Avdödning av Bacillus cereus-sporer i suspension och på ytor. Effekt av olika diskmedel, diskparametrar och desinfektionsmedel

Rapport nr 4996 2001-05-08 Avdödning av Bacillus cereus-sporer i suspension och på ytor. Effekt av olika diskmedel, diskparametrar och desinfektionsmedel En sammanfattning av 3 hygienprojekt Anders Christiansson Svensk Mjölk Forskning Telefon 0771-191900 E-post fornamn.efternamn@svenskmjolk.se

2 Avdödning av Bacillus cereus-sporer i suspension och på ytor. Effekt av olika diskmedel, diskparametrar och desinfektionsmedel Sammanfattning Denna rapport är en sammanfattning av tre hygienprojekt som bedrivits av Svensk Mjölk i samarbete med SIK, samt som ett industrigemensamt projekt på SIK. I denna undersökning har olika disk- och desinfektionsmedels effekt på sporer av B. cereus undersökts. Undersökningarna har utförts både med sporer i suspension i laboratorieförsök och i en diskrigg med sporer på ytor. Syftet har varit att klarlägga vilka betingelser som krävs för avdödning eller bortdiskning av B. cereus-sporer. I laboratorieförsöken har grundläggande studier av effekten av lut, syra och temperatur genomförts. Undersökningarna visar tydligt att för lut och syra är temperaturen avgörande för avdödningseffekten. För lut är det viktigt att temperaturen inte är lägre än 75 C för att tillräcklig avdödningseffekt ska uppnås inom rimlig tid. Vid 55 och 65 C var effekten av lut försumbar. Effekten av salpetersyra på sporer var större än för lut. Syran hade bättre effekt vid lägre temperatur och koncentration än lut. Effekten steg kraftigt från 55 C till 70 C. Det fanns skillnader i känslighet mellan olika stammar av B. cereus för avdödning med både lut och syra. Både för lut och syra fick man större effekt av temperaturhöjning än av koncentrationshöjning. För att erhålla önskad avdödningseffekt måste man ta hänsyn till sporernas koncentration, känslighet och disktiden. Vid förlängd tid ökar avdödningseffekten. Vid jämförelse mellan lut, syra och olika formulerade diskmedel i suspensionsförsök kunde konstateras att de formulerade lut- och syrabaserade medlen var ungefär lika effektiva med avseende på sporavdödning som ren lut respektive syra. I något fall var avdödningen med formulerat medel bättre än med ren syra för en B. cereus-stam. Ett diskmedel baserat på fosforsyra avdödade dock sporer betydligt sämre än salpetersyra. För desinfektionsmedel och sporer i suspension varierade avdödningseffekten kraftigt mellan olika medel. Här fanns också stora skillnader i effekt mellan olika medel men också mellan stammar. Till en del kan dessa förklaras av skillnader i temperatur, koncentration, ph och aktiv substans, men även inom grupper av likartade substanser fanns det skillnader. Vissa medel gav god effekt, men det krävdes oftast högre koncentration än i normal brukslösning, medan andra var nästan verkningslösa. För att bättre efterlikna mejeridisk gjordes också försök med en diskrigg där stålbitar med sporer placerades i en mejerirörslinga och diskvätskan cirkulerades med ett flöde på 1,5 m/s. Flera olika varianter av lut- kombinerad med syradisk samt disk med kommersiella diskmedel med additiv undersöktes. Vid disk med ren lut och syra gav en ökning i syratemperatur kraftigare avdödning. En ytterligare ökning i syrakoncentration vid samma temperatur gav ingen ytterligare ökning. Omvänd disk med lut först och syra sen gav också förbättrad avdödning. Denna kombination bör dock undersökas ytterligare för att säkra resultatens riktighet. Bland de kommersiella koncepten var flertalet likvärdiga med lut/syradisk. Ett miljövänligt medel med låg disktemperatur, 55 C samt efterföljande desinfektion (med medel som tidigare visat sig ha dålig aktivitet) gav dock mycket dålig effekt. För resten av diskkoncepten erhölls en god avdödningseffekt med de använda disktiderna. Även ren lut och ren syra gav god effekt, men erfarenheterna från suspensionsförsöken antyder dock att resultaten kan vara

3 stamberoende. Kombinationen av både lut- och syradisk ökar chanserna att få en bra sporavdödning. Undersökning med mikroskop visade att sporerna till största delen satt kvar på stålytan efter disk, även om de hade dött. Inga större skillnader kunde konstateras mellan avdödningseffekt när sporerna sprayats på olika gummimaterial, men avdödningen var signifikant 10 gånger effektivare på rostfritt stål och teflon, än på nitrilgummi, EPDM och silikon. Sporer som blandats med mjölkrester på ytor, som torkats in, eliminerades lättare än sporer på rent stål. I detta fall lossnade också majoriteten av sporerna från ytan. Ett svabbningskit för protein på ytor visade sig ha potential för snabb diskkontroll. Mycket små mängder mjölkprotein (ej synliga för blotta ögat) kunde påvisas med kitet efter disk. Effekten av desinfektionsmetoder för sporer på ytor undersöktes också i diskriggen. Hetvattendesinfektion vid 85 C i 15 minuter var helt verkningslös mot sporer. Kall 0,3% salpetersyra eller citronsyra över natten gav heller ingen effekt. Effekten av natriumhypoklorit var nästan försumbar under de använda betingelserna. P3-Oxonia Aktiv hade mycket liten effekt medan en ny produkt, P3-Oxysan var mycket effektiv, i synnerhet vid hög koncentration. 25 ppm ozon eller 500 ppm hypoklorit vid ph 6,5-8 gav mycket effektiv sporavdödning. Vid ph 12, som är vanlig i kommersiella preparat, var hypokloriten verkningslös mot sporer. Undersökningarna visar att det går att avdöda B. cereus-sporer med rätt utformad disk och desinfektion. När detta inte fungerar är orsaken sannolikt dålig hygienisk design eller brist på underhåll. B. cereus som fått utvecklas i en s.k. biofilm är betydligt svårare att diska bort än sporer på ytor. Inledning Vid disk och desinfektion av mejerianläggningar är de viktigt att organisk smuts, som kan medföra tillväxt av mikroorganismer avlägsnas. Detta är dock inte tillräckligt. Ytorna måste också var mikrobiologiskt rena, d.v.s. att mikroorganismer avlägsnats eller avdödats. Sporer är i detta sammanhang svårast att eliminera, eftersom de är mycket mera resistenta mot värme och kemikalier än vegetativa bakterieceller. Bacillus cereus är den allvarligaste hållbarhetsbegränsande faktorn för konsumtionsmjölk. Sporer finns ofta i mjölken redan från gården och det är känt att B. cereus också kan etablera sig som en återkontaminationsbakterie i olika delar av mejerianläggningen (1-3). Sporer av B. cereus är mycket hydrofoba, och fastnar lätt på ytor av t.ex. rostfritt stål. Sporerna är extremt hydrofoba även i jämförelse med sporer från andra Bacillus-arter (4) och de är svåra att avdöda (5). Förmågan att lätt fastna kan vara en del av förklaringen till att B. cereus orsakar diskproblem på mejerier. I samband med diskproblem uppstår problemet att kunna veta vilka förändringar av diskparametrar som är effektiva. Uppfattningen om vilka diskmedel och procedurer som eliminerar B. cereus-sporer varierar mellan olika anläggningar. En anledning till detta kan vara att det är svårt att skilja effekten av diskparametrar (Tabell 1) från problem med dålig hygienisk design. Det finns därför ett behov att känna till vilken effekt olika diskparametrar i renodlat skick har på sporerna. I denna rapport redovisas resultat från flera olika undersökningar där vi systematiskt har studerat inverkan av disk på sporer av B. cereus. Undersökningarna har genomförts dels som ett förprojekt med NUTEK-stöd i samarbete mellan SMR, SIK och Norske Meierier (Avdödning av sporer på ytor av processutrustning), i huvudsak som ett

