Dessa instruktioner används för Dako EnVision+ Dual Link System-HRP (DAB+).

Dako EnVision + Dual Link System-HRP (DAB+) Kod K4065 Avsedd användning För in vitro-diagnostik. Dessa instruktioner används för Dako EnVision+ Dual Link System-HRP (DAB+). Denna sats är avsedd för användning med primärantikroppar från mus och kanin, som tillhandahållits av användaren, för kvalitativ identifiering av antigener genom ljusmikroskopi i normala och patologiska paraffininbäddade vävnader, kryostatvävnader eller cellpreparat. Vävnaderna som behandlats i flera olika fixativ, inklusive etanol, B-5, Bouins, zinkformalin och neutralbuffrat formalin, kan användas. Sammanfattning och förklaring Procedurprincip Medföljande reagenser EnVision+ Dual Link System-HRP är en IHC-färgningsmetod i två steg. Detta system är baserat på en HRPmärkt polymer som är konjugerad med sekundära antikroppar. Den märkta polymeren innehåller inte avidin eller biotin. Följaktligen elimineras eller reduceras signifikant icke-specifik färgning som resulterar av endogen avidin-biotinaktivitet i lever, njure, lymfvävnader och kryostatsnitt. Alla reagenser i EnVision+ Dual Link System- HRP med substrat (utom flytande DAB+ substrat-kromogen) är bruksfärdiga. Detta system är en mycket känslig metod och därför är optimala spädningar av primärantikroppen upp till 20 gånger högre än dem som används för traditionell PAP-metod och flerfaldigt högre än dem som används för traditionella ABC- eller LSAB-metoder. Detta protokoll ger ett förstärkt signalgenererande system för detektion av antigener som är närvarande i låga koncentrationer eller för primärantikroppar med låg titer. Primärantikroppar, som framställts i mus eller kanin, reagerar väl med den märkta polymeren. Tolkningen av all positiv färgning eller frånvaro av färgning måste kompletteras med morfologiska och histologiska undersökningar och korrekta kontroller. All endogen peroxidasaktivitet släcks genom att inkubera provet i 5-10 minuter med Dual Endogenous Enzyme Block. Provet inkuberas sedan med en lämpligt karakteriserad och spädd primärantikropp från mus eller kanin, följt av inkubation med den märkta polymeren med en rekommenderad inkubationstid på 30 minuter för varje. Det bör noteras att för antikroppar som kräver enzymnedbrytning eller target retrieval kan det vara nödvändigt att öka inkubationstiderna med 5 10 minuter för primärantikroppen och den märkta polymeren. Färgningen fullbordas genom en inkubation på 5 10 minuter med 3,3 -diaminobensidin (DAB+) substrat-kromogen, som resulterar i en brunfärgad fällning vid antigenstället. (DAB är en potentiell karcinogen; se avsnittet om Försiktighetsåtgärder.) Kod K4065 Följande material, tillräckligt för 150 vävnadssnitt baserat på 100 µl per snitt, ingår i denna sats: Kvantitet Beskrivning 1 x 15 ml Dual Endogenous Enzyme Block 0,3 % väteperoxid innehållande natriumazid och levamisol 1 x 15 ml Märkt polymer Peroxidasmärkt polymer som konjugerats till get-antimus- och get-anti-kaninimmunoglobuliner i Tris-HCl-buffert innehållande stabiliserande protein och antimikrobiellt medel 1 x 18 ml Substratbuffert Substratbuffertlösning, ph 7,5, innehållande väteperoxid och ett konserveringsmedel 1 x 1 ml DAB+ kromogen 3,3'-diaminobensidin i kromogenlösning (127989-001) P04048SE_01/K4065/2015.07 s. 1/6

Material som behövs, men inte ingår Försiktighetsåtgärder Avjoniserat eller destillerat vatten Etanol, absolut och 95 % Xylen, toluen eller xylensubstitut Primärantikroppar och negativt kontrollreagens Objektglas, poly-l-lysinbelagda eller Silanized Slides (kod S3003) (se Vidhäftning av paraffininbäddad vävnad) Kontrollvävnad, positiv och negativ Ammoniumhydroxid, 15 mol/l spädd till 0,037 mol/l Kontrastfärg, vattenbaserad t.ex. Mayer s Hematoxylin eller Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (kod S3002 för automatiserad användning, kod S3001 för manuell användning) (se avsnittet Reagensberedning) Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use (kod S3025) rekommenderas för vattenbaserad montering, eller icke-vattenbaserat permanent monteringsmedium, Ultramount (kod S1964) eller Permanent Mounting Medium (kod S3026) Täckglas Ljusmikroskop (20x 800x) Absorberande savetter Färgningskärl eller -bad Tidtagarur (som kan mäta 3 40 minuters intervall) Tvättflaskor Tvättbuffertlösning, t.ex. Automation Buffer (kod S3006), TBS (kod S3001) eller PBS (kod S3024) 1. För yrkesanvändning. 2. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan NaN 3, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten vid kassering så att inte metallazider ackumuleras i avloppet. 3. Substituera inte reagenser från andra partinummer eller från satser från andra tillverkare. 4. Enzymer och substrat-kromogener kan påverkas negativt om de utsätts för alltför höga ljusnivåer. Förvara inte satskomponenter och utför inte färgningen i starkt ljus, t.ex. direkt solljus. 5. Andra inkubationstider eller temperaturer än dem som specificeras kan ge felaktiga resultat. Användaren måste validera alla sådana ändringar. 1 6. Liksom med alla produkter av biologiskt ursprung måste korrekta procedurer användas vid hanteringen. 7. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögonen och huden. 8. Oanvänd lösning ska kasseras i enlighet med lokala och statliga föreskrifter. 9. Datablad för materialsäkerhet finns tillgängliga för professionella användare på begäran. Fara Dual Endogenous Enzyme Block: <0.1% 3(2H)-Isothiazolone, 5-chloro-2-methyl-, mixt. with 2-methyl- 3(2H)-isothiazolone H314 Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. H317 Kan orsaka allergisk hudreaktion. P280 Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. P261 Undvik att inandas ångor. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P272 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P330 + P331 P303 + P361 + P353 + P363 + P310 P302 + P352 P333 + P313 P305 + P351 + P338 + P310 P405 P501 Nedstänkta arbetskläder får inte avlägsnas från arbetsplatsen. VID INANDNING: Flytta personen till frisk luft och se till att han eller hon vilar i en ställning som underlättar andningen. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller en läkare. VID FÖRTÄRING: Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller en läkare. Skölj munnen. Framkalla INTE kräkning. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten eller duscha. Nedstänkta kläder ska tvättas innan de används igen. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller en läkare. VID HUDKONTAKT: Tvätta med mycket vatten/ Vid hudirritation eller utslag: Sök läkarhjälp. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller en läkare. Förvaras inlåst. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. (127989-001) P04048SE_01/K4065/2015.07 s. 2/6

Fara DAB+ Chromogen: 1 5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Kan orsaka cancer. H341 Misstänks kunna orsaka genetiska defekter. P201 Inhämta särskilda instruktioner före användning. P202 Använd inte produkten innan du har läst och förstått säkerhetsanvisningarna. P280 Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. P308 + P313 Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarvård. P405 Förvaras inlåst. P501 Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. Som en huvudregel tillåts inte personer under 18 års ålder hantera denna produkt. Användare måste noggrant instrueras om korrekt arbetsprocedur, farliga egenskaper hos produkten och nödvändiga försiktighetsåtgärder. Förvaring Reagenser för EnVision+ Dual Link System-HRP ska förvaras vid 2 8 C. Frys inte ned. Använd inte efter det utgångsdatum som finns tryckt på reagensflaskorna och satsens etikett. Användaren måste validera om reagenser förvaras under andra förhållanden än dem som specificeras. 1 Förändring av utseendet av något reagens, såsom fällning, kan indikera instabilitet eller försämring. I sådana fall får reagenset (reagenserna) inte användas. Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet hos dessa produkter. Därför bör positiva och negativa kontroller testas samtidigt med patientprover. Kontakta Dako Teknisk Support om oväntad färgning observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och om det misstänks vara problem med denna sats. Provberedning Reagensberedning Före IHC-färgning måste vävnaderna fixeras och behandlas. Fixering förhindrar autolys och förruttnelse av utskuren vävnad, konserverar antigeniciteten, förstärker vävnadens brytningsindex och ökar de cellulära elementens motstånd mot vävnadsbehandling. Vävnadsbehandling inkluderar dehydrering, borttagning av dehydreringsämnen, infiltration av inbäddningsmedia, inbäddning och snittning av vävnaden. Detta är endast riktlinjer. Optimala procedurer måste bestämmas och verifieras av användaren. För specifik information angående vävnadsfixering och behandling, se General Instructions for Immunohistochemical Staining (Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning). Tvättbuffertlösning Undersökning har visat att 0,05 mol/l Tris-HCl, ph 7,6, innehållande 0,15 mol/l NaCl och 0,05 % Tween 20, utan natriumazid, underlättar betydligt för att minimera bakgrundsfärgning med detta system. En rekommenderad tvättbuffert är Automation Buffer (kod S3006). Tvättbuffertar som innehåller natriumazid inaktiverar pepparrotsperoxidas och resulterar i negativ färgning. Förvara oanvänd buffert vid 2-8 C. Kassera bufferten om den verkar grumlig. MANUELL FÄRGNING Vävnadssnitt ska tvättas i upp till tre färska bad av Automation Buffer (kod S3006), TBS (kod S3001) eller PBS (kod S3024) i 3 5 minuter mellan varje steg i EnVision+ Dual Link System-färgningsprotokollet. Primärantikropp Bruksfärdiga antikroppar för EnVision+ Dual Link System finns tillgängliga från Dako. Koncentrerade antikroppar finns också tillgängliga från Dako. Emellertid måste optimala spädningar bestämmas experimentellt av användaren. På grund av den höga känsligheten av EnVision+ Dual Link System kan spädningar av primärantikroppar vara 5 till 20 gånger högre än dem för traditionella IHC-metoder. Om koncentrerade antikroppar ska användas bör spädningar beredas med Antibody Diluent (kod S0809). För de flesta primärantikroppar som används med denna sats är en inkubationstid på 30 minuter tillräcklig. Negativt kontrollreagens Idealt innehåller ett negativt kontrollreagens en antikropp som inte uppvisar någon specifik reaktivitet med humanvävnader eller normalt/icke-immunt serum i samma matris/lösning som den spädda primärantikroppen. Det negativa kontrollreagenset bör vara från samma underklass och djurart som primärantikroppen, spädd till samma immunoglobulin- eller proteinkoncentration som den spädda primärantikroppen, med användning av samma spädningsmedel. Inkubationsperioden för det negativa kontrollreagenset ska motsvara inkubationsperioden för primärantikroppen. För att underlätta finns ett allmänt negativt kontrollreagens för primära musantikroppar och ett allmänt negativt kontrollreagens för primära kaninantikroppar tillgängliga från Dako och tillhandahålls som bruksfärdiga produkter. För specifik information angående beredning av negativt kontrollreagens, se Dakos General Instructions for Immunohistochemical Staining (Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning). (127989-001) P04048SE_01/K4065/2015.07 s. 3/6

Substrat-kromogenlösning Följande protokoll för beredning av 1 ml DAB+ substrat-kromogenlösning är tillräckligt för upp till tio vävnadssnitt eller upp till fem cellutstryk. STEG 1 Beroende på antalet objektglas som ska färgas, överförs tillräckligt med 1 ml alikvoter av substratbuffert till en lämplig behållare. STEG 2 För varje 1 ml av buffert, tillsätt en droppe (20 µl) av flytande DAB+-kromogen. Blanda omedelbart. Den beredda DAB+ substrat-kromogenlösningen är stabil i cirka fem dagar med förvaring vid 2 8 C. Denn a lösning bör blandas noggrant före användning. Eventuella fällningar som utvecklas i lösningen påverkar inte färgningskvaliteten. Den tillhandahållna substratbufferten på 18 ml kommer att ge tillräcklig volym för 150 tester om allt används. Ett volymöverskott kan finnas kvar. Monteringsmedia Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use (kod S3025) rekommenderas för vattenbaserad montering. För permanent montering, använd Ultramount (kod S1964) eller Permanent Mounting Medium (kod S3026). Färgningsprocedur Anm. om proceduren Användaren bör läsa dessa anvisningar noggrant och bekanta sig med satsinnehållet före användning. Se avsnittet Försiktighetsåtgärder. Lösningen Dual Endogenous Enzyme Blocking och EnVision+ Dual Link System-polymeren bör anta rumstemperatur före immunfärgning. Likaså är alla inkubationer optimerade att utföras vid rumstemperatur. Reagenserna och anvisningarna, som medföljer denna