Slutrapport angående projektet Järn, en stödfaktor för effektivare bekämpning med Binab i slutna odlingssystem med (projektnr 586/11/FoG Projekt ansvarig: Sammar Khalil Institution för Biosystem och Teknologi, SLU, Box 13, 23 53 Alnarp, E-mail: sammar.khalil@slu.se 1
Projektets syfte och mål Projektets övergripande mål är att skapa förutsättningar för en uthållig och miljövänlig bekämpningsstrategi av rotsjukdomar i slutna odlingssystem. Biologiska växtskyddsmedel fyller i detta sammanhang en viktig funktion. Men tillsats av dessa medel har inte alltid en avsedd effekt. Behovet av stödfaktorer för att effektivisera bekämpningseffekt är därför en angelägenhet. Näringslösningen och rätt hantering av näringsämnen är i detta sammanhang en viktig faktor för att stödja bio-bekämpningen. Inom ramen för den forskningen har näringslösningsledningstal och mikronäringsämnet, zink, visat sig vara lovande verktyg. I undersökningar utförda vid Område Hortikultur, SLU, Alnarp har samspelet mellan dessa verktyg och det kommersiella växtskyddsmedlet BinabT visat en positiv effekt mot bekämpning av rotpatogenen Pythium ultimum. Tomat användes som modellväxt. Detta är ett viktigt steg på vägen mot säkrare slutna odlingssystem. Projektet avser att undersöka möjligheten att använda andra mikronäringsämne och specifikt järn som stödfaktor för Binab T för att främja biologisk bekämpning av rotpatogener tillhörande svampsläkten Pythium och Fusarium. Dessa patogener är aktuella problem i tomatodlingar. Frågeställningar i projektet är: 1- Kan järn användas tillsammans med Binab för bekämpning av rotpatogener tillhörande svampgruppen Pythium och Fusarium? 2- Vilken effekt har denna strategi på plantans tillväxt, näringsinnehåll samt på sjukdomsangrepp? Slutsatser De uppnådda resultaten visar på att - Järn, vid låg koncentration på.1m, kan användas som stödfaktor för biologiska växtskyddsmedlet, Binab T, för bekämpning av rotpatogenen Pythium ultimum - Vid koncentrationer på.1m och.2m har samspelet mellan järn och Binab T en positiv effekt på bekämpning av rotpatogenen Fusarium oxysporum - De uppnådda Resultaten visar på att järn koncentration på.1 M i närvaro av Pythium ultimum kan främja Trichoderma (aktiva isolat i Binab T) populationen i odlingssystemet. - Järn koncentration på.1 M och.2m och i närvaro av Fusarium oxysporum kan främja Trichoderma (aktiva isolat i Binab T) populationen i odlingssystemet. - Den antagonistiska potentialen hos Binab T med fokus på enzymaktiviteter visar att aktiviteter av cellulaser och glukonaser ökar vid tillsats av Binab T i och utan närvaro av rotpatogenen Pythium ultimum jämfört med kontrollen och vid järn koncentration på.1m men ej vid.2m. De högsta aktiviteterna indikeras i behandling med Binab i närvaro av patogenen. - Den antagonistiska potentialen hos Binab T med fokus på enzymaktiviteter visar att aktiviteter av kitinaser ökar vid tillsats av Binab T i och utan närvaro av rotpatogenen Fusarium oxysporum jämfört med kontrollen och vid järn koncentration på.1m och.2m - Tillsats av BinabT i samspel av järn koncentration visar en positiv effekt på plant tillväxt, och biomassa - Den naturliga mikrofloran i odlingssystemet påverkas av patogen tillsatts, tillsats av Binab T samt av järn koncentration. Resultatförmedling och publikationer Information om projektet presenterades på ett seminarium för Område Hortikultur. Resultaten från projektet presenterades i 1- Nationella publikationer 2
