Histokemi och histologiska prov Pertti Panula Institutionen för biomedicin 2012
Skala: Alberts 5; s580 makroanatomi, mikroanatomi eller histologi, Öga (glasögon) Lupp Ljusmikroskop cellbiologi, molekylärbiologi, Ljusmikroskop EM-skop EM-skop kemi, (atomfysik) (partikelfysik) EM-skop Biokemi Kemi
Ljusmikroskopisk histologisk analys: fortfarande patologens viktigaste verktyg Levervävnad immunohistokemi, in situ hybridisering, elektronimikroskopi kompletterar diagnostik
Typer av prov: Traditionell vävnadsbiopsi Leikataan irti pala kudosta Nålbiopsi Endoskopiska prov Bestrykningspreparat Barretin ruokatorvi (metaplasia) Papa-prov
Celler utan färgning Odlad cell i ljusmikroskop Samma cell i faskontrastmikroskop Samma cell i interferensmikroskop (Nomarski) Ingen färgning Ingen färgning Ingen färgning Lähde: Alberts Svårt att se detaljer av cellen Enbart några korn syns Cellen och kärnans gränser syns, mera detaljer Samma detaljer, men 3D bild Organ eller vävnad kan inte mikroskoperas som sådan; celllager projiseras på varandra Lösning: tunna snitt färgas. Växtrotens tvärsnitt
Jämförelse av ljus- och elektronmikroskop Ljusmikroskop Gartner and Hiat: Color Textbook of Histology Saunders silmä Fluoresc. skiva Okular Projektionslins silmä Elektron mikroskop (uppochner) Snitt färjas med tungmetallsalt: - Osmiumtetroksid, - Uranylacetat - Blycitrat Objektiv Prov Kondensor Tungmetalllager strittas elektroner Mörk punkt Ljuskälla Anod Katod
Framställing av histologiska prov Fixering -oftast med formalin -fixerar viktiga komponenter, förbereder för behandling Förberedning av snittning Snittning -stärckning av vävnaden med paraffin, matrix -frysning med torris eller flytande kväve -kryostat, mikrotom, vibratom
Färgning av vävnadsnitt Deparaffinering med xylen Rehydrering till vattenfas Färgning i vatten eller buffertlösning eller annan lösning som alkohol (tex. hematoxylineosin) Täckning av snitt (med plast, glycerol)
Vävnadsbehandlingsapparat Kuva: Karppinen
Mikrotom för paraffinprov Kuva: Karppinen
Prov i paraffin Kuva: Karppinen
Snittning Kuva: Karppinen
Snitt, ännu skrynkligt Kuva: Karppinen
Paraffin- eller fryssnitt? Paraffinsnitt är bäst för rutinbruk och stora mängder -prov i rumstemperatur -passar oftast men inte alltid för immunfärgning Fryssnitt snabba och lämpliga för prov under operationen -fryssnitt kräver mera teknik och torris eller flytande kväve -fryssnitt riktigt lämpliga för immunfärgning Paraffinsnitt har ofta bättre struktur än ofixerade fryssnitt
Färgning Manuell (sidan) eller automatisk (under). Paraffin tas bort med xylen först Kuva: http://www.ucl.ac.uk/~rmkdhjh/autostnr.htm
Hematoxylin-eosin Enbart hematoxylin Enbart eosin HE Ross et Pawlina: Histology. A Text and Atlas. 5 p 2006 LWW
Histologisk färgning (HE) 1) Hematoxylin är ett blått färgämne. I lösning ioniseras det till en positiv ion (kationi) Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + 2) I vävnaden är DNA och RNA negativt laddade efter att ha donerat H+ 3) Positivt laddade hematoxylin-ioner binder till vävnadens negativt laddade element 4) I vävnaden färgas DNA och RNA med hematoxylin, alkalisk färgämne basofilt Kärnorna är färgade basofilt Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri DNA Väri Väri Väri RNA Väri Väri Väri Väri Väri Väri + Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri Kerr: Atlas of Functional Histology. 1st edition, 1999 Mosby
Nucleolus Är mörk Kärnans strukturer H = Heterokromatin är mörkt E = Eukromatin är ljust Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby TEMbild
