celler som växer på en blandning av aminosyror har t ex inte mer proteiner, på nukleosider inte mer nukleotider, på socker inte mer kolhydrater osv. Media med olika kemisk sammansättning producerar celler med identisk makromolekylär sammansättning. Dock kan tillväxthastigheten variera. Katabola förlopp, anabola förlopp samt polymeriseringar är utsatta för kraftfull kontroll för att bringa reda i allt kaos. En cell uttrycker ofta enbart de gener som den behöver i en speciell omgivning. En cell stänger ofta av de gener vars produkter stör andra processer som äger rum i cellen vid det tillfället. Celler reglerar också expressionen av sina gener som svar på differentieringsprocesser t ex sporulering. Den metaboliska kontrollen av reaktionerna i en cell sker främst på två plan: 1. Kontroll av enzymaktiviteten 2. Kontroll av genexpressionen (genuttrycket)- reglering av transkriptionen Båda typerna av regleringsmekanismer involverar allosteriska proteiner och effektorer - lågmolekylära föreningar. Effektorerna kan antingen vara metaboliska intermediärer eller komponenter i omgivningen. Allosteriska proteiner är antingen regulatoriska - saknar enzymatisk aktivitet, modulerar syntes av olika enzymer eller sk allosteriska enzymer, jfr fig. 8.3.
3 Koncentrationen av effektormolekyler styr de allosteriska proteinernas egenskaper. 1. Kontroll av enzymaktiviteten a. Kovalent modifiering (fosforylering, adenylering..) b. Allosteri (olika form) Vanligast vid anabola förlopp. En viktig mekanism för kontroll av enzymaktiviteten är feedback inhibering (slutproduktinhibering), jfr fig. 8.2, 8.3, 8.4 och 8.5. ). En slutprodukt inhiberar aktiviteten av ett tidigt enzym (ofta första enzymet) i dess biosyntes. De efterföljande enzymen blir då utan substrat och syntesen av slutprodukten upphör. Snabb regleringsmekanism. Katabola förlopp Det finns inga unika tidiga reaktioner men ändå förekommer både positiva och negativa allostera interaktioner. 2. Reglering av transkriptionen Inbegriper både anabola och katabola förlopp. Katabola förlopp: Närvaron av ett specifikt substrat inducerar ofta enzymer som kan omsätta detta. Anabola förlopp: Åtskilliga kontrollmekanismer som reglerar synteshastigheten överskott av enzymer eller slutprodukter undviks. Transkriptionen av ett bakteriellt operon regleras genom produkterna av sk regulatorgener - ofta repressorer och aktivatorer (allosteriska proteiner). Dessa binder nära operonets promotor (bindningssäte för RNA-polymeras) och reglerar transkriptionen från promotorn. Repressorer och aktivatorer arbetar på olika sätt. Repressorer binder till operatorn (en DNA sekvens i direkt anslutning till promotorn) och stänger av promotorn transkriptionen förhindras.
4 Aktivatorer binder till ett aktivatorsäte (uppströms från promotorn) och slår på promotorn transkriptionen underlättas. Negativ kontroll: Om ett regulatorprotein stänger av expressionen av ett operon står operonet under negativ kontroll av det regulatorproteinet. Ett operon som regleras av en repressor är därför negativt reglerat. Positiv kontroll: Om ett regulatorprotein slår på operonet står operonet under positiv kontroll av det regulatorproteinet. Ett operon som regleras av en aktivator är positivt reglerat. Operoner som ofta behövs brukar vara positivt reglerade. En effektor som binder till en repressor eller aktivator och därmed initierar transkription av ett operon kallas induktor (inducer), jfr fig. 8.14 och 8.15. En effektor som binder till en repressor och orsakar att den blockerar transkriptionen kallas corepressor, jfr fig. 8.13. Enzymer som är inblandade i bruket av kol- och energikällor kodas ofta av operoner som för det mesta är avstängda och kontrolleras genom induktion. Substratet eller en närbesläktad substans fungerar som inducer = en effektor som binder till det regulatoriska proteinet och antingen hindrar det från att binda eller hjälper det att binda till ett aktivatorsäte. Operoner som kodar för biosyntetiska enzymer är oftast påslagna såvida slutprodukten inte finns närvarande. Allmänt kan man säga att en effektivare kontroll kan upprätthållas om det är olika reaktionsvägar och olika enzymer i anabolism och katabolism. Katabolitrepression: En bakterie utnyttjar den kolkälla, kvävekälla etc först som är lättast att omsätta. Glukos är en viktig kolkälla och för nedbrytning av glukos finns alla enzymer tillgängliga (konstitutiva enzymer). För nedbrytning av laktos krävs att vissa enzymer nysyntetiseras (inducerbara enzymer). Laktos står under katabolitrepression av glukos, jfr fig. 8.18. Detta är en typ av global regleringsmekanism. Allmänt: Substrat som utnyttjas lätt av konstitutiva enzymer orsakar katabolitrepression av inducerbara vägar.