4 industrigemensamt projekt vid SIK (IG 154, Avdödning av sporer på ytor och i processutrustning) och till en del som ett projekt med SLF-stöd inom Svensk Mjölk (6). Ett flertal personer har bidragit under olika delar av projekten: Anders Christiansson, Jörgen Nilsson och Hiroshi Ogura, Svensk Mjölk; Ulf Rönner, Ulrika Husmark, Ulla Stenmo, Annika Andersson, Ulla Olofson och Ingela Karlsson, SIK. Harriet Alnås från Arla Foods har haft en ledande roll i styrgruppen för SIK-projektet. Denna rapport sammanfattar de viktigaste resultaten av dessa undersökningar. Tabell 1. Faktorer som påverkar disk och desinfektionsresultatet Disktemperatur Lut-koncentration Syra-koncentration Flöde/turbulens Tid Vattenhårdhet Nedsmutsningsgrad Sammansättning hos formulerade diskmedel Bakteriestam/sporernas egenskaper hos stam Materialbeskaffenhet (ytans sammansättning) Materialtålighet (korrosionsbenägenhet) Tensid Komplexbildare ph Desinfektionsmedelstyp Hygienisk design Material och metoder Nedan ges endast en översiktlig beskrivning av försöksmetodiken. Mera detaljer finns i Appendix 1. Bakteriestammar: I flertalet försök användes B. cereus 341, som är en psykrotrof stam isolerad från smör och B. cereus 229 (typstammen, NCTC 2599), som är mesofil. I olika delförsök användes också andra stammar och även några andra Bacillus-arter, se nedan. Sporframställning: Värmeresistensen hos Bacillus-sporer påverkas både av odlingsförhållandena och sammansättningen på odlingsmediet (7). Därför odlades stammarna på ett standardiserat sätt och med samma odlingsmedium hela tiden. Stora satser av sporer togs fram och frystes in i lämpliga portioner i en koncentration av cirka 1-10 miljarder sporer/ml. För varje delförsök användes endast en sporbatch, så att inte eventuella skillnader i sporernas egenskaper skulle kunna påverka försöksresultaten. D-värdesbestämning i suspension: Det s.k. D-värdet (den tid som krävs för att avdöda 90% av sporpopulationen, d.v.s. tiden för en log-reduktion i antal) (5) bestämdes vid olika temperaturer och koncentrationer av lut och syra. 0,3 ml sporsuspension sattes till en 100 ml kolv med 29,7 ml förvärmd vätska (lut, syra eller desinfektionsmedel) i ett vattenbad. Temperaturen registrerades med ett termoelement i en parallell kolv med 30 ml testlösning utan sportillsats. 1 ml prov togs ut efter olika tider, neutraliserades och plattspridning gjordes. D-värden bestämdes genom linjär regression för den logaritmerade halten överlevande sporer mot tiden (se appendix 2). D-värdesbestämning på ytor: Rostfria, kallvalsade sterila ytor av rostfritt stål besprutades med sporsuspension med en s.k. Air-brushspruta, avsedd för sprutmålning av modeller. Detta ger en jämn och tunn sporhinna på hela ytan. Efter torkning sattes 3 plattor i ett ställ som sänktes

5 ned i testlösningen, som tempererats i ett vattenbad. Efter olika tider togs stället upp, ytorna doppades i steril buffert för neutralisering i 30 sekunder, och svabbades sedan med en alginatsvabb. Halten överlevande sporer per yta bestämdes genom plattspridning på TGA. 3 parallella plattor analyserades för varje tid. D-värden bestämdes som ovan. I samband med D-värdesbestämningar kan ett antal artefakter uppträda, som försvårar tolkningen av resultatet (8). En sådan är uppkomsten av svansning på avdödningskurvorna, d.v.s. att kurvan efter en tid inte längre är linjär, utan planar av. I de fall detta inträffade så beräknades D-värdet från den initiala linjära delen. Andra mätmetoder på ytor: TTC-metoden: För att mäta låga halter av överlevande sporer på ytor kan en övergjutningsmetodik användas. Härvid gjuter man ett tunt lager TTC-agar ovanpå stålplattan. Denna inkuberas och kolonier blir synliga som röda punkter p.g.a. att de reducerar tetrazoliumklorid (9). Denna metod är ofta känsligare än svabbmetoden, men kan inte användas vid höga halter. Direkt epifluorescensmikroskopi (DEM): De behandlade plattorna färgas in och undersöks med fluorescensmikroskopi. Ett bildbehandlingprogram räknar alla infärgade fluorescerande sporer. Denna metod kan användas för att mäta i vilken grad sporer lossnat från ytan i samband med disken. Swab N-Check: Detta är ett proteinbestämningskit från Konica (Labdesign), som kan användas för att svabba behandlade ytor för att påvisa eventuella proteinrester efter disk. Ytan svabbas och svabben sätts till ett provrör med reagenslösning. Graden av förorening kan bedömas efter färgutvecklingen i röret. Kitet är känsligt nog att detektera även för ögat osynlig smuts. Försök i diskrigg: För att bättre efterlikna förhållandena vid industridisk genomfördes flertalet av försöken i en diskrigg från Lagafors. Riggens uppbyggnad visas i Figur 1. Riggen arbetar med en volym på 120 liter. Parametrar som kan varieras är flödeshastigheten, kemival, koncentrationer, tider, temperaturer etc. Parametrar som mäts upp och dokumenteras vid varje körning är tider, temperatur, koncentrationer (konduktivitet) och flödeshastighet. I disktuben (07) kan stålbitar (45*45 mm) som sprayats med sporer sättas in i en hållare för att sedan behandlas i disken. Under försöken hölls flödeshastigheten konstant vid 1,5 m/s. Några viktiga begrepp: D-värden och logreduktioner För förståelsen av resultaten är det viktigt att dessa begrepp är bekanta. Se appendix 2.

