Glukosdehydrogenas Laktos och Ga. Enzymatisk bestämning i livsmedel
Innehållsförteckning 1. Ändamål och Användningsområde...1 2. Princip...1 3. Reagens...1 3.1 Citratbuffert...1 3.2 NAD-Citratbuffert...2 3.3 Fosfatbuffert...2 3.4 β-gaidas...2 3.5 Gadehydrogenas...2 3.6 Laktos lösning...2 3.7 Ga lösning...2 4. Apparatur...3 4.1 Mikropipetter...3 4.2 Spektrofotometer...3 5. Utförande...3 5.1 Analyssubstans...3 5.2 Bestämning...3 6. Resultatberäkning...4 7. Anmärkningar...5 8. Rapportskrivning...5
1. Ändamål och Användningsområde Detta är en enzymatisk metod för kvantitativ bestämning av och ga i livsmedel. Metoden kan tillämpas på olika typer av livsmedel, exempelvis flytande och fasta mejeriprodukter, köttprodukter, charkuterivaror, bageri- och konditoriprodukter, barnmat och choklad. Metoden lämpar sig även för fria livsmedel, dock inte för produkter i vilka hydrolyserats (så kallade HYLAprodukter) 2. Princip I närvaro av enzymet β-gaidas och vatten hydrolyseras till D-glukos och D-ga (1). β-gaidas (1) Laktos + H 2 O D-glukos + D-ga D-ga oxideras till galaktonsyra med hjälp av nikotinamid-adenin dinukleotid (NAD) i närvaro av enzymet gadehydrogenas (Gal-DH) (2). Gal-DH (2) D-ga + NAD + Galaktonsyra + NADH + H + Mängden bildat NADH (reaktion (2)) är stökiometrisk med avseende på mängden och ga. Mängden NADH bestäms kvantitativt genom att spektrofotometriskt mäta lösningens absorbans vid 340 nm. 3. Reagens Alla reagens skall vara av proanalysi kvalitet. Vattnet skall vara dubbeldestillerat eller demineraliserat och destillerat i apparatur helt av glas. 3.1 Citratbuffert (citrat 0,2 mol/l; Mg 2+ 50 mmol/l; ph 6,6): Lös 2,8 g trinatriumcitrat dihydrat, 42 mg citronsyra monohydrat och 625 mg magnesiumsulfat heptahydrat i 40 ml vatten. Justera ph-värdet till 6,6±0,1 vid 20 ºC med användning av 2 mol/l svavelsyra eller 0,1 mol/l natriumhydroxid. Späd med vatten till 50 ml. Lösningen är hållbar i tre månader vid +4 ºC. 1
3.2 NAD-Citratbuffert (NAD cirka 7 mmol/l): Lös 25 mg nikotinamid-adenin dinukleotid (NAD) i 5 ml citratbuffert (3.1). Lösningen är hållbar i tre veckor vid +4 ºC. 3.3 Fosfatbuffert (ph 8,6): Lös 8,3 g kaliumdivätefosfat i cirka 40 ml vatten. Justera ph till 8,6±0,1 vid 20 ºC med användning av 1,0 mol/l natriumhydroxid. Späd med vatten till 50 ml. Lösningen är hållbar i två månader vid +4 ºC. 3.4 β-gaidas (EC 3.2.1.23) *), 5mg/ml; 30 U/mg. Lösningen är hållbart i ett år vid +4 ºC. 3.5 Gadehydrogenas (Gal-DH) (EC 1.1.1.48) *), 5 mg/ml; 5 U/mg; 25 U/ml. Lösningen är hållbart i ett år vid +4 ºC. 3.6 Laktos lösning (0,500 g /l): Torka ca 1 g monohydrat till konstant massa i värmeskåp vid 87±2 ºC. Väg 52,6 mg av det torra materialet, lös i vatten och späd till 100 ml. Lösningen är hållbar i en vecka vid +4 ºC. 3.7 Ga lösning (0,500 g ga/l): Lös 50,0 mg ga i vatten och späd till 100 ml. Lösningen är hållbar i en vecka vid +4 ºC. *) Enzyme Nomenclature, American Elsevier New York 1973. The 1972 recommendations of the Commission on Enzyme Nomenclature including units and kinetic symbols. *) Enzyme Nomenclature, American Elsevier New York 1973. The 1972 recommendations of the Commission on Enzyme Nomenclature including units and kinetic symbols. 2