- Khalil S. 211. Järn tillsammans med Binab, ett effektivt bekämpningsverktyg mot Fusarium men ej mot Pythium svampar i slutna odlingssystem. Inskickad till Viola, en affärstidning för trädgårdsföretagare 2- Internationella Publikationer - Khalil S. 213. The effect of iron on the activity of commercial biocontrol product,binab T, against the root pathogens Pythium ultimum and Fusarium oxysporum in closed soilless system Manuskript, inskickas snart till Canadian Journal of Crop Protection Resultaten kommer också att presenteras i ett faktablad inom ramen för LTJ-fakultetens publikationer. Bakgrund Odling av bla grönsaker i slutna odlingssystem utgör ett miljövänligt alternativ för att minska utsläpp av näringsberikat vatten från växthus och därmed minska övergödning av vattendrag, sjöar och kustnära områden. Emellertid ökar recirkulering av näringslösning risken för spridning av rotpatogener (Stanghellini & Rasmussen 1994). Svamparter inom släkten Pythium, Phytophthora och Fusarium bedöms oftast vara dominerande patogener i slutna odlingssystem (Vanachter et al. 1983) och sprider sig med hjälp av zoosporer för släkten Pythium och Phytophthora och konidier för Fusarium släktet. Deras sjukdomsangrepp varierar från bruna rotspetsar till mörkfärgade ruttet rotsystem. Eftersom alla dessa svampgrupper också orsakar likartade symptom är det besvärligt att skilja dem åt i systemen. Komplex av två eller flera av dem är också vanliga och skadorna kan då under vissa betingelser bli omfattande. Bekämpning av rotpatogener är dock en grundliggande och viktig förutsättning för en säkrare användning av slutna odlingssystem. De befintliga slutna odlingssystemen för gurka och tomat använder sig av olika tekniker för rening av näringslösning detta för att minska smittspridning med det cirkulerande bevattningsvattnet. Reningsåtgärderna finns närmare beskrivna av Alsanius & Brand (2), Ehret et al. (21) och Hansson (23). Inom ramen för demonstrationsprojektet (SLF finansierat projekt) har det visat sig att avsmittningen av näringslösningen inte är komplett vad gäller alstrare av rotsjukdomar som är relevanta i slutna odlingssystem (Alsanius & Bergstrand 27; Alsanius et al. 26). Rening av näringslösning förhindrar heller inte smittspridning mellan växter som står i kontakt med varandra genom rotsystemet. Biologisk bekämpning är därför ett mycket viktigt komplement. En stor insats har utförts för bekämpning av rotsjukdomar med hjälp av biologiska åtgärder (Paulitz 1997). Men variation i verkningsmekanismen hos dessa medel är ett problem som måste lösas. Att ta fram faktorer som kan stödja och främjar verkningsmekanismen hos bekämpningsmedel är ett alternativ. För biologisk bekämpning spelar de yttre förutsättningarna en viktig roll. Vid Område Hortikultur, SLU, Alnarp pågår forskning kring bekämpning av rotpatogener i slutna odlingssystem med hjälp av biologisk bekämpning integrerat med andra odlingsfaktorer. Inom ramen för ett forskningsprojekt, finansierat av Partnerskaps Alnarp och BINAB BIO-INNOVATION AB, har vattenhalt i odlingssubstrat visat sig vara lämplig stödfaktor för Binab T (Khalil & Alsanius 211). Vid sidan av odlingssubstrat är växtnäring en annan faktor vars förhållande sätts vanligtvis enbart i samband med växternas försörjning, tillväxt, utveckling och avkastning. Lika viktigt är den för effekten av bio-bekämpning. I detta sammanhang kan betydelsen av 3