Nissl korn Ribosomala ansamlingar syns i ljusmikroskop som basofiliska Nissl korn Neuronen har ett väl utvecklat RER, med mycket ribosomer Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Lähde: J.F.Kerr, Atlas of Functional Histology
Hematoxylin färgar kärnans DNA och cytoplasmiskt RNA HE Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Ross et Pawlina: Histology. A Text and Atlas. 5 p 2006 LWW
Histologisk färgning (HE) 1) Eosin är ett rött färgämne. Det är syrligt och ioniseras till en Negativt laddad ion (anion) 2) Vävnadsproteinernas aminogrupper laddas positivt i vattenlösnig Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini - Eosiini- Eosiini- Eosiini - Eosiini - Eosiini Eosiini- - Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini - Eosiini - Eosiini - Eosiini- Eosiini - Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini- p r o t e i + i n i + + + + + + + + + + + + + + + +
Histologisk färgning (HE) 1) Eosin är ett rött färgämne. Det är syrligt och ioniserad till anioni Eosiini- Eosiini- Eosiini - Eosiini - Eosiini- 2) Proteinernas aminogrupper är Positivt laddade i vattenlösning Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini + Eosiini p r Eosiini Eosiini o t Eosiini e i Eosiini i n i Eosiini 3) Negativt laddadt eosin binder till positivt laddade strukturer (särskilt proteiner) - Kollagen och cellens stödproteiner, mm + Eosiini Eosiini Eosiini + + + Eosiini + Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini 4) I snitten färgas proteinerna eosinofilt (=acidofilt) Muskelcellernas proteiner färgas röda med eosin, Kärnorna blåa med hematoxylin Kerr: Atlas Heikki of Functional Hervonen Histology HY, 1999, BLL, Mosby 2004
Proteinhaltig cytoplasma färgas i allmänhet eosinofilt Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Svettkörtelcellens cytoplasma färgas starkt eosinofilt Magepitelcellernas och körtelcellernas cytoplasma färgas starkt eosinofilt
HE-färgade glattmuskelceller Proteinirik cytoplasma färgas rött, kärnorna i periferin blått Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby
Också extracellulära proteiner, här kollagen, färgas med eosin Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Föreg. bild fibroblasternas kärnor mellan kollagenfibrer är basofilt färgade
Slät endoplasmatiskt retikel och mitokondrier (EM) Viktiga särskilt för lipidernas och steroidernas metaboli Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Heikki Hervonen HY, BLL, 2004
Slät endoplasmatisk retikel och mitokondrier i steroidproducerande celler M = Mitokondrier innehåller mycket proteiner eosino/acidofila färgningsegenskaper Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby SER innehåller mindre proteiner och färgas inte lika starkt på kanterna
En exokrin cell i bukspottkörteln Hur färgas cellen med HE? Kornen innehåller proteiner dvs färgas.? Omkring kärnan rikligt med RER Basdelen färgas.? Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby
En exokrin cell i bokspottkörteln Kornen har mycket protein och Färgas eosinofilt Omkring kärnan mycket RER:a, bsdelen färgas basofilt
Körtelstruktur in exokrin pancreas Basofilt grovt endoplasmatiskt retikel (RER, ribosomer!) och eosinofila korn (proteiner)
Fettdropparna har lösts från ett vanligt prov Fettcellens cytoplasma syns som en tunn ram Fett kan färgas med specifika metoder = triglyserider Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby N = fettcellens kärna Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby
Specialfärgning för elastin Skiljer elastin från kollagen och intracellulära proteiner Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Elastinet är mörkt S = glattmuskelcell C = kollagen