5 Reglering av laktos-operonet används ofta som ett exempel vid beskrivning av katabolitrepression. Detta operon är både positivt och negativt reglerat, jfr fig. 8.20. Lacoperonet Regleras både positivt och negativt. Jacob och Monod, 1961, operonmodellen. Tre strukturella gener som kodar för β -galaktosidas, permeas och transacetylas. Inducer: Allolaktos en laktosisomer Repressor: Lac-repressor tetramer med identiska monomerer syntetiseras konstitutivt. Cykliskt AMP (camp) central molekyl E.coli innehåller ett cykliskt AMP receptor protein CAP-proteinet (CRPproteinet) som bildar ett komplex med camp. camp-cap aktivator för lacoperonet. ATP camp + PP i Adenylatcyklas Hög glukoshalt låg halt camp Låg glukoshalt hög halt camp Adenylatcyklas har hög aktivitet endast om komponenterna i sockertransportsystemet är fosforylerade, vilket de är i frånvaro av transportabla socker t ex glukos. I närvaro av både laktos och glukos så binder lac-repressorn till laktos (allolaktos) men trots detta transkriberas inte lac-operonet effektivt då det kräver en aktivator, camp-cap. Denna fungerar inte förrän halten glukos har sjunkit och därmed halten camp stigit. Galaktos, maltos, arabinos mfl är socker som är utsatta för katabolitrepression av glukos.
6 Glukos förhindrar intransport av inducerbara substrat. Attenuering Uppträder då cellerna svälts m.a.p. t ex tryptofan. Under normala förhållanden stoppas 9 av 10 transkript innan de når strukturgenerna. Hur styrs detta? Inga specifika proteiner är inblandade istället finns en interaktion mellan nygjort transkript, ribosomer, trna, tryptofan och tryptofanyl-trna-syntetas. Promotorn i try-operonet är separerad från de första strukturgenerna genom en sk. leader-sekvens (trpl) 162 bp. Dennea leader-peptidsekvens innehåller 14 aminosyrakodon. Två av dessa är try-kodon (ovanligt). Dessutom finns också AUG-startkodon och bindningssäte för ribosomen jfr fig. 8.24. Det finns också segment 1-4 som kan ge olika basparningsstrukturer olika stam-ögla-strukturer. 1:2 pausögla, 3:4 terminatorögla eller 2:3 antiterminatorögla. Vid position 140 finns ett terminatorsäte med en sekvens av 8U (3:4). Utom vid svält stoppar 9 av 10 transkript här. Ett RNA-polymeras initierar transkriptionen vid promotorn. En ribosom som translaterar det korta trpl-transkriptet bestämmer om RNA-polymeraset downstream - skall passera terminatorsätet eller inte. Den första specialstrukturen som bildas är 1:2-öglan. Den ser till att polymeraset stannar upp. Ribosomen binder och startar translationen, komplexet löses upp och transkriptionen fortsätter till position 140 och 3:4-öglan bildas karakteristisk ρ-oberoende terminator. Men! Leaderpeptiden kan modulera termineringen genom att det finns två trykodon (ovanligt 1 aminosyra/100 är tryptofan). Ribosomen träffar på dessa trykodon. Om det finns ont om tryptofan finns det ont om laddade trna try och då stannar ribosomen. I detta fall har den stam som bildats av segmenten 1:2 lösts upp, vilket tillåter att en stam mellan segmenten 2:3 bildas. Detta i sin tur förhindrar en bildning av en terminatorstruktur mellan segmenten 3 och 4 RNA-P kan fortsätta transkriptionen strukturgenerna uttrycks jfr fig. 8.25. Om det är gott om tryptofan så finns det gott om laddade trna try 3:4-ögla terminering. Vad tjänar en cell på att öka potentialen av try-operonet 1000 ggr istf 100 ggr? Osäkert kan ha evolutionär betydelse.
Det finns aminosyraoperoner som enbart kontrolleras genom attenuering. 7