Figur 1. Teknisk beskrivning av diskriggen 6

7 Resultat och diskussion Försök i labskala D-värden i lut och syra I den inledande försöksomgången studerades effekten av lut- och syra-koncentration, temperatur och tid på sporer i suspension. I detta system mäts effekten av dessa parametrar på sporerna utan att närvaro av ytor, smuts eller andra komponenter i formulerade diskmedel stör, där det inte är möjligt att renodla effekten av syra och lut. Parallellt genomfördes också motsvarande studier på stålytor i labskala. Syftet med detta var att undersöka om sporernas resistens är annorlunda om de sitter på ytor. Figur 2A visar ett exempel på avdödningskurva för B. cereus 341 i suspension och Figur 2B på yta. I båda fallen erhölls linjära avdödningskurvor för vilka D-värden kan beräknas. Det var inte praktiskt möjligt att mäta avdödningen på ytor över lika många 10-potenser som i lösning. Metodiken är också betydligt mera arbetsam. D-värden förklaras i Appendix 2. Fig. 2 Avdödningskurvor för sporer av B. cereus 341 i suspension (A) och på stålyta (B). 1,5% NaOH vid 70 C. Sporhalten anges i 10-logaritmer/ml och tiden i minuter A B För stam 341 undersöktes systematiskt effekten av koncentration och temperatur på D- värdena (Tabell 2). Tabellen visar variationen mellan försöken i form av standardavvikelse. Variationen mellan upprepade analyser var ibland ganska stor, vilket också konstaterats i andra undersökningar (10). Det är tydligt att D-värdena minskar för både lut och syra med ökande temperatur. Vid 55 och 65 C var D-värdena höga, i genomsnitt 38 respektive 20 minuter vid 1,5% lut i suspension. Dessa värden motsvarar alltså den tid som krävs för reducera sporpopulationen med en faktor 10. I förhållande till de disktider som används vid mejeridisk är tiderna långa, vilket innebär att avdödningseffekten är liten vid dessa temperaturer. Vid 75 C var D-värdet 4,5 minuter. I intervallet 55-75 C kunde z-värdet (den temperaturhöjning som krävs för att D-värdet ska förändras med en faktor 10) beräknas till 19 C (Figur 3). Från figuren kan också beräknas att en höjning av temperaturen till 80 C skulle ge ett D-värde för 1,5% lut på cirka 2,5 minuter för stam 341. Sporer av B. cereus är normalt resistenta mot värme vid de ovan undersökta temperaturerna. Anledningen till att lut har en avdödande verkan är att lut i kombination med värme extraherar ut protein ur det skyddande höljet på sporerna vilket gör att de dör (11).

8 Tabell 2. D-värden för sporer av B. cereus 341 i NaOH och HNO 3 vid olika temperaturer Diskmedel Temperatur ( C) D (min) +/- std.av. i suspension Antal analyser D (min.) +/- std.av. på stålyta Antal analyser 1,5 % lut 55 38 +/- 9,9 2 92-1 1,5 % lut 65 20 +/- 4,0 4 26 +/- 6 3 1,5 % lut 70 7,5 +/- 0,7 2 7,0 +/- 1,3 3 1,5 % lut 75 4,5 +/- 0,7 6 5,0 1 0,6% syra 55 5,2 +/- 0,4 2 11 1 0,6% syra 65 1,6 +/- 0,2 5 3,2 1 0,9% syra 55 2,7 +/- 0,5 3 5,4 +/- 1,0 4 0,9% syra 65 1,4 +/- 0,6 3 1,9 +/-0,3 3 0,9% syra 70 - - 0,9 1 Std.av : standardavvikelse Figur 3. Avdödningshastighetens (D-värdets) temperaturberoende för B.cereus-sporer. 1,5% lut. 2,0 LOG D-värde (minuter) 1,5 1,0 z=19 C 0,5 50 60 70 80 TEMPERATUR C Salpetersyra avdödade sporer betydligt effektivare än lut (Tabell 2). Redan för 0,6% syra vid 55 C var D-värdet 5,2 minuter och vid 65 C 1,6 minuter. En höjning av koncentrationen till 0,9% minskade D-värdena ytterligare. För 0,6% salpetersyra var z-värdet 20 C i intervallet 55-65 C. Figur 4 visar de enskilda D-värdena uppmätta i suspension och på yta för 1,5% lut vid olika temperaturer. Med hänsyn taget till variationen i försöksresultaten finns det ingen signifikant skillnad i avdödning om sporerna finns i lösning eller sitter fast på en yta. Inga skillnader mellan sporer på stålyta och i suspension kunde heller påvisas vid avdödning i vatten mellan 90 och 112 C i en annan undersökning (12).

9 Figur 4. Jämförelse mellan D-värden på yta (Y) och i suspension (S) i 1,5% lut vid olika temperaturer 2,0 Y LOG D-VÄRDE (minuter) 1,5 1,0 S S Y S Y S Y SY Y S Y 0,5 50 60 70 80 TEMPERATUR Y Skillnader i känslighet för lut och syra mellan olika stammar För att undersöka om det fanns variationer i D-värden mellan olika stammar av B. cereus jämfördes D-värdena för stam 219, 341 och SMR 719 (Tabell 3). Stam 229 och 719 var betydligt mera känsliga för 1% lut vid 70 C än stam 341. Å andra sidan var stam 341 mera känslig för syra än de andra stammarna. Stam 719 var mera känslig för lut än för syra under de rådande testbetingelserna. Tabell 3 Jämförelse av D-värden för tre olika Bacillus cereus-stammar Stam 1% NaOH,70 C 0,6% HNO 3,55 C SIK 341/ SMR 781 13,6 +/- 0,5 5,2 +/- 0,4 SMR 719 2,4 +/- 0,2 5,9 +/- 0,1 SIK 229 3,0 +/- 0 9,1 +/- 0,4 Medelvärde +/- standardavvikelse, 2 analyser per försök Eftersom detta tyder på att stamvariationer kan ha betydelse för disk- och desinfektionsresultat gjordes en jämförelse mellan ytterligare 10 bakteriestammar och de två ovanstående. 6 stammar (SMR A t.o.m. SMR F) var isolerade från mejeriprodukter, två stammar (Ellco 7440 och 7480) kom från nöttalg, samt Danisco 581 och 586 från sockerproduktionsmiljö. Samtliga stammar utom Daniscos var B. cereus. Danisco-stammarna var inte artbestämda. Nr 581 var termofil och 586 mesofil. Lut och syra späddes till brukskoncentration i kranvatten (5 dh). För lut valdes 1% NaOH och värmning vid 75 C och för syra 0,9% salpetersyra vid 65 C. I dessa försök fixerades värmningstiden till 10 minuter för att underlätta analysarbetet. 10 minuter kan anses motsvara en ganska relevant disktid och koncentrationerna och temperaturerna är ofta använda i praktiken. Figur 5 visar startkoncentration av sporer respektive koncentration efter 10 minuters behandling (felstaplarna anger en standardavvikelse) med lut respektive syra. Försöken bekräftar tidigare resultat att syra är effektivare än lut för avdödning av B. cereus-sporer. Vissa skillnader i logreduktion fanns mellan de olika stammarna (Tabell 4). Stam 341 avdödades även i detta försök sämre än stam 229 i lut (jämför Tabell 3). Stam SMR B var minst känslig för

10 Figur 5 Olika B.- cereus-stammars känslighet för lut och syra Log. sporer/ml 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 229 341 SMR A SMR B SMR C SMR D SMR E SMR F Ellco 7440 Ellco 7480 Danisco 581 Danisco 586 1% NaOH vid 75 C Startvärde log konc. Log konc. efter 10 min. Log. sporer/ml 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 229 341 SMR A SMR B SMR C Stam SMR D SMR E SMR F Ellco 7440 Ellco 7480 Danisco 581 Danisco 586 0,9% HNO 3 vid 65 C Startvärde log konc. Log konc. efter 10 min. Stam lut och stam SMR A den mest känsliga. På 10 minuter var skillnaden mellan den mest känsliga och den mest resistenta stammen 3 log-enheters avdödning (1000 gångers skillnad i avdödning). Övriga B. cereus-stammar var relativt lika i lutkänslighet och 3,5-4 logenheter avdödades på 10 minuter. Den termofila stammen Danisco 581 var överhuvudtaget inte känslig för lut. Den minst syrakänsliga B. cereus-stammen var SMR C och den mest känsliga Ellco 7440 bland B. cereus. Skillnaden i logreduktion (se appendix 2) på 10 minuter mellan dessa stammar var 2,5 logenheter. Danisco 581 avvek även här genom att vara extremt syrakänslig. Fullständig avdödning (7 log-enheter) erhölls. Data om D-värden för B. cereus-sporer i lut och syra är mycket knapphändiga i litteraturen. Vi har inte hittat några studier som jämför olika stammars egenskaper. Det är tydligt att avdödning av sporer kan vara stamberoende och i vissa fall kan förhöjd lut- eller syratemperatur, alternativt förlängd disktid, vara nödvändigt för att eliminera särskilt resistenta sportyper.

