Umeå Universitet Biomedicinska analytikerprogrammet Detektion av Borrelia burgdorferi IgG med hjälp av ELISA Årskull: Laborationsrapport i immunologi termin 3 Laborationsdatum: Inlämnad: Godkänd: Handledare:
Introduktion Borrelia är en infektion som orsakas av bakterien Borrelia burgdorferi. Borrelia burgdorferi är en spiralformad bakterie, så kallad spirochet. Det finns tre humanpatogena arter av bakterien; Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii och Borrelia afzelii. Alla dessa arter av Borreliabakterien har en starkt immunogen flagell. Bakterien sprids till människor via fästingbett. En varningssignal för Borreliasmitta är en röd växande ring runt fästingbettet efter ett par veckor. Tillståndet kallas erythema migrans och kan också uppträda på andra ställen än vid fästingbettet. Det är dock långt ifrån alla drabbade som utvecklar erythema migrans. Andra symptom för sjukdomen kan vara trötthet, huvudvärk, lätt feber, ledsmärtor och svullna lymfkörtlar. Även tillfällig förlamning i ansiktet är ett, om än mer ovanligt, symptom (1). Idag diagnostiserar man Borrelia mest effektivt genom att mäta Borrelia burgdorferispecifika antikroppar i patientens serum. Detta görs med en immunkemisk teknik som heter ELISA (Enzym-Linked ImmunoSorbent Assay). ELISA är en kvantitativ immunoassay som bygger på att till exempel ett antigen coatas i brunnar på en mikrotitrerplatta. Tillsatt antikropp bildar antigen-antikroppskomplex som sedan kan detekteras med ett enzym, vilket kan konvertera ett färglöst substrat till en färgad produkt, kopplas kovalent till en sekundär antikropp. Ju mer färgat substrat som påvisas, desto mer antigen finns i provet. Mellan stegen tvättas brunnarna för att få bort obunden reagens. I testkitet IDEIA TM Borrelia bugdorferi IgG från DAKO Diagnostics Ltd, används renade B. burgdorferi flageller som testantigen. I testkitet är alla brunnar i mikrotitrerplattan coatade med testantigen. Patientens serum tillsätts och om det innehåller antikroppar mot testantigenet bildas antigen-antikroppskomplex. Efter att obundna serumproteiner tvättats bort tillsätts en peroxidaskonjugerad antikropp till humant IgG i brunnarna. Konjugatet binder specifikt till mänskliga IgG antikroppar som sitter på testantigenet. Överblivet konjugat tvättas bort och efter tillsats av substrat katalyserar det bundna peroxidaset en reaktion vilken ger en blå produkt. Reaktionen stoppas genom tillsats av svavelsyra och den blå färgen omvandlas till gul. Den gula färgens intensitet motsvarar mängden Borrelia burgdorferi-specifika antikroppar i provet. Färgintensiteten bestäms spektrofotometriskt vid 450 nm och patientprovets absorbansvärden jämförs med kontrollvärden. Kontroll av spädningsbuffert, IgG Cut-Off kontroll och positiv IgG kontroll görs också.