näringslösnings ledningstal och mikronäringsämne nämnas. I våra undersökningar och i ytterligare ett projekt finansierades av Partnerskaps Alnarp och BINAB BIO-INNOVATION AB har näringslösningsledningstal visat sig vara lämplig stödfaktor för Binab T. De uppnådda resultaten har visat att den antagonistiska potentialen hos Binab T i tomat kulturen kan uppnås vid ledningstalsnivå > 2.5 ms cm -1 (Khalil 211a). Forskning kring mikronäringsämnet zink, har visat att ökad zink halt i närvaro av Binab T har en positiv effekt på bekämpning av rot sjukdomar (Khalil 211b). Dessa resultat är baserade på småskaliga försök utförda i klimatkammare (Khalil 211b) liksom storskaliga utförda i växthus (Khalil 211 c). Resultaten är av stor betydelse för säkrare och effektivare användning av Binab T i slutna odlingssystem. Syftet med det förslagna projektet är att undersöka möjligheten att använda ett annat mikronäringsämne och specifikt järn som stödfaktor för Binab T mot rotsjukdomar i slutna odlingssystem. Järn är ytterligare mikronäringsämne som i olika studier ha visat ett positivt samspel med Trichoderma isolat som Binab T består av. Det positiva samspelet har varit genom att Trichoderma isolat underlättar tillgängligheten av järn och därmed dess upptag i växten. Dessutom har studier utförda av Segarra et al. (29) visat att Trichoderma isolat kontrollerar sjukdomar orsakade av Fusarium genom konkurens om järn. Resultat från de planerade undersökningar förväntas förstärka underlag när det gäller applikation av Binab T integrerat med näringsämne och är därmed av mycket stort intresse för att utveckla säkrare och uthållig produktion av växthusgrönsaker där både miljömässiga och företagsekonomiska vinster är att hämta. Genomförande Projektet utfördes under perioden Mars 212- Februari 213. Tomat användes som modellväxt och Pythium ultimum och Fusarium oxysporum f. sp. Radicis som modellpatogen. Undersökningarna utfördes i klimatkammare. Plantorna odlades i sex veckor i pimpsten i ett odlingssystem med droppbevattning. I försöken ingick fyra behandlingar: - Behandling 1: kontroll (utan patogen och utan Binab T), - Behandling 2: med tillsats av bara patogen, - Behandling 3: med tillsats av bara det biologiska bekämpningsmedlet Binab T - Behandling 4: med tillsats av båda patogen och Binab T. Varje behandling omfattade ett eget slutet system med cirkulerade näringslösning och bestod av fyra krukor (Figur 1). Undersökningar utfördes vid två olika koncentrationer av järn,1 M och,2 M. Järn tillsättes i form av FeEDTA. Figur 1. Odlingssystemet som användes i försöken 4
Binab T tillsattes i systemet som 1% suspension. En mängd på 2 ml tillsattes i varje kruka (i behandling 3 och 4) en gång per vecka under odlingsperiod. Rotpatogenen Pythium ultimum tillhör svampgruppen Oomyceter som infekterar plantor med hjälp av zoosporer användes. Produktion av zoosporer utfördes genom odling av svampen på vatten agar i två dagar och sedan i V8 lösning (grönsaksblandning) i ytterligare två dagar. Därefter tvättades mycelet två gångar med näringslösning bestående av.145 g Ca(NO 3 ) 2,.12 g MgSO 4,.99 KH 2 PO 4 och.16 FeCl 3 per liter och en gång med vatten. En mängd på 2 ml av zoosporsuspensionen tillsattes i varje kruka (behandling 2 och 4) en gång per vecka och fyra dagar efter tillsats av biologiska bekämpningsmedel. Fusarium angriper med hjälp av konidier. Konidiesuspension producerades genom odling av svampen på agar plattor (potato dextrose agar) för tio dagar. Därefter skrapades mycelet med 2ml sterilt vatten som sedan tillsättes i varje kruka. Analyser Följande analyser utfördes: * Mikrobiologiska analyser Dessa analyser omfattade förekomsten av de aktiva ämnena i Binab T, rotpatogenerna Pythium ultimum och Fusarium