11 Tabell 4. Logreduktion av Bacillus sp. efter 10 minuters behandling med 1% NaOH vid 75 C respektive 0,9% HNO 3 vid 65 C Bacillus stam NaOH HNO 3 229 3,2 5,0 341 2,1 3,5 SMR A 4,8 4,8 SMR B 1,9 3,6 SMR C 3,2 2,7 SMR D 3,4 4,1 SMR E 3,5 3,7 SMR F 3,2 5,1 Ellco 7440 3,9 5,3 Ellco 7480 2,2 2,9 Danisco 581 0 7,0 Danisco 586 3,6 4,6 Effekt av olika disk- och desinfektionsmedel i suspension Efter att ha undersökt effekten av syra och lut gjordes också jämförelser mellan avdödningseffekten för ett antal kommersiella preparat (Tabell 5). 12 olika medel studerades. Även dessa försök gjordes med sporer i suspension för att renodlat studera deras avdödningseffekt. Medlen valdes av de deltagande företagen antingen på grund av att man ville testa medel man redan använde eller som man förmodade skulle ha god sporavdödningseffekt. Koncentrationer och temperaturer valdes inom det område som leverantörerna rekommenderar eller så som de användes av företagen. Detta betyder att de inte jämfördes under helt likvärdiga förhållanden utan endast under de förutsättningar som gavs. Stam 229 och 341 testades. Dessutom undersöktes en Bacillus-stam som isolerats från sockerråvara, troligen en B. subtilis. Kranvatten med 5 dh användes i beredningen av disklösningarna. D-värden bestämdes som tidigare. Koncentrationerna i Tabell 5 är angivna i volymprocent av koncentraten. Figur 6 visar att bland de sura diskmedlen var P3 Horolith V+Stabicip NA (innehåller både salpetersyra och fosforsyra) lika effektivt som ren salpetersyra, medan P3 Horolith CIP hade betydligt sämre effekt (innehåller fosforsyra och fosfonsyra). D-värdet för stam 341 gick inte att mäta inom ramen för försökets tid (saknas). En förklaring till den sämre effekten av P3 Horolith CIP kan vara att fosforsyran till skillnad från salpetersyra inte är oxiderande, och därmed skadar sporerna mindre effektivt. Bland de alkaliska diskmedlen var SU 224 CIP jämförbar med ren lut i avdödningsförmåga. P3VR hade jämförbar effekt för stam 229 men bättre avdödande effekt för stam 341.

12 Tabell 5 Disk- och desinfektionsmedel som testats i suspensionsförsök genom D-värdes bestämning Kemikalie/ Leverantör Temp. Bruks Typ av aktiv substans ph Anmärkning handelsnamn lösning Salpetersyra Hydrokemi 60 C 0,9% Salpetersyra 0,9 Disk, referens P-3 Horolith V Henkel- 60 C 1,5% Salpetersyra+ 1,1 Disk P-Stabicip NA Ecolab 0,5% fosforsyra Komplexbildare, nonjonaktiv tensid P3-Horolith CIP Henkel- 65 C 1,5% Fosforsyra, tensider, 1,6 Disk Ecolab fosfonsyra SU 224 CIP Leverindus 75 C 1,9% NaOH. komplexbildare, tensider P3-VR 1260-41 Henkel 75 C 0,7% 0,2% NaOH, komplexbildare, tensider hög konc. 12,3 Disk 12,1 Disk Natriumhydroxid 75 C 1% NaOH 12,5 Disk, referens Divosan Mezzo Diversey Rumstemp 2,5% Perättiksyra 1,7 Desinf. hög konc. SU 338 Peroksi Leverindus 40 C 1% Perättiksyra +stabilisator Divosan Forte Diversey Rumstemp 0,5% Perättiksyra +stabilisator ML 96/006 Henkel Rumstemp 0,6% Perättiksyra, anjonaktiv tensid P3-Oxonia Aktiv Henkel Rumstemp 0,5% Väteperoxid, perättiksyra Ren vattentank/ Renové AB 55 C 5% Väteperoxid, oxidativt Biodes additiv 2,9 Desinf. max. temp. 3,6 Desinf. hög konc. 3,6 Desinf. 4,0 Desinf. 10,9 Desinf./disk 35 30 D-värde (minuter) 25 20 15 10 5 0 Stam 229 Stam 341 Figur 6. D-värden i suspension för olika disk- och desinfektionsmedel

13 Desinfektionsmedlen hade mycket varierande effekt. Samtliga medel utom Biodes hade lågt ph. Divosan Mezzo hade lika god aktivitet som salpetersyra medan Divosan Forte hade mycket dålig avdödningseffekt på stam 341. Båda preparaten är baserade på perättiksyra, men Divosan Mezzo användes vid högre koncentration och lägre ph, vilket ökar effekten. Båda medlen användes i högre koncentrationer än vad som normalt rekommenderas. SU 388 Peroksi hade mycket god effekt mot stam 229 (bättre än salpetersyra) men effekten mot stam 341 var lägre än med salpetersyra. Användningstemperaturen var hög, 40 C, vilket ökar effekten. Oxonia Aktiv hade mycket höga D-värden (låg aktivitet) mot båda stammarna, särskilt mot stam 341 (värde saknas). Detta medel hade högst ph bland de sura desinfektionsmedlen (vilket minskar aktiviteten), samtidigt som preparatet testades i rumstemperatur. Även andra studier tyder på att Oxonia Aktiv har dålig aktivitet mot B. cereus-sporer (13, 14). Den ena undersökningen visade dock att effekten av Oxonia ökar om sporerna först utsätts för alkalisk disk (13). ML96/006 hade genomsnittligt bäst aktivitet bland samtliga testade medel. Biodes, ett disk/desinfektionsmedel med ph 10,9, hade sämst aktivitet av samtliga och mycket höga (ej mätbara) D-värden. Sporer är generellt mycket svårare än vegetativa bakterieceller att avdöda med desinfektionsmedel. Resultaten visar att det dock finns flera avdödningskoncept som fungerar mycket bra, men att det är viktigt att försäkra sig om vilka användningsbetingelser som behövs för att få en effektiv sporavdödning, samt att det är viktigt att veta att det kan finnas skillnader i känslighet mellan olika stammar av B. cereus. Försök i diskrigg i pilotskala Under försöken i diskriggen (Fig. 1), som gjordes för att närmare efterlikna industriell disk, hölls flödeshastigheten konstant på 1,5 m/s. Arbetsvolymen var 120 liter. I samtliga diskar ingick 5 minuters försköljning med kallt vatten, 5 minuters mellansköljning för tvåfasdiskarna och 5 minuters slutsköljning med vatten. Avdödning och borttagning från ytor med olika diskmedelskoncept Tio olika diskmetoder testades på stålytor som sprayades med sporer och sedan diskades i diskriggen (Tabell 6). Koncentrationsangivelserna anges i viktsprocent. I diskprocessen styrdes koncentrationen genom konduktivitetsmätning och dosering med pump och kontrollerades genom titrering av respektive medel. Disk 1-4 var rena kombinerade lut- och syradiskar, med disk 1 som referensdisk (samma betingelser som vid suspensionsförsöket med olika disk- och desinfektionsmedel, se Tabell 5). Dessutom diskades även med endast lut respektive endast syra. Disk 5-8 gjordes med formulerade diskmedel enligt önskemål från mejerirepresentanter och diskmedelstillverkare. Även dessa försök gjordes under inte helt jämförbara betingelser, p.g.a. olika temperaturer, tider och koncentrationer. Disk 1-4 utfördes vid 3 olika tillfällen/datum, ren lutdisk 2 gånger, ren syradisk gjordes en gång. Disk 5-8 gjordes endast en gång vardera. Sporhalten mättes både genom svabbning, TTC-test och DEM.