Histokemi och enzymhistokemi Histokemiska färgningar: PAS-färgning för kolhydrerad, Alcian-Blue för sura mukopolysakkarider, Silversaltbaserade färgningar för retikulinfibrer och nerver Enzymhistokemi utnyttjar cellernas egna enzym som kan åskådlingsgöras som substrat används metallsalt, som enzymet reagerar på och produkten är precipitat som kan visualiseras i mikroskop
Silverfärgning visar tunna retikulinfibrer Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby I levern på sinusoiodväggarna Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Lynfnodernas stödvävnad
Kolhydraterna syns inte med hematoxylin-eosin Bägarcellernas sekret (kolhydrater) syns som det ofärgade området i epitelet Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby
PAS-färgning för kolhydrater PAS-färgning färgar bägarecellernas Kålhydrater grannrött PAS-färgning färgar Också glycocalyx Och basalmembranglycoproteiner PAS = PeriodicAcid- Schiff dvs perjodsyra-schiff Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby
Immunohistokemi Bild: Minna Takkunen: Epithelialmesenchymal transition in oral squamous carcinoma cells. Avhandling
Immunohistokemi Immunohistokemi utnyttjar kroppens egna antikroppar, dvs. humoral immunrespons Djuret immuniseras (vaccineras) med (makro)molekylen (antigen/immunogen). Denna stimulerar lymfocyter till produktion av specifika antikroppar och ja minnesceller. Upprepade immuniceringar leder till förstärkt respons Efter 2-4 immuniseringarkan man dra serum med antikroppar, som på ett specifikt sätt binder till antigenen Monoklonala antikroppar produceras i cellkultur
Antikroppens struktur Antigen bindande del antigeenia sitova alue Varierande del F ab -fragment aminotermin al Två identiska tunga kädjor och två identiska lätta kädjor, Y-form Y-formade delens varierande område binder immunogen kevyt ketju raskas ketju F c -fragment karboxyter minal Ross & Pawlina: Histology. A Text and Atlas, LWW 2011
Indirekt immunohistokemi Antigenens oleva antigeeninen rakenne A Primära antikroppar: producerade in kaninen mot antigen A I får producerade sekundära antikroppar, som har markör Alberts et al.: Molecular Biology of The Cell 5.ed, 2008 Garland Science 1. Sk. polyklonal kaninantikropp mot antigen A 2. I fåren producerad antikropp mot kaninens antikroppens Fcdel,som är markerad Markören kan vara fluorokrom, tex fluoreskein enzymmolekyl guldpartikel (EM)
Vimentinfibrer (intermediära filament) Fibroblast
Immunfärgning i diagnostik: i Lupus-nefrit (njursjukdom) samlas protein i glomerulus Virtanen 2009
in situ hybridisering Enkel RNA tai DNA kädja (probe, sond) binder specifikt till motsvarande sekvens (DNA, mrna) Reaktionen kan ske i lösning, gel eller vävnad (in situ) Reaktionen identifierar kända sekvenser och kan lokalisera dem i kromosomer/celler/vävnader Med hjälp av olika fluorokromer kan man identifiera flera sekvenser
In situ hybridisering a. grundelement: DNA-sonden och målsekvensen b. Sonden kan märkas direkt med fluorokromen c. Sonden och mål-dna denatureras för att åstadkomma enkelsträngad (single stranded) DNA d. Enkelsträngade DNA-kedjor binder på varandra e. Fluorokrom -markerad sond syns under mikroskop
Glukokortikoidreceptorer i de limbiska strukturerna
TH1 och TH2 mrna i sebrafiskens hjärna: in situ hybridisering (Chen et al. 2009)
Intresserad av neurovetenskap? Möjligheter finns till fördjupade studier och avhandlingsarbete inom tex. Motorisk reglering, addiktionsmekanismer på möss, råttor och sebrafiskar, även på människans postmortemmaterial Kontakt: Pertti Panula 19125263, 040-5922323, pertti.panula@helsinki.fi