oxysporum samt halten av den naturliga mikrofloran i näringslösningen och på rotytan och bedömdes genom bestämning av levande cellhalt på selektiva medier. * Bedömning av verkningsgraden hos bekämpningsmedlet Binab T Den antagonistiska potentialen hos Binb T bedömdes genom mätning av enzymaktiviteter. I proverna mättes produktion av cellulaser, ß-1,3-glucanaser och kitinaser som mått på verkningsmekanism av BinabT. * Växtpatologiska parametrar Förekomsten av rotskador med skala 1-5; 1= vita fina rötter, 2= mörkfärgade rotspetsar, 3= mörkfärgade enskilda rötter, 4= mörkfärgade rotpartier och 5= totalt missfärgade rotsystem utfördes en gång i vecka under odlingsperiod samt vid skörden, * Odlingsrelaterade parametrar Plantornas tillväxt och utveckling registrerades en gång per vecka. Vid försöksslut registrerades skörden (antal frukt per behandling) och skott- och rotbiomassan (torr- och färskvikt). Resultat och diskussion Effekt på rotpatogenen Bedömning av patogenmängd på rötterna visar på att mängd Pyhtium ultimum i närvaro av Binab T minskades i odlingssystem vid järn koncentration på,1 M men inte vid högre koncentration på,2 M. Däremot visade resultaten på att mängd Fusarium oxysporum f. sp. Radicis på rötterna minskades vi båda koncentrationer (Figur 2). 5
Log CFU/ g torrvikt rötter Log CFU/g torrvikt rötter 6 5 4 3 2 1 Fe1 Pythium ultimum Binab T+ P. ultimum Fe2 7 6 5 4 3 2 1 Fe1 Fusarium oxysporum Binab T+ F. oxysporum Fe2 Järn koncentration Figur 2. Mängd Patogen (Pythium ultimum och Fusarium oxysporum f. sp. Radicis ) vid två olika järn (Fe) koncentrationer Fe1=,1M och Fe2=,2M i och utan närvaro av det biologiska bekämpningsmedel Binab T Den positiva effekten med interaktion mellan Binab T och järn vid bekämpning av Fusarium svampar kunde också indikeras på rotsystemet. Friskare rotsystem kunde uppnås i närvaro av Binab T utan patogen samt med patogen vid järn koncentration på,1 respektive,2 M (Figur 3a). Däremot skadade rötter kunde indikeras i behandling med Binab och Pythium ultimum vid järn koncentration på,2m (Figur 3b). 6
(a) (b) Figur 3. Rotsystemet hos tomatplantor (a) odlade i närvaro av Binab T med och utan närvaro av rotpatogenen Fusarium oxysporum och vid järn koncentration på, 1respektive,2 M (b) odlade i närvaro av Binab T och rotpatogenen Pythium ultimum och vid järn koncentration på,2 M Effekt på Binab T De uppnådda resultaten visade också en ökning i mängd Binab T vid järn koncentration på,1m i närvaro av Pythium ultimum och vid järn koncentration på,1 respektive,2m i närvaro av rotpatogen Fusarium oxysporum (Figur 4). Detta indikerar en ökning i Trichoderma populationen vid låg järn koncentration i närvaro av P. ultimum och vid låg och hög järn koncentration i närvaro av F. oxysporum. 7
Log CFU/ g torrvikt rötter Log CFU / g torrvikt rötter 6 Binab Binab T+ P. ultimum 5 4 3 2 1 Fe1 Fe2 Järn koncentration Binab Binab T+ F. oxysporum 6,25 6,2 6,15 6,1 6,5 6 5,95 5,9 5,85 5,8 5,75 Fe1 Järn koncentration Fe2 Figur 4. Förekomst (log CFU/g torrvikt rot) av Trichoderma isolat i Binab T på tomatrötter vid järn koncentration på Fe1=,1M eller Fe2=,2M med och utan tillsats av rotpatogenen, Pythium ultimum eller Fusarium oxysporum. Effekt på verkningsmekanismen hos Binab T Den antagonistiska potentialen hos Binab T undersöktes också med fokus på enzymaktiviteter. Produktion av enzymer cellulaser, kitinaser och glukonaser mättes vid de olika järnkoncentrationerna. Glukan liksom cellulosa är cellväggs komponenter som förekommer hos de flesta svampar med bland annat Oomyceter där Pythium svampar tillhör. 8