14 Tabell 6 Disktest med olika diskkoncept för sporer på stålytor i diskrigg Disk Fas 1 Fas 2 Anmärkning 1 Lut 1%, 75 C, 15 min Syra 60 C, 0,9%, 15 Referensdisk min 2 Lut 1%, 75 C, 15 min Syra 70 C, 0,9%, 15 Högre syratemp. min 3 Lut 1%, 75 C, 15 min Syra 70 C, 1,5%, 15 min Högre syratemp och syrakonc 4 Syra 0,9%, 60 C, 15 min Lut 75 C, 1%, 15 min Omvänd ordning mot referensdisken Lutdisk Lut 1%, 75 C, 15 min - Endast lutfasen Syradisk Syra 0,9%, 60 C, 15 - Endast syrafasen min 5 Lut 0,7% med additiv P3-VR-1260-41 (Henkel), 78 C. 5 min. Syra 0,72%, 70 C, 5 min. 6 Syra 1,32%. 66 C, 10 min. 7 P3-paradigm 10, 0,05% + P3-Paradigm 30 0,04%, 55 C, 10 min. 8 Lut med additiv P3- MIP SP, 1,5% 65 C, 10 min Lut 1% med additiv 0,08% SU 550 (Diversey-Lever), 82 C, 10 min. Desinfektion: 0,2% P3-Oxonia aktiv S, 5 min. Fosforsyra P3- Horolith CIP, 1%, 65 C, 10 min Omvänd ordning, syra först Figur 7 visar logreduktionen för de olika diskkoncepten. Observera att en hög stapel innebär hög diskeffekt. Variationen mellan de olika delförsöken var ganska stor och låg oftast mellan 0,5-1,5 logenheter för parallellerna. De relativa skillnaderna mellan de olika diskkoncepten var likartade för stam 341 och 229, så i Figur 7 visas genomsnitt och standardavvikelser för samtliga diskkoncept och upprepningar av delförsök oavsett stam. Vid variansanalys av resultaten från disk 1-4 var disk 1 signifikant sämre (4 logreduktioner i snitt för de två stammarna) än de övriga (knappt 5 logreduktioner, p=0,02), medan inga skillnader kunde påvisas mellan disk 2-4. En ökning i syratemperatur från 60 till 70 C gav alltså ökad effekt, men ytterligare höjning av koncentrationen vid denna temperatur gav ingen mätbar ökning. Omvänd ordning på lut och syra i disk 4, Figur 7, (koncentrationer som i referensdisk) gav samma resultat som förhöjd syratemperatur. Med hänsyn till de D-värden som tidigare noterats var avdödningen med endast lut förvånansvärt stor. Detta kan bero på att stålplattorna inte stoppades i neutraliseringslösning före svabbning. Figur 8 visar kompletterande data för sporer i suspension i 1,0 och 1,5% lut, tagna från de tidigare delförsöken. Sett över ett bredare temperaturintervall är även effekten av en temperaturhöjning för lut proportionellt större än vid en koncentrationshöjning.

15 Figur 7 Sporavdödning med 10 olika diskmetoder (tabell 6) Log sporavdödning/ml 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 Alla data från båda stammarna 0,00 Disk 1 Disk 2 Disk 3 Disk 4 Lut Syra Disk 5 Disk 6 Disk 7 Disk 8 Figur 8. Inverkan av temperatur och olika lutkoncentrationer på D-värdet (i suspension) för stam 341 40 D-VÄRDE (MINUTER) 30 20 10 0 50 60 70 80 TEMPERATUR C KONC % 1, 0 1,5 Bland de formulerade medlen hade disk 5 en mycket god effekt (hög lut och syratemperatur), men även disk 6 och 8 fungerade bra. Disk 7, som skedde vid 55 C, gav dålig effekt, endast 1-2 logreduktioner. Detta stämmer bra med tidigare resultat att sporerna överlever disk bättre vid låg temperatur. Figur 9 visar resultaten från TTC-agartestet. Låga halter av överlevande sporer fanns i någon utsträckning på flertalet prover och i synnerhet vid disk 7, vilket stämmer med svabbresultaten. Variationen mellan parallella prover kunde vara stor, vilket bidrar till svårigheten att få repeterbara logreduktionsvärden. Även vid svabbning var parallellproven mycket varierande. Erfarenheterna stämmer här överens med liknande ytförsök med vegetativa bakterier (15). En svaghet i försöket är också att utgångssporhalten varierade mellan de olika försöken (9*10 4 till 3,6*10 6 /platta för enskilda prov), eftersom det då i vissa fall inte gick att avgöra hur stor logreduktion som egentligen skett för de prover där sporer inte kunde påvisas efter disk. I vissa fall, t.ex. för syra, kan logreduktionen ha varit betydligt större än den uppmätta.