sats, har utformats för att ge optimal prestanda. Ytterligare spädning av satsreagenserna eller förändring av inkubationstider eller temperaturer kan ge felaktiga resultat. Låt inte vävnadssnitten torka under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa ökad icke-specifik färgning. Täck objektglas som utsätts för drag. Om långvariga inkubationer används ska vävnaderna placeras i fuktig miljö. Sensitiviteten för EnVision+ Dual Link System-HRP kan vidare ökas genom förlängning av inkubationstiderna i steg 2 och 3 till 5 10 minuter. MANUELLT FÄRGNINGSPROTOKOLL STEG 1 BLOCKERING AV ENDOGENT ENZYM Slå bort överskottsbuffert. Använd en luddfri duk (t.ex. Kimwipe eller gasväv) och torka försiktigt runt provet för att bli av med all återstående vätska och för att hålla reagens inom det föreskrivna området. Applicera tillräckligt med Dual Endogenous Enzyme Block för att täcka provet. Inkubera i 5 10 (±1) minuter. Skölj varsamt med destillerat vatten eller buffertlösning från en tvättflaska (rikta inte strålen direkt på vävnaden) och placera i färskt buffertbad. STEG 2 PRIMÄRANTIKROPP ELLER NEGATIVT KONTROLLREAGENS Slå bort överskottsbuffert och torka av objektglasen som tidigare. Applicera tillräckligt med optimalt spädd primärantikropp eller negativt kontrollreagens för att täcka provet. Inkubera i 30 (±1) minuter. Skölj varsamt med buffertlösning från en tvättflaska (rikta inte strålen direkt på vävnaden) och placera i färskt buffertbad. Om färgningsproceduren måste avbrytas kan objektglasen förvaras i ett buffertbad efter inkubation av primärantikroppen (steg 2) i upp till en timme vid rumstemperatur utan att färgningsprestandan påverkas. STEG 3 MÄRKT POLYMER-HRP Slå bort överskottsbuffert och torka av objektglasen som tidigare. Applicera tillräckligt med märkt polymer för att täcka provet. Inkubera i 30 (±1) minuter. Skölj objektglasen som i steg 2 och placera i buffertbad i 5 (±1) minuter. STEG 4 SUBSTRAT-KROMOGEN Torka objektglasen som tidigare. Applicera tillräckligt med substrat-kromogenlösning för att täcka provet (se avsnittet Reagensberedning). Inkubera i 5 10 (±1) minuter. Skölj varsamt med destillerat vatten från en tvättflaska (rikta inte strålen direkt på vävnaden). Samla avfall av substrat-kromogen i en behållare för riskavfall för korrekt kassering. STEG 5 HEMATOXYLIN-KONTRASTFÄRG (valfri) Sänk ned objektglasen i ett bad med vattenbaserat hematoxylin. Inkubationstiden är beroende av styrkan hos det hematoxylin som används. Skölj varsamt i ett destillerat vattenbad. Doppa objektglasen tio gånger i ett bad med 0,037 mol/l ammoniak eller liknande färgförstärkningsmedel. Skölj objektglasen i ett bad av destillerat eller avjoniserat vatten i 2 5 minuter. Fortsätt med montering. (127989-001) P04048SE_01/K4065/2015.07 s. 4/6

Montering Prover kan monteras och förses med täckglas med ett vattenbaserat monteringsmedium som Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kod S3025). För permanent montering, använd Ultramount (kod S1964) eller Permanent Mounting Medium (kod S3026). Obs: Objektglasen kan avläsas vid lämpligt tillfälle. Viss blekning kan dock ske om objektglasen utsätts för starkt ljus under en period på en vecka. Förvara objektglasen mörkt vid rumstemperatur (20 25 C) för att minimera blekningen. Kvalitetskontroll Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan ge upphov till väsentliga variationer i resultaten, vilket gör det nödvändigt att utföra regelbundna egna kontroller. Se riktlinjerna för kvalitetskontroll från American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry samt referenser 3 till 5 för ytterligare information. Se produktbladet för varje primärantikropp som används för detaljer angående sensitivitet och immunreaktivitet. Se Dakos General Instructions for Immunohistochemical Staining (Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning) för ytterligare information om positiva och negativa kontroller. Tolkning av färgningen Allmänna begränsningar Produktspecifika begränsningar Se Dakos General Instructions for Immunohistochemical Staining (Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning) för tolkningsriktlinjer. Se Dakos General Instructions for Immunohistochemical Staining (Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning) för allmänna begränsningar. Användning av gamla eller obuffrade fixativ, eller exponering av vävnaderna för hög värme (högre än 60 C) under behandlingen, kan resultera i minskad färgningssensitivitet. Felsökning MANUELL Endogen peroxidas- eller pseudoperoxidasaktivitet kan finnas i hemoproteiner såsom hemoglobin, myoglobin, cytokrom och katalas såväl som i eosinofiler. 