Extiction (mu) Svampar tillhörande svamp släktet Fusarium innehåller däremot kitin i deras cellvägg. Kitinaser är de enzymer som är aktiva vid bekämpning av Fusarium. Högre Aktiviteter av dessa enzymer i de behandlingarna med BinabT i närvaro av patogener indikerar produktion av dessa enzymer av Binab T för att spjälka patogenens cellvägg. Aktiviteter av cellulaser och glukonaser ökade vid tillsats av Binab T i och utan närvaro av rotpatogenen Pythium ultimum jämfört med kontrollen vid järn koncentration på.1m (Figur 5). De högsta aktiviteter indikerades i behandling med Binab i närvaro av patogenen. De lägsta aktiviteter indikerades i behandling med enbart patogen. Ingen effekt kunde indikeras vid hög järn koncentration på.2m. 8 7 6 5 4 3 2 1 CFe1 CFe2 GFe1 GFe2 Järn koncentration Kontroll P ultimum Binab T Binab T + P ultimum Figur 5. Aktiviteter av cellulaser (C) och glukanser (G) i kontroll behandling, efter tillsatts av enbart patogenen eller av biologiska bekämpningsmedel Binab T i och utan närvaro av rotpatogenen Pythium ultimum vid järn koncentration på Fe1=.1M och Fe2=.2M Dessutom indikerar resultaten ökade aktiviteter av kitinaser i behandling med Binab T och patogen jämfört med kontrollen vid båda järn koncentrationer (Figur 6). 9
Extension (mu) 3 2,5 2 Kontroll Fusarium oxysporum Binab T Binab T + Fusarium oxysporum 1,5 1,5 KFe1 Järn koncentration KFe2 Figur 6. Aktiviteter av kitinaser (K) i kontroll behandling, efter tillsatts av enbart patogenen eller av biologiska bekämpningsmedel Binab T i och utan närvaro av rotpatogenen Fusarium oxysporum vid järn koncentration Fe1=.1M och Fe2=.2M Effekt på planttillväxt De utförda undersökningarna visade att tillväxten i form av plant biomassa (färsk och torrvikt på rot, skott och blad) ökade i närvaro av Binab T och rotpatogenen Fusarium oxysporum vid båda järn koncentrationer. Rotmassan av tomat plantor ökade däremot i närvaro av Binab T och P. ultimum vid järn koncentration på.1m men ej vid den högre koncentrationen. Behandling med Binab med eller utan patogen ökar rot- och skottvikten i jämförelse med kontroll behandling (Figure 7 och 8). Däremot minskas denna parameter i närvaro av enbart patogenen. 1
Rot torrvikt (g) Skott+ Blad torrvikt (g) 6 5 Kontroll Patogen Binab T Binab T + patogen a 4 3 2 1 PFe1 PFe2 FFe1 FFe2 6 5 b 4 3 2 1 PFe1 PFe2 FFe1 FFe2 Järn koncentration Figur 7. Effekt av Binab T och rotpatogenen Pythium ultimum (P) eller Fusarium oxysporum (F) på (a) skottoch (b) rotvikt hos tomat odlade i slutet odlingssystem vid järn koncentration Fe1=.1M och Fe2=.2M 11
a b K F B B+F K P B B+P c K P B B+P Figur 8. I jämförelse med kontroll behandling (K), effekt av Binab T (B) och (a) rotpatogenen Fusarium oxysporum (F) på skott tillväxt hos tomat odlade i slutet odlingssystem vid järn koncentration Fe1=.1M eller Fe2=.2M (b) rotpatogenen Pythium ultimum (P) på skott tillväxt hos tomat odlade i slutet odlingssystem vid järn koncentration Fe1=.1M (c) rotpatogenen Pythium ultimum (P) på skott tillväxt hos tomat odlade i slutet odlingssystem vid järn koncentration Fe1=.2M Effekten på den allmänna mikrofloran Förekomsten av den allmänna bakteriefloran i systemet påverkades av järn koncentration, tillsats av växtskyddsmedlet Binab T samt av tillsats av rotpatogener (Figur 9). En minskning av mängd bakteria indikerades i dessa behandlingar jämfört med kontrollen. Halten av dessa bakterier var lägst i behandling med enbart patogenen. Detta indikerar påverkan av järn koncentration samt typ av patogen i systemet på bakterieflora i odlingssystemet. 12