16 Figur 9. Överlevande sporer på stålytor efter disk med 10 olika diskmetoder (tabell 6) Överlevande sporer/platta (TTC) 10000 1000 100 10 1 0,1 0,01 1:1 2:1 3:1 4:1 Stam 341 Lut:1 Syra:1 5:1 6:1 7:1 8:1 Disk 1000 Överlevande sporer/platta (TTC) 100 10 1 0,1 Stam 229 0,01 1:1 2:1 3:1 4:1 Lut:1 Syra:1 5:1 6:1 7:1 8:1 Disk Figur 10 A Kvarsittande sporer på stålytor efter 10 olika diskmetoder (tabell 6) Kvarsittande sporer, % av ref (DEM) 120 100 80 60 40 20 0 Stam 341 Ref 1 2 3 4 Lut Syra 5 6 7 8 Disk

17 Kvarsittande sporer, % av ref (DEM) 120 100 80 60 40 20 0 Stam 229 Ref 1 2 3 4 Lut Syra 5 6 7 8 Disk Figur 10 B Kvarsittande sporer på stålytor efter 10 olika diskmetoder (tabell 6) Reduktionen i antalet sporer i riggförsöken kan i princip har två orsaker: antingen att sporerna avdödats eller att de lossgjorts från ytan p.g.a. diskverkan. Figur 10 visar resultat från DEManalysen där kvarvarande sporer på ytorna räknats. Endast 20-40% av sporerna i disk 1-4 hade lossnat. Resten satt kvar på stålet, trots att de avdödats. Liknande erfarenheter har redovisats av Andersson (16). De fann att sporer som inte aktiverats eller grott hade mycket större förmåga att sitta kvar på ytor än aktiverade sporer. Det fanns skillnader i adhesionsförmåga mellan olika stammar av B. cereus (16). Ingen ökad borttagningseffekt fanns vid disk 5-8 där formulerade medel använts och man kunde ha förväntat sig att dessa skulle underlätta losstagning. Avdödning och losstagning från ytor av olika material I en mejerianläggning finns förutom rostfritt stål ett antal olika gummimaterial i packningar av olika slag. Det är känt att packningar åldras med tiden och då kan utgöra en hygienisk risk men det kan också tänkas att sporerna fastnar olika väl på dessa material. I detta försök sprayades sporer av B. cereus 341på ytor bestående av rostfritt stål, nitrilgummi (NBR), EPDM, silikon och teflon. Nitrilgummibitar snabbåldrades också i 1% salpetersyra vid 80 C i 20 dygn i ett försök. Ytorna sprayades med högre sporkoncentrationer än tidigare för att kunna mäta över ett större mätintervall. Diskprogrammet utgjordes av den tidigare använda referensdisken, d.v.s. 1% lut, 75 C i 15 minuter och därefter 0,9% syra, 60 C i 15 minuter med samma sköljningar som i försöket med olika diskkoncept. Figur 11 visar den genomsnittliga logreduktionen för två försök, med vardera 3 parallellanalyser per delförsök. Beräkningarna är gjorda med variansanalys och felstaplarna anger minsta signifikanta skillnad mellan materialen. Sporerna reducerades med cirka 6 log på stål och teflon och med cirka 5 log för nitrilgummi, EPDM och silikon. Skillnaderna var statistiskt signifikanta (p=0,01). Det ska observeras att logreduktionen på rostfritt stål med denna sporbatch var väsentligt högre än i undersökningen med olika diskkoncept. Detta berodde till stor del men inte enbart på det utökade mätområdet. Avdödningen på åldrad NBR var lika effektiv som på färskt material.

18 Figur 11. Avdödningseffekt för sporer på olika ytmaterial (Disk 1, tabell 6) 8 LOGREDUKTION 6 4 2 EPDM NBR SILIKON YTA STÅL TEFLON Inverkan av livsmedelsrester på diskresultatet I naturliga system kan det finnas livsmedelsrester kvar som kan tänkas påverka sporernas reduktion. Därför undersöktes också stålytor som sprayats med en sporblandning i utspädd mjölk, blod och risgrynsgröt. Dessutom sprayades sporer på en yta som tidigare blivit inbränd med sirap. Som diskrutin användes referensdiskmetoden enligt ovan. Stammar med ursprung i respektive miljö användes för testerna. För både mjölk, blod och risgrynsgröt erhölls en logreduktion med 6 till 7 tio-potenser. Detta är en mycket hög reduktion och översteg den som erhölls för rent stål i Figur 11. Mängden kvarvarande sporer efter disk var genomgående lägre än för rena ytor, vilket syntes både med svabb och TTC. Liknande resultat erhölls också i en undersökning där sporer i mjölk sprayades på silikoniserade glasplattor (16). På ytor med inbränd sirap var endast cirka 100 sporer/platta möjliga att odla fram, troligen beroende på hämning av den inbrända sirapen. Dessa eliminerades nästan helt vid disken, men ytorna blev inte rena. För att ta bort den inbrända sirapen diskades också med P3-MIP SP 1,5% med tillsats av VP 0,1% (väteperoxid) vid 75 C i 15 minuter. Denna behandling tog bort merparten av beläggningen, vilket visar fördelen med additiv till lut-lösning vid svår nedsmutsning. DEM-mätningar visade att sporerna till mycket stor del lossnat från ytorna i storleksordningen med 95%. Detta är helt annorlunda än för sporer på rena ytor, där merparten fanns kvar efter disk. I närvaro av livsmedelsrester är alltså losstagningseffekten en viktig del av sporreduktionsmekanismen. Ytorna svabbades också efter disk för att kontrollera eventuella proteinrester med Swab N- Check. Mängden kvarvarande protein var mycket låg och endast mätbar för mjölk (20-40µg/m 2) vilket ej är synligt för ögat. Detta proteinbaserade hygientest skulle därför kunna vara användbart för kontroll av mejeridisk. Inverkan av desinfektionsmetoder på ytor Som sista etapp i disken används oftast någon form av desinfektion, antingen kalldesinfektion efter sköljning eller hetvattendesinfektion före uppstart av anläggningen. Effekten av ett antal olika desinfektionskoncept på sporer på stålytor undersöktes (Tabell 7). Koncentrationen av de olika medlen kontrollerades genom titrering. Vid körningen i riggen gjordes 5 minuters

19 försköljning och en slutsköljning i 5 minuter i kallt vatten efter desinfektion. Stålbitarna doppades i neutraliseringslösning före svabbning. Tabell 7 Effekt av olika desinfektionsmetoder på sporer på rostfritt stål Desinfektionsmetod Log-avdödning stam 229 Log-avdödning stam 341 Referens: Kallvatten 10 C, 15 0 0 min. Hetvatten 85 C, 5 minuter 0,3 0,1 Hetvatten 80 C, 15 minuter 0,1 0 Referens 0,3% HNO 3, 10 C över 0 0 natt 0,3% HNO 3, 60 C, avsvalning 4,2 3,7 över natt 0,3 % citronsyra, 10 C, över natt <0,1 <0,1 P3-Hypokloran 0,24%, 20 C, 15 0,3 0,3 minuter, ph 8 P3-Oxysan 0,9%, 20 C 15 min. 6,2 6,0 P3-Oxysan 0,15%, 20 C 15 min. 2,0 0,5 P3-Oxonia Aktiv S, 0,25%, 15 min. 1,1 0,3 Tabell 7 visar avdödningen för de olika koncepten. Varken kallvatten, hetvatten 80 eller 85 C hade någon signifikant effekt på sporerna. Detta är förväntat med hänsyn till bakteriesporers värmeresistens. Eventuella sporer som finns kvar efter disk i en anläggning kommer därför inte att avdödas vid hetvattendesinfektion. Däremot har hetvattendesinfektion god effekt mot vegetativa bakterieceller. Ingen avdödning skedde heller med kall 0,3% salpetersyra. Kall salpetersyra har dock en god bakteriostatisk effekt och hindrar bakterietillväxt när anläggningen inte är i drift. Däremot hade 60 salpetersyra som fick verka under natten och kallna en reduktionseffekt med cirka 3-4 logenheter. Varken 0,3% citronsyra vid 10 C eller P3 hypokloran (hypoklorit) vid 20 C hade mer än marginell effekt. P3 Oxysan 0,9% uppvisade god desinfektionseffekt, cirka 6 log, mot sporer, medan Oxysan vid 0,15% hade väsentligt lägre effekt, 0,5-2 logenheter. Oxonia Aktiv hade låg effekt, som var något bättre för stam 229 än stam 341 (jämför Tabell 5). För att erhålla effekt mot sporer vid desinfektion är valet av desinfektionsmedel viktigt, men även koncentration och användningstemperatur (se även Tabell 5). Ozon är ett desinfektionsmedel med ännu kraftigare oxiderande verkan än hypoklorit. Inverkan av ozon och klor på desinfektionsresultatet undersöktes i en separat undersökning (6). Härvid användes en liten diskslinga bestående av vattenledningsrör, en vertikal sektion för insättning av testbitar av stål och en kraftig pump. Gasformig ozon genererades i hög koncentration med en ozongenerator och fördelades in i slinga med en injektor. Den maximala ozonkoncentrationen i gasfasen var 25 ppm. Prov för uttag vid suspensionsförsök togs genom en provtagningskran. I slingan testades också effekten av hypoklorit vid olika ph. Figur 12 visar effekten av 500 ppm natriumhypoklorit vid olika ph. Medan klor vid ph 12 hade mycket liten sporavdödande effekt så var effekten mycket god vid ph 6,4 och 8,1. Figur 13 visar effekten av klor och ozon för sporer på ren glasyta. 25 ppm ozon hade lika god effekt som 500 ppm hypoklorit vid ph 6,4. Båda desinfektionsmedlen hade mycket snabb verkan. Vid ph 12 hade klor ingen effekt alls. När sporer i mjölk sprayades på ytor så blev effekten lägre för både klor och ozon. I detta fall hade dock klor effekt både vid ph 6.4 och ph 12

