R
DNA 1 Ett styrprotein knäpper på en gen, börjar gen aminosyror ribosom 1 Protein blir till. Först tillverkas, en enkelsträngad RNA-kopia av genen. Den fungerar sedan som mall för det protein som cellen bygger upp i ribosomen, cellens proteinfabrik. 2 för ut genkopian till ribosomen trna där protein börjar har visat sig ha viktiga styrfunktioner i cellen. Resultaten inger medicinska NARNA förhoppningar. Molekylen som kan stänga av DNA AV GERHART WAGNER Den bild som förmedlas i skolböcker, ja även i läroböcker på universitetsnivå, av hur generna styrs är föråldrad. Det nya är att en rad olika små RNA-molekyler mycket överraskande har befunnits spela centrala roller i livets grundläggande processer. I den vetenskapliga världen har dessa små RNA-molekyler redan rönt stor uppmärksamhet. Upptäckten lyftes rentav fram av tidskriften Science som årets vetenskapliga genombrott för ett par år sedan! Proteiner styr generna... De grundläggande livsprocesserna är snarlika i bakterier, växter och djur. Arvsmassan består av DNA, den berömda dubbelspiralen. När en gen är aktiv, tillverkas först en enkelsträngad RNA-kopia av genen, så kallat budbärar-rna eller (m för engelskans messenger). Denna process kallas transkription. Den enkelsträngade kopian fungerar sedan som mall för det protein som cellen bygger upp och som är genens slutprodukt. Det är proteiner som utför det mesta av cellens arbete. Olika celler behöver olika proteiner. En nervcell måste tillverka signalmolekyler, medan en immunförsvarscell producerar antikroppar och så vidare. Alla celler är uppmärksamma på var i kroppen de befinner sig, hur gamla de är och vilka signaler omvärlden sänder (värme, ljus, tryck och mycket annat). Allt detta för att varje cell ska aktivera just de gener som behövs för att tillverka rätt slags proteiner.... men det gör även RNA En gen är oftast inaktiv, men den kan aktiveras exempelvis om ett styrprotein binder intill den och knuffar igång det maskineri som tillverkar. Andra styrproteiner har den omvända funktionen. Deras uppgift är att förhindra kopiering. De flesta vet att DNA bär på våra arvsanlag och därför är viktig, medan RNA ofta betraktas som en Forskning & Framsteg 1/05 17
DNA 1 antisens-gen AntisensRNA tillverkas från en antisens-gen antisensrna 2 bildar baspar med och gör det inaktivt. antisensrna Inget protein ribosom tråkig och passiv molekyl. Om än livsnödvändig. RNA är den funktionellt viktigaste delen i cellens proteinfabrik, ribosomen. Förutom är transferrna (trna) också känt sedan länge, en molekyl som behövs för att transportera proteiners byggstenar till ribosomen. Men RNA har visat sig inte bara syssla med informationsöverföring. År 1981 hittade två forskare, Junichi Tomizawa i USA och Kurt Nordström i Sverige, några RNA-molekyler som spelar en intressantare roll. De fann att korta RNA-molekyler styr aktiviteten hos vissa gener i bakterier. Styrningen fungerar på ett helt annat sätt än det man tidigare kände till. Dessa styr-rna-molekyler påverkar inte genens transkription, utan fäster i stället vid, så att 2 Så förhindrar RNA proteintillverkningen. Om antisensrna passar ihop med ett så blir det dubbelsträngat. Men ribosomer kan inte läsa av dubbelsträngat RNA och då uteblir proteinproduktionen. En RNAmolekyl stoppar en annan det inte kan utföra sin budbäraruppgift. Resultatet blir att inget protein Hur kan då en RNAmolekyl stoppa en annan RNA-molekyls funktion? Lösningen är snillrik och följer samma princip som i DNA-strukturen. DNA består av en lång rad så kallade kvävebaser som sitter emellan två strängar av socker och fosfat. Det finns fyra olika kvävebaser, kallade A, C, G och T. De håller ihop parvis i den tvinnade dubbelsträngen, som tvärpinnarna i en stege, på så sätt att A alltid sitter mitt emot T och C alltid mitt emot G. När två lösa strängar passar ihop kallas de komplementära. På samma sätt är de små styr-rnamolekylerna komplementära till och kan därför bilda baspar med detta (bild 2). Därmed blir inaktivt. Små styr-rna-molekyler som fungerar på detta sätt kallas antisens-rna. Undantaget som blev regel Under de följande tjugo åren hittade forskarna flera antisens-rna-molekyler, inte bara i bakterier utan även i en amöba (D. discoideum) och i en rundmask (C. elegans). Trots detta såg många forskare dessa RNA-molekyler som undantag från regeln att RNA behövs enbart för att ombesörja flödet av information från DNA till protein. Men för fyra år sedan var tiden mogen för nytänkande. Naturen brukar använda eleganta lösningar för allehanda regleringsproblem. Små RNA-molekyler är billiga för cellen att tillverka och fungerar bra som styrelement. Borde det då inte finnas mängder av oupp- 18 Forskning & Framsteg 1/05