Log CFU / g torrvikt rot 5 4,5 4 Allmäna bakterieflora Kontroll 3,5 3 Patogen 2,5 2 1,5 Binab T 1,5 PFe1 PFe2 FFe1 FFe2 Järn koncentration Binab T + patogen Figur 9. Förekomst (log CFU/g rottorrvikt) av den allmänna bakteriefloran på tomatrötter i och utan närvaro av rotpatogenen, Pythium ultimum (P), Fusarium oxysporum (F) eller biologiska bekämpningsmedel Binab T. Tomatplantorna odlades i slutet odlingssystem vid två olika järn koncentrationer Fe1=.1M och Fe2=.2M Förekomsten av den allmänna svampfloran påverkades också av järn koncentration samt typ av patogen i systemet. En ökning svamp halten i behandlingar med Binab med eller utan patogen kunde indikeras (Figur 1). Största ökning indikerades i behandlingar med Binab T med och utan patogen vid järn koncentration på.1m och när P. ultimum var i systemet. Ingen skillnad i mängd allmänna svampmikrofloran kunde däremot indikeras i de behandlingarna med Binab med eller utan närvaro av patogenen. Allmän svampflora hade lägst mängd in behandling med enbart patogen. Detta indikerar skiftning i svampmängd vid tillsats av Binab T, vid järn koncentration.1m och i närvaro av P. ultimum. 13
Log CFU / g torrvikt rot 6 5 Allmäna svampflora Kontroll 4 Patogen 3 2 Binab T 1 PFe1 PFe2 FFE1 FFe2 Järn koncentration Binab T + patogen Figur 1. Förekomst (log CFU/g rottorrvikt) av den allmäna svampflora på tomatrötter i och utan närvaro av rotpatogenen, Pythium ultimum (P), Fusarium oxysporum (F) eller biologiska bekämpningsmedel Binab T. Tomatplantorna odlades i slutet odlingssystem vid två olika järn koncentrationer Fe1=.1M och Fe2=.2M Framtiden Resultaten från detta projekt visar att järn koncentration i näringslösning kan vara ett lovande verktyg för att uppnå en effektivare bekämpning av rotsjukdomar med hjälp av biologiska bekämpningsmedlet Binab T. För att kunna styrka dessa resultat samt öka möjligheten för tillämpning av denna strategi i yrkesodling långtidsförsök i växthus med Binab och de testade patogener behövs. Dessutom har vi i tidigare undersökningar visat att preparatens effekt varierar mellan olika sjukdomsalstrare. Detta indikeras också i det försöket där samspeltet mellan Binab och järn påverkas av typ av patogen som finns i systemet. Utveckling av denna aspekt med andra patogener respektive andra växtskyddsmedel behövs. Dosering av båda bekämpningsmedel och patogen samt järn koncentration är ytterligare en aspekt som behövs undersöka. Detta är av stor betydelse vid utveckling av hållbara och effektiva bekämpningsstrategier mot rotsjukdomar i slutna odlingssystem. 14
Ekonomisk redovisning angående projektet Järn, en stödfaktor för effektivare bekämpning med Binab i slutna odlingssystem (projektnr 586/11/FoG) Sökta medel Sökta medel Totala sökta Totala använda Kostnader från Partnerskap från Binab medel för projektet medel för projektet Arbetstid Sammar Khalil 12236 12236 12236 Summa löner 12236 12236 12236 Arbetstid Thomas Ricard 972 972 972 Summa arbetstid 972 972 972 Materialkostander Förbrukningsmaterial 48 3 7864 7864 Kemikalier 7264 72 72 Växtmaterial 9 1 19 19 mikrooganismer 25 25 25 summa material 82 11264 19464 19464 Analyser Enzymaktiviteter 75 75 15 2 Mikrobiologiska medier 1 8 9 9 summa analyser 85 155 24 29 Kostnader för hyra hyra av klimat kammare 1164 12936 24 24 summa hyra 1164 12936 24 24 Övriga kostnader Maskinhyra 6 6 6 Summa övriga kostnader 6 6 6 Resekostnader Resor 3 3 3 Summa resekostnader 3 3 3 Totala kostnader 13 1459 2759 289 15
16