Syftet med laborationen var att mäta halten antikroppar mot B. burgdorferi flageller i fem patienters serum för att se om de led av Borrelia eller inte. Material och metod IDEIA TM Borrelia burgdorferi IgG testkit från DAKO Diagnostics Ltd, användes. Innehållet i Vial No 2 (tvättbuffert) späddes i 1200 ml avjoniserat vatten. Två 8-brunnsstrippar placerades i en plastram. Patienternas serumprov späddes 1+200 genom att 10 µl serum sattes till 2 ml spädningsbuffert (Vial No.1). 100 µl spädningsbuffert sattes till brunn A1 (se bilaga 2). 100 µl IgG Cut-Off Control (Vial No.3) sattes till brunn B1, C1 och D1 och 100 µl IgG Positiv Control (Vial No.4) sattes i brunn E1 och F1. För varje av de fem patienterna sattes 100 µl utspätt serumprov till två brunnar. Detta gjordes i brunn G1, H1, A2, B2, C2, D2, E2, F2, G2 och H2. Plattan täcktes med plastfilm och inkuberades i rumstemperatur under 60 minuter på skak (500 rpm). Därefter tvättades plattan sex gånger med tvättbuffert. Till samtliga brunnar sattes 100 µl Anti-IgG Conjugat (Vial No.5). Plattan täcktes med plastfilm och inkuberades enligt ovan under 60 minuter varefter den tvättades fyra gånger med tvättbuffert. Lika mängder (8 ml) av substrat A (Vial No.6) och substrat B (Vial No.7) blandades och 100 µl substratlösning sattes omedelbart till varje brunn. Plattan täcktes med plastfilm och inkuberades under 10 minuter i rumstemperatur. Reaktionen stoppades efter 10 minuter genom tillsats av 100 µl stopplösning (Vial No. 8) till alla brunnar. Brunnarnas absorbans mättes spektrofotometriskt vid 450 nm. Resultat Resultaten i tabell 1 visar att patient 1675 och 1890 har fått negativt resultat på testet för Borrelia burgdorferi och patient 1755, 1783 och 1863 har testats positiva.
Tabell1. Absorbansvärden vid 450 nm för kontroller och fem patientprover samt beräknat medelvärde och units. IgG Cut-Off IgG positiv Pat. 1675 Pat.1755 Pat. 1783 Pat. 1863 Pat. 1890 Abs 1 0,180 0,915 0,124 0,237 0,211 0,215 0,138 Abs 2 0,175 0,880 0,120 0,237 0,201 0,209 0,142 Abs 3 0,174 - - - - - - Medelvärde 0,176 0,898 0,122 0,237 0,206 0,212 0,140 Units 1 25 0,8 1,3 1,1 1,2 0,9 Tolkning - - Negativ Positiv Positiv Positiv Negativ Kvalitativ tolkning: Resultaten från den spektrofotometriska mätningen tolkas enligt följande: Negativt svar på förekomst av antikroppar mot B. burgdorferi: patientprov < IgGCut-Off Positivt svar på förekomst av antikroppar mot B. burgdorferi: patientprov IgG Cut-Off Semikvantitativ tolkning: -värdena är omräknade till Units (U) och tolkas enligt följande: Negativt svar på förekomst av antikroppar mot B. burgdorferi: U patientprov < 1 Positivt svar på förekomst av antikroppar mot B. burgdorferi: U patientprov > 1 Diskussion För att testet ska anses tillförlitligt ska skillnaden mellan -värdena på IgG Cut-Off Control och IgG positiv kontroll vara minst 0,800. Vid denna testomgång är skillnaden 0,720 och är därmed under gränsen för att resultaten ska anses giltiga. Ett för lågt värde kan eventuellt bero på att tvättningen av proverna varit otillräcklig, att inte proverna skakats tillräckligt under inkubationstiden eller att den omgivande temperaturen är för låg. I detta fall bör inte någon av dessa förklaringar vara aktuellt. Vid varje tvättillfälle tvättade vi proverna 6 gånger istället för fyra som var rekommenderat. Skakningen borde inte heller vara problemet eftersom att andra laboranters prover sattes på skak gemensamt med våra prover och dessa prover klarade kvalitetskontrollen. Istället kan orsaken vara att vi inte skakade flaskorna med IgG Cut-Off Control och IgG positiv kontroll innan proverna sattes till mikrotiterbrunnarna. Eftersom att