täckta sådana molekyler? Flera forskarlag i världen började därför att aktivt söka efter nya små RNA-molekyler med intressanta styrfunktioner. I ett samarbete med en grupp i Israel hittade min grupp i Uppsala samt två grupper i USA femtio nya RNA-molekyler i tarmbakterien E. coli! Vad vet vi då om deras roll? Mycket arbete återstår, men vi har sett att många av de små RNA-molekylerna hjälper stressade bakterier att klara sig att överleva. Det kan låta konstigt, men de flesta bakterier lever faktiskt under ständig stress, exempelvis järnbrist, svält, torka och plötsliga temperaturförändringar. När sådana kriser inträffar, krävs snabb anpassning till de nya omständigheterna. Aktiviteten i bakteriernas gener måste förändras, och det visar sig alltså att flera av de nyupptäckta RNA-molekylerna hos tarmbakterien styr just dess stressgener. Upptäckten av antisens-rna under 1980-talet fick många forskare att söka efter biotekniska och medicinska användningar. Tanken var att om man byggde antisensgener, eller tillförde antisens-rna framställt i provrör till en cell, borde man kunna tysta vissa gener. Mycket riktigt. En antisensgen som stänger av genen för ett enzym som ger petunior deras karakteristiska färg ledde till att växten bildade vita eller fläckiga kronblad. Även den omdiskuterade gentomaten som mognar långsammare framställdes på detta sätt. Däremot var det svårt att få antisenstekniken att fungera på djur. En helt oväntad upptäckt För sex år sedan gjordes så en annan revolutionerande upptäckt. Två amerikanska forskare, Andrew Fire och Craig Mello, tillverkade antisens-rna som de sprutade in i rundmasken C. elegans. Målet var en gen vars protein behövs för att masken ska kunna röra sig. Slås genens aktivitet ut, tillverkas inte proteinet och masken förlamas. I forskning använder man vanligen någon form av kontrollgrupp eller utför kontrollexperiment, i vilka man inte använder de metoder eller substanser som man tror ska ha någon effekt. I det här fallet var det inte själva experimentet utan kontrollförsöket som ledde till en sensationell upptäckt. Kontrollexperimentet bestod av att forskarna sprutade in RNA som redan var dubbelsträngat, det vill säga där antisens- RNA redan hade bildat baspar med ett komplementärt RNA. Ett sådant RNA borde inte kunna binda till ett komplementärt i cellen, eftersom inga baser i antisens-rna var lediga. Resultatet blev dock precis det omvända! Det dubbelsträngade RNA var extremt aktivt, medan det enkelsträngade antisens-rna var ineffektivt. Hur kan detta vara möjligt? Fenomenet har fått namnet RNAinterferens och innebär att dubbelsträngat RNA tystar gener som har samma kvävebassekvens. Denna helt oväntade upptäckt ledde till ett febrilt forskningsarbete på många håll i världen, och i dag vet vi en hel del om vad det är som sker. Dubbelsträngat RNA uppfattas som något hotfullt när det tillförs djur, växter eller svampar. 22 RNA-byggstenar Ett enzym som kallas Dicer känner igen dubbelsträngat RNA och klipper det till små dubbelsträngiga portionsbitar med en längd av 22 RNAbyggstenar (bild ). Ett proteinkomplex som kallas vrider isär de korta dubbelsträngarna till enkelsträngar och håller fast vid en av dem. Och plötsligt är vi tillbaka vid en antisensmekanism! De korta och nu enkelsträngiga RNA-bitarna, vilka har fått namnet (small interfering RNA), hjälper nämligen att hitta det budbärar-rna () som har en komplementär, det vill säga passande, sekvens av kvävebaser. När de båda RNA-molekylerna bildar baspar med varandra kan ett enzym kallat Slicer klippa sönder. Då tystas den gen som hade Så fungerar RNA-interferens. dsrna (dubbelsträngat) Dicer är ett enzym som klipper dubbelsträngat RNA till portionsbitar som heter. fångas upp av ett proteinkomplex, som vrider isär dubbelsträngat till enkelsträngat och "letar sedan upp som skall tystas. basparar med en del av. klipps sönder och blir inaktivt. Dicer Dicer tillverkat budbärar-rna. Nästan alla eukaryota livsformer, det vill säga organismer med cellkärna, bär på det maskineri som behövs för RNA-interferens. Varför? En möjlig förklaring finns hos växter. De Forskning & Framsteg 1/05 19