2,3 Denna aktivitet kan hämmas genom att inkubera proverna med Dual Endogenous Enzyme Block i EnVision+ Dual Link System-HRP i fem till tio minuter före tillsats av primärantikroppen. Blod- och benmärgsutstryk och frysta vävnader kan också behandlas med detta reagens. Alternativt kan en lösning av metanol-väteperoxid användas. Vissa antigener kan denatureras med denna procedur. Vävnader från personer infekterade med hepatit B-virus och med hepatit B-ytantigen (HBsAg) kan uppvisa icke-specifik färgning med pepparrotsperoxidas. 4 Normala/icke-immuna sera från samma djurkälla som sekundära antisera, som användes i blockeringsstegen, kan orsaka falskt negativa eller falskt positiva resultat på grund av auto-antikroppar eller naturliga antikroppar. Reagenserna, som tillhandahålls i denna sats, har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan resultera i förlust av antigendetektion. Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Ingen färgning av objektglasen 1a. Reagenserna har inte använts i korrekt ordning 1a. Gå igenom appliceringen av reagenserna 2. Svag färgning av objektglasen 3. Alltför kraftig bakgrundsfärg ning av alla objektglas 1b. Natriumazid i buffertbad 1b. Använd färsk, azidfri buffert 2a. Snitten bibehåller för mycket lösning efter tvättbad 2b. Objektglasen har inte inkuberats tillräckligt länge med antikroppar eller substrat 3a. Prover innehåller hög peroxidasaktivitet 3b. Paraffinet har inte avlägsnats fullständigt 3c. Objektglasen inte tillräckligt sköljda 3d. Snabbare än normal substrat-reaktion på grund av t.ex. för hög rumstemperatur 3e. Snitten torkade under 2a. Slå försiktigt bort överskottslösning innan du torkar runt snittet 2b. Gå igenom de rekommenderade inkubationstiderna 3a. Använd längre inkubationstid för Dual Endogenous Enzyme Block 3b. Använd färska xylen- eller toluenbad. Om flera objektglas färgas samtidigt, bör det andra xylenbadet innehålla färskt xylen. 3c. Använd färska lösningar i buffertbad och tvättflaskor. Använd Automation Buffer som tvättbuffert (se avsnittet Reagensberedning). 3d. Använd kortare inkubationstider med substratkromogenlösning 3e. Använd fuktkammare. Torka endast tre till fyra färgningsproceduren objektglas åt gången före tillsats av reagens. 3f. Icke-specifik bindning av 3f. Applicera en blockeringslösning med ett reagenser till vävnadssnitt irrelevant protein (se avsnittet Tolkning av färgningen) (127989-001) P04048SE_01/K4065/2015.07 s. 5/6

3g. Alltför koncentrerad 3g. Använd högre spädning för primärantikroppen antikropp OBS: Om problemet inte härrör från någon av ovanstående orsaker eller om den föreslagna åtgärden inte löser problemet, kontakta Dako Teknisk Support för ytterligare hjälp. Ytterligare information om färgningsmetoder och provberedning finns i Handbook Immunochemical Staining Methods 5 (tillgänglig från Dako), Atlas of Immunohistology 6 och Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 7 Referenser 1. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order Code C24-A:4 2. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 3. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 4. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 5. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook-immunochemical staining methods. Carpinteria 3rd Edition. Dako 2001 6. Tubbs RR, et al. Atlas of Immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 7. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Ytterligare referenser Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3-8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12 th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12 th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 Bisgaard K. EnVision Plus-Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 Edition 07/15 (127989-001) P04048SE_01/K4065/2015.07 s. 6/6