20 (Fig 14). Anledningen till effekten är sannolikt att det även vid ph 12 finns en rengörande verkan hos klor som bidrog till att mjölken och sporerna lossnade. I detta fall var ytorna sprayade med extremt mycket mjölk, vilket försämrade avdödningen avsevärt för båda medlen. Figur 12 Effekt av aktivt klor (500 ppm) på sporer i suspension vid olika ph Log sporer/ml 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 Tid (min) Klor ph 12 Klor ph 8,1 Klor ph 6.4 Figur 13. Jämförelse mellan effekten av 500 ppm aktivt klor och 25 ppm ozon på rena glasytor 7 6 Log cfu/ml 5 4 3 2 1 klor ph 12 Kontroll klor ph 6,4 ozon 0 0 2 4 6 Tid (min)

21 Figur 14. Effekt av ozon (25 ppm) och aktivt klor (500 ppm) på sporer sprayade på ytor med mjölk (1:1) Log cfu/ml 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 Tid (min) ozon klor ph 11,.6 klor ph 6,5 Den koncentration av ozon i vatten som användes i dessa försök är mycket hög (25 ppm) och hälsofarlig om gasen inandas. Det finns idag inga kommersiella applikationer för mejeribruk med denna koncentration. Däremot skulle eventuellt en lägre koncentration kunna användas för desinfektion av ledningssystem, som ett miljövänligt och energisnålt alternativ till hetvattendesinfektion. Detta förutsätter dock noggrann kontroll av systemets säkerhet och att gummimaterial som tål ozon används i packningar och ventiler. Slutsatser Sammanfattningsvis kan sägas att det är fullt möjligt att avdöda B. cereus-sporer både genom disk och desinfektion. Men det är viktigt veta att avdödning med både lut och syra kräver tillräckligt höga temperaturer. Denna undersökning kan ge en viss vägledning. En temperaturhöjning är oftast mera effektiv än en koncentrationshöjning. Vidare finns det skillnader i känslighet mellan sporer från olika stammar av B. cereus med avseende på såväl syra, lut som desinfektionsmedel. Detta måste man ta hänsyn till och kan kompenseras för med förlängda disktider, alternativt temperatur/ koncentrationshöjningar eller byte av desinfektionsmedel. Sammansättning och aktiv substans för desinfektionsmedel är viktiga. Det är intressant att notera att medan Oxonia Aktiv hade liten effekt mot sporer, så hade en annan Henkelprodukt, P3-Oxysan en mycket god effekt. Oxysan är baserad på perättiksyra och väteperoxid liksom Oxonia, men innehåller dessutom en anjonisk tensid, som troligen verkar synergistiskt med den oxidativa effekten, vilket leder till bättre avdödning (17). Samma preparat finns också med i suspensionstest, Tabell 5, under namnet ML 96/006. Även andra perättiksyrabaserade preparat var verksamma (Figur 6). Sporer avdödas lättare på rostfritt stål och på teflon än på gummimaterial av EPDM, nitrilgummi eller silikon. Skillnaderna var dock inte dramatiska. Förhöjda temperaturer och koncentrationer kan leda till snabbare åldrande eller korrosion. Här kan additiv bidra till att minimera dessa effekter (18). Trots att sporerna avdödas verkar de däremot att vara svårt att få dem att lossna från ytan. Här har flödeshastigheten och ett starkt turbulent flöde stor betydelse (19).

22 Resultaten i denna undersökning visar att det går att avdöda B. cereus-sporer eller att diska bort dem från ytor som utsätts för tillräcklig kemi och tillräckligt flöde. Det är sannolikt att de svårare problemen med B. cereus orsakas av organismer som är skyddade i s.k. biofilmer, d.v.s. att de växer tillsammans på en yta där de gemensamt skyddar sig med ett extracellulärt slemhölje (20, 21). Det tar normalt flera dagar för en biofilm att utvecklas fullt ut. Därför är diskintervallen viktiga och i utrustning som får stå oanvänd ökar riskerna för biofilmbildning och därtill hörande problem. Bakterier i biofilmer är mycket svårare att avdöda eller diska bort än bakterier som sitter fritt (22). Från biofilmen kan bakterier kontinuerligt kontaminera produkten under lång tid. Svårigheten att eliminera B. cereus i biofilmer i mjölksystem har visats i flera undersökningar (23, 24). Det är sannolikt att biofilmer, där de uppstår, är betingade av dålig hygienisk design. I en undersökning, med scanning-elektromikroskopi, av packningar i mejerirör fann man inga avlagringar med bakterier i själva rören, men väl i anslutning till gränsytorna mellan packningarna och stålet (25). Kolonisationen av packningarna ökade med åldern. Vid undersökning av packningar i en pastör fann man också levande bakterier, däribland olika Bacillusarter (26). Vi har tidigare visat att pastörer kan vara en källa till kontamination av mjölk med B. cereus (3). Detta tyder på att förutom att ha rätt diskparametrar är det också viktigt med regelbundet underhåll av anläggningen, särskilt objekt som kan vara svårdiskade. Referenser 1. Lin, S., Schraft, H., Oderumu, J.A. & Griffiths, M.W. 1998. Identification of contamination sources of Bacillus cereus in pasteurized milk. International Journal of Food Microbiology 43: 159-171. 2. Svensson, B., Eneroth, Å., Brendehaug, J. & Christiansson, A. 2000. Investigation of Bacillus cereus contamination sites in a dairy plant with RAPD- PCR. International Dairy Journal 9: 903-912. 3. Svensson, B., Eneroth, Å., Brendehaug, J., Molin, G. & Christiansson, A. 2000. Involvement of a pasteurizer in the contamination of milk by Bacillus cereus in a commercial dairy plant. Journal of Dairy Research 67: 455-460. 4. Rönner, U., Husmark, U. & Henriksson, A. 1990. Adhesion of bacillus spores in relation to hydrophobicity. Journal of Applied Bacteriology 69: 550-556. 5. Russell, A.D., Inactivation of Bacterial Spores by Thermal Processess (Moist Heat), in The Destruction of Bacterial Spores. 1982, Academic Press: London. p. 30-87. 6. Christiansson, A., Ogura, H., Ahlqvist, B. & Nielsen, L. 2000. Utvärdering av ozon som möjligt disk- och desinfektionsmedel för mjölkningsanläggningar. Svensk Mjölk. Lund. Reg. nr. 4979. 7. Bergère, J.-L. & O., C. 1992. Heat resistance of Bacillus cereus spores. Bulletin of the International Dairy Federation (275): 23-25. 8. Cerf, O. 1970. Tailing of survival curves of bacterial spores. Journal of Applied Bacteriology 41(1): 1-19. 9. Husmark, U., Faille,C., Rönner, U., Benezech, T. 1999. Bacillus spores and moulding with TTC agar: a useful method for the assessment of food processing equipment cleanability. Biofouling 14: 15-24.