flesta virus som angriper växter har dubbelsträngat RNA som arvsmassa. Alltså borde det vara av evolutionär nytta att förfoga över en mekanism som känner igen och oskadliggör dubbelsträngat RNA. För djur och människor är läget annorlunda. I sitt försvar mot RNAvirus använder de helt andra slags ämnen, kallade interferoner. Men djur och människor, liksom de flesta andra organismer, hotas av transposoner, det vill säga hoppande gener. Om en transposon sätter sig mitt i en viktig gen kan stor skada ske. Under ett visst steg i transposonens hoppande produceras dubbelsträngat RNA som alltså kan bekämpas genom RNA-interferens och detta kan vara en drivkraft bakom att djur och människor innehar maskineriet för RNA-interferens. Virus och hoppande gener kan alltså vara bra förklaringar, men det finns faktiskt något som antagligen är ännu viktigare. Samma maskineri som behövs för RNA-interferens har nämligen en annan livsviktig funktion, tillsammans med ytterligare en klass av små RNA-molekyler som huvudaktörer. Varhelst man undersökte RNA-interferens hittades, alltså korta enkelsträngar, med 22 RNA-byggstenar. Alltid samma längd, vilket förklaras av att enzymet Dicer klipper just Mask och människa har exakt samma mikro-rna så. Ett av de antisens- RNA som tidigare hade hittats i masken C. elegans är, märkligt nog, av exakt samma längd. Detta RNA, vid namn Lin-4, styr ett viktigt steg i maskens utveckling. Kunde det vara så att Dicer inte bara tillverkar för RNA-interferens, utan även styr-rna för andra ändamål? På liknande sätt som bakterieforskarna gjorde, sökte nu flera grupper efter dessa pyttesmå RNA med en längd av 22 kvävebaser. Hundratals RNA En helt ny värld öppnade sig. Man fann hundratals RNA av denna storlek i maskar, möss, människor, bananflugor och växten backtrav. Alla dessa RNA härrör från längre RNA som enzymet Dicer klippt ner till en längd av just 22 byggstenar (bild 4). Ett av dessa så kallade mikro-rna, kallat Let-7, ser exakt likadant ut hos människor och maskar! För en biolog finns då en enda rimlig förklaring: det måste handla om en extremt viktig funktion som är bevarad sedan den tiden då maskens och människans gemensamma förfader levde. Men vilken roll kan vara så viktig? I fallen Lin-4 och Let-7 är funktionen faktiskt känd. Maskens tidiga utveckling kräver styrning av vissa geners aktivitet vid exakt rätt tidpunkt. Detta är vad Lin-4 och Let-7 A CC A U CCGGUGAACUAUGCAAUUU U CUACCUUACCGGA U GG U UUGAUAUGUUGGAUGAUGGAGUGGCCU A A UA gör. De fungerar som antisens-rna, det vill säga att de letar rätt på sina och blockerar tillverkning av de proteiner som dessa annars skulle producera. Men vad vet vi då om alla de andra? Om man vill förstå deras funktion måste man hitta det vars verksamhet de har till uppgift att stoppa. Med datorns hjälp går det att leta efter som är komplementärt till mikro-rna. I växter är det ganska lätt. I djur är det däremot inte det, eftersom där är mikro-rna oftast inte fullständigt komplementära till utan bara i hög grad. I flera fall har forskarna experimentellt kunnat visa vilket mikro- RNA som styr vilken gen. Mönstret från masken känns igen i backtrav: flera mikro-rna styr gener som påverkar växtens utveckling, till exempel formen på bladen. Medicinska förhoppningar För forskarvärlden är det spännande tider. På kort tid har bilden av RNA förändrats från att ha varit en passiv och tråkig transportmolekyl till att aktivt utöva viktiga styrfunktioner i bakterier, djur och växter. Detta kommer att ha stor betydelse för medicinsk forskning. Många sjukdomar orsakas nämligen av att vissa geners aktivitet är för hög eller för låg. En studie som publicerades i Nature i november 2004 visar att man kan använda kemiskt modifierade för att tysta genen för ett protein som ansvarar för en av orsakerna till åderförkalkning. Men studien är gjord på råttor och vägen till ett läkemedel lång. Det är till och med oklart vilka problem som återstår i form av biverkningar och andra oförutsedda effekter. UUGAUAUGUUGGAUGAUGGAGU Let 7 4 Styr utvecklingen hos både mask och människa. Av vissa gener tillverkas mikrorna. I de fallen bildas längre RNA som bildar baspar med sig själv och därmed blir dubbelsträngat. Enzymet Dicer klipper ut en del av strängen till ett mikrorna (här Let-7), som styr grundläggande utvecklingssteg i djur och växter. DNA består av fyra olika kvävebaser: A, C, G och T. I RNA-molekylen ersätts T av U som kvävebas. GERHART WAGNER ÄR PROFESSOR I PROKARYOT MIKROBIOLOGI VID UPPSALA UNIVERSITET. HANS FORSKNING FINANSIERAS AV BL. A. VETENSKAPSRÅDET OCH FORMAS. fof.se 20 Forskning & Framsteg 1/05