inte denna testomgång klarade kvalitetskontrollen kan inte provsvaren lämnas ut till de berörda patienterna utan testet måste göras om. Ett annat kvalitetstest görs för att kontrollera att det inte är för stor spridning mellan varje patients dubbelprover. De individuella värdena ska inte skilja sig mer än 15 % från medelvärdet. Om så är fallet är inte resultatet tillförlitligt och måste då göras om. Alla proverna i detta test visar godkända resultat på denna kvalitetskontroll. Ett tredje kvalitetstest gjordes på spädningsbufferten. Detta värde ska hamna mellan 0,000 och 0,1000. Vårt värde blev visade 0,104 vilket ändå ansågs vara godkänt. Testet har vissa begränsningar. Man ska vara medveten om att ett negativt resultat inte helt kan utesluta att patienten har infekterats av B. burgdorferi. Halten antikroppar mot bakterien beror på vilket stadium infektionen befinner sig i vid provtagningstillfället. I första stadiet (erythema migrans) har endast 30-40 % av patienterna utvecklat ett antikroppssvar mot Borrelia burgdorferi. I det andra stadiet (neuroborrelios) samt det tredje stadiet (ACA och kronisk neuroborrelios) är motsvarande siffra 60-100 %. Positiva resultat indikerar att patienten har antikroppar mot B. burgdorferi. Men testet särskiljer inte på en aktiv och en inaktiv infektion. Ett positivt resultat kan alltså innebära att patienten infekterats för länge sedan och att infektionen redan har bekämpats av immunförsvaret. När man väl utvecklat antikroppar (främst IgG) mot antigenet är produktionen av antikroppar mycket långvarig och varar i många fall livet ut. Antigen på Borrelia burgdorferi är nära besläktat med antigen på Treponema pallidium, det vill säga den bakterie som orsakar syfilis. Har patienten tidigare infekterats av syfilis kan dessa antikroppar ge falskt positiva resultat för B. burgdorferi. För att utesluta att antikroppar mot T. pallidium orsakar ett positivt resultat måste ett syfilistest göras.
Referenser 1. Netdoktor.se, Borrelia, 2004 >http://www.netdoktor.se/?_pageid=503&areaid=12< (2008-11-10) Instruktionshäfte från DAKO: IDEIA TM Borrelia burgdorferi IgG. (1995-04-24)
Bilaga 1. RISKBEDÖMNING: Vid arbete med blodprover finns risk för blodsmitta Bilaga 2. REAGENSER: Vial No. 1: Spädningsbuffert (arbetslösning) Buffertlösning med detergent och antimikrobiell agent. Rödfärgad. Vial No. 2: Tvättbuffert (25x) Buffertlösning med detergent och antimikrobiell agent. Vial No. 3: IgG Cut-Off Control (arbetslösning) Humant serum i buffert med antimikrobiell agent. Färgad ljusgrön Vial No. 4: IgG Positiv kontroll (arbetslösning) Humant serum i buffert med antimikrobiell agent. Färgad mörkgrön. Vial No. 5: Anti-IgG konjugat (arbetslösning) Anti-humant IgG från kanin, märkt med HRP. Färgad ljusblå Vial No. 6: Substrat A (arbetslösning) Tetrametylbenzidin med antimikrobiell agent Vial No.7: Substrat B (arbetslösning) Väteperoxid med antimikrobiell agent Vial No. 8: Stopplösning (arbetslösning) 0,5 M svavelsyra
Bilaga 3. Tabell 2. Schematisk bild över provernas placering på mikrotiterplattan. 1 2 A Spädningsbuffert Patient 1755 B IgG Cut-Off kontroll Patient 1755 C IgG Cut-Off kontroll Patient 1783 D IgG Cut-Off kontroll Patient 1783 E IgG positiv kontroll Patient 1863 F IgG positiv kontroll Patient 1863 G Patient 1675 Patient 1890 H Patient 1675 Patient 1890 Bilaga 4. UTRÄKNINGAR: FORMEL: U = 10 a Patientprov IgG Positiv - - IgG Cut-Off IgG Cut-Off UTRÄKNINGAR: Patient 1675: = 0,122 0,122 0,176 0,1047 U = 10 0,786 Patient 1755: = 0,237 0,237 0,176 0,1183 U = 10 1,313 Patient 1783: = 0,206
0,206 0,176 0,0582 U = 10 1,143 Patient 1863: = 0,212 0,212 0,176 0,0698 U = 10 1,174 Patient 1890: = 0,140 0,140 0,176 0,0698 U = 10 0,852