10. Bloomfield, S.F. & Looney, E. 1992. Evaluation of the repeatability and reproducibility of European suspension test methods for antimicrobial activity of disinfectants and antiseptics. Journal of Applied Bacteriology 73: 87-93. 11. Bloomfield, S.F. & Arthur, M. 1994. Mechanisms of inactivation and resistance of spores to chemical biocides. Journal of Applied Bacteriology 75: 91S-104S. 12. Pfeiffer, J. & Kessler, H.G. 1995. Heat reisistance of Bacillus cereus spores located between seals and seal surfaces. Journal of Food Protection 58(11): 1206-1210. 13. Langsrud, S., Baardsen, B. & Sundheim, G. 2000. Potentiation of the lethal effect of peroxygen on Bacillus cereus spores by alkali and enzyme wash. International Journal of Food Microbiology 56: 81-86. 14. Blakistone, B., Chuyate, R., Kautter Jr, D., Charbonneau, J. & Suit, K. 1999. Efficacy of Oxonia Active against selected spore formers. Journal of Food Protection 62(3): 262-267. 15. Bloomfield, S., Arthur, M., Van Klingeren, B., Pullen, W., Holah, J.T. & Elton, R. 1994. An evaluation of the repeatability and reproducibility of a surface test for the activity of disinfectants. Journal of Applied Bacteriology 76: 86-94. 16. Andersson, A. & Rönner, U. 1998. Adhesion and removal of dormant, heatactivated, and germinated spores of three strains of Bacillus cereus. Biofouling 13(1): 51-67. 17. Meyer, B. & Meltz, K.-D., P3-Oxysan - et nyt pereddikesyre-baseret desinfektionsmiddel med öget effekt på grund af synergisme, in Maelkeritidende. 1999. p. 480-482. 18. Bragulla, S., Spröda och spruckna packningar, in Livsmedelsteknik. 1989. p. 36-39. 19. Bènézech, T., Faille, C., Nolf, J.S. & Bellon, M.N. Cleaning of strongly adherent Bacillus spores on stainless steel and polymer surfaces of closed food equipment. in World Congress of Food Hygiene. 1997. Haag: Wageningen Pers, Wageningen. 20. Carpentier, B. & Cerf, O. 1993. Biofilms and their consequences, with particular reference to the hygiene in the food industry. Journal of Applied Bacteriology 75: 499-511. 21. Ganesh Kumar, G. & Anand, S.K. 1998. Significance of biofilms in food industry: a review. International Journal of Food Microbiology 42: 9-27. 22. Shin-Ho-Lee & Frank, J. 1991. Inactivation of surface-adherent Listeria monocytogenes. Hypochlorite and heat. Journal of Food Protection 54(1): 4-6. 23. Wirtanen, G., Husmark, U. & Matttila-Sandholm, T. 1996. Microbial evaluation of the biotranser potential from surfaces with Bacillus biofilms after rinsing and cleaning procedures in closed food-processing systems. Journal of Food Protection 59(7): 727-733. 24. Te Giffel, M.C., Beumer, R.R., Langeveld, L. & Rombouts, F.M. 1997. The role of heat exchangers in the contamination of milk with Bacillus cereus in dairy processing plants. International Journal of Dairy Technology 50(2): 43-47. 25. Austin, J.W. & Bergeron, G. 1995. Development of bacterial biofilms in dairy processing lines. Journal of Dairy Research 62: 509-519. 26. Mettler, E. & Carpentier, B. 1997. Location, enumeration and identification of the microbial contamination after cleaning of EPDM gaskets introduced into a milk pasteurization line. Lait 77: 489-503. 23

24 APPENDIX 1. MERA DETALJERADE MATERIAL OCH METODER TILLVERKNING AV SPORER Dag 1, Ansättning En koloni från platta sattes till TY-buljong (Tryptone Yeast buljong). Bakterielösningen inkuberades över natt i 30 C. Dag 2, Ympning 1-2 ml av TY-buljongen spreds jämnt över sporplattorna. Som sporuleringsmedium användes recept enligt Sten Ståhl (Mikrobiologi, Universitet i Lund): (Nutrient Broth, Difco; 8 g; KCl, 1 g; 1M CaCl 2 *H 2 0, 1 ml; 0,01M MnCl 2 *4H 2 0, 1 ml; 1M MgSO 4.*7H 2 0, 1 ml; 0,01 M FeSO 4.*7H 2 0, 0,1 ml; Bacto-Agar, Difco, 30 g; dest. H 2 0 till l.000 ml). Sporuleringsplattorna lades i plastpåsar för att minska uttorkningen och inkuberades i 30 C. Dag X, Kontroll för skörd Plattorna undersöktes med jämna mellanrum för att bestämma bästa tidpunkten för skörd. Den bästa dagen för skörd varierade något mellan olika sporbatcher. Ofta var ca 6 dagar lagom. Skörd 4 ml NaCl (0.9%) tillfördes varje platta. Med en engångsrackla av avskrapades så mycket som möjligt av sporerna. Sporsuspensionen slogs över i en kyld glaskolv. Plattorna sköljdes ytterligare en gång med 4 ml NaCl och lösningen samlades upp i glaskolven. Tvätt Sporsuspensionen hälldes upp i centrifugflaskor och centrifugerades ned i kylcentrifug. Suspensionen tvättades 3 ggr i NaCl-lösning. Vid sista centrifugeringen slammades sporerna upp i 15 ml NaCl-lösning per centrifugflaska. Avdödning Den tvättade sporsuspensionen fördelades på små rör med 1-2 ml/rör. Kvarvarande vegetativa celler avdödades vid 72 C under 5 min. Infrysning Sporerna frystes in och lagrades vid -20 C. Koncentrationsbestämning Koncentrationen av sporer bestämdes med spridning på TGE (Trypton Glukos Extrakt agar). CFU-bestämning har sedan kontinuerligt gjorts för varje nytt rör, som tagits upp för D- värdesbestämningar.