4. Apparatur 4.1 Mikropipetter 20,50,100 och 200 μl. Om automatpipetter med utbytbara spetsar/kapillärer används är det nödvändigt att se till att de är ordentligt kalibrerade. 4.2 Spektrofotometer med kyvetter med kyvettlängd 1 cm. Kyvetterna skall vara av ett material som är lämplig för mätningar vid 340 nm. Instrumentet måste vara vid rumstemperatur. 5. Utförande 5.1 Analyssubstans Istället för ett livsmedel kommer vi att använda oss av en lösning av och ga som provlösning. Lösningen innehåller både och ga. Den sammanlagda koncentrationen är ca 0,5 g/l. 5.2 Bestämning Utför bestämningen i 1,000 cm kyvetter och använd en provvolym om 100 μl. Om annan provvolym används, justera vattenmängden som tillsätts så att den totala volymen av provet, enzym (3.4) och vatten är 2,05 ml (OBS buffertlösningarnas volymer är ej medräknade). Alla reagenser som pipetteras i kyvetten skall vara av rumstemperatur (20-25 ºC). Pipettera i kyvetterna: ga ga ga ga NAD/citratbuffert (3.2) (ml) 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 Β-gaidas (3.4) (ml) 0,02 0,02 0,02 - - - eller standardlösning (5.1), (3.6), (3.7) (ml) - 0,10 0,10-0,10 0,10 OBS. Om kommersiella kits används, märk då att halten β-gaidas är ca 60 U/ml och inte 150 U/ml, vilket betyder att man skall tillsätta 0,05 ml av detta β-gaidas. 3
Blanda kyvettinnehållet försiktigt men noggrant. Inkubera kyvetterna vid 20-25 ºC i 15 minuter. Pipettera sedan i kyvetterna: ga ga ga ga Fosfatbuffert (3.3) (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00 Vatten (ml) 2,03 1,93 2,05 1,95 Blanda Kyvettinnehållet försiktigt men noggrant. Avläs efter två minuter prov och blanklösningarnas absorbans A1 mot luft vid 340 nm. Tillsätt 0,050 ml gadehydrogenas (Gal-DH) lösning (3.5) till alla kyvetter. Blanda kyvettinnehållet försiktigt men noggrant. Avläs efter 25 min prov- och blanklösningarnas absorbanser A2 mot luft vid 340 nm. Komplettera tabellen med alla dina mätvärden, beräkningar och resultat. Du måste använda ett kalkylprogramm för ändamålet. 6. Resultatberäkning Beräkna skillnaderna i prov- och blanklösningarnas absorbanser (A2 A1): Den allmänna formeln för beräkning av koncentrationen är: c (g/100 ml provlösning) = [(V MW)/(ε d v 1000 10)] ΔA där V = slutlig kyvettvolym (ml) MW = analytens molmassa (mg/mmol) (342,3 för, 180,2 för ga) ε = absorptionskoefficient för NADH vid 340 nm (= 6,3 l/(mmol cm)) d = kyvettlängd (cm) (1 cm) v = provvolym (ml) i kyvetten (0,1 ml) 1000 = 1000 mg = 1 g 10 = faktor för konversion av g/l till g/100 ml. ΔA = absorbansskillnad 4
7. Anmärkningar 1. Om provlösningens - och gahalt överstiger 0,5 g/l, skall lösningen spädas före analys, alternativt måste mindre provvolym väljas (5.2). 2. Av precisionsskäl skall arbetet om möjligt utföras så att man siktar på ΔAvärden mellan 0,1 och 0,8. ΔA-värden som överstiger 0,020 kan anses vara pålitliga. 8. Rapportskrivning Du ska skriva en individuell rapport innehållande Titelsida Innehållsförteckning Inledning/syfte Utförlig redovisning av teorin Metod/genomförandet, samt formell redovisning av alla beräkningar En sammanhängande tabell över samtliga mätvärden och beräkningar (från kalkylprogramm) Resultat Felkällor och feluppskattning Diskussion Källförteckning 5