PLATELIA CANDIDA Ag 96 TEST: 62798 PLATELIA CANDIDA Ag ÄR EN IMMUNOENZYMATISK MIKROPLATTSANALYS AV SANDWICH-TYP FÖR DETEKTION AV CANDIDA MANNAN-ANTIGEN I SERUM. 1 AVSEDD ANVÄNDNING Platelia Candida Ag är en immunoenzymatisk mikroplattsanalys av sandwich-typ för detektion av Candida mannan-antigen i serumprover. 2 INFORMATION FÖR ANVÄNDNING Platelia Candida Ag (kat.nr 62798) är ett test som, när det används i kombination med Platelia Candida Ab/Ac/Ak (kat.nr 62799), ger möjlighet att ställa en tidig diagnos och förbättrar känsligheten i diagnosen av invasiv candidainfektion som en del av ett totalt diagnostiskt tillvägagångssätt som integrerar klinisk och mykologisk data samt utvärdering av verkliga och iatrogena riskfaktorer. 12 Denna kombination är även en väsentlig del av ett kliniskt system och laboratoriesystem för patientövervakning som underlättar beslut rörande behandling. 3 SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING Candida-infektioner är den vanligaste formen av nosokomiala svampinfektioner. 2 Invasiva former utgör de allvarligaste infektionerna med en dödlighet på mellan 30 och 70 % hos personer med nedsatt immunförsvar. 10 Invasiva Candida-infektioner är svåra att diagnostisera på grund av den dåliga specificiteten i kliniska symtom och odlingarnas låga känslighet, trots de stora framsteg som gjorts inom detta område på senare tid. Diagnosen av invasiv candidainfektion, som leder till att lämplig behandling kan påbörjas, baseras vanligtvis på en kombination av kliniska, mykologiska och riskhänsynstaganden. 7 I detta sammanhang måste diagnosen av systemisk candidainfektion alltid innefatta serologiska samt direkta mykologiska metoder. Det verkar som om detektionen av antigener i serum förbättrar Candida-infektionsdiagnosen, i synnerhet hos personer med nedsatt immunförsvar. Mannan, en av flera Candida-antigener, är en polysackarid icke kovalent bunden till väggen med jästsvampar och utgör mer än 7 % av C. albicans torra vikt. 3 Denna antigen verkar vara en av huvudmarkörerna för invasiv candidainfektion. 6 4 TESTPRINCIP Platelia Candida Ag är en immunoenzymatisk mikroplattsanalys av sandwich-typ i ett steg som används för kvantitativ eller kvalitativ detektion av mannan-antigen i humant serum. Analysen använder monoklonal (råtta) antikropp EBCA-1, riktad mot Candida α 1-5 oligomannosider och har beskrivits i tidigare studier. 1,5,11 Monoklonal antikropp används för att: belägga mikroplattans brunnar och binda mannan-antigenen. detektera antigenen som är bunden till den sensibiliserade mikroplattan (konjugatreagens: peroxidas-relaterad monoklonal antikropp). Serumprover värms upp tillsammans med EDTA för att dissociera immunkomplexen och utfälla serumproteiner som kan störa testet. De behandlade serumproverna och konjugatet tillsätts i brunnarna som är belagda med monoklonal antikropp och inkuberas. Ett mab-mannan-mab/peroxidas-komplex bildas om mannan-antigen finns. Remsorna tvättas för att avlägsna allt obundet material. Sedan tillsätts substratlösningen som reagerar med komplexen i brunnen och reaktionen blir blå. Den enzymatiska reaktionen stoppas när syra tillsätts och färgen går från blå till gul. Provernas, kontrollernas och intervallpunkternas absorbans (optisk densitet) fastställs med en spektrofotometer som är inställd på våglängden 450 och 620 nm. Testet kan utföras i två lägen: Kvantitativt läge: genom att fastställa en kalibreringskurva med hjälp av 4 intervallpunkter: 2,0, 1,0, 0,5 och 0,25 ng/ml. Provresultat uttrycks i ng mannan per ml serum. 1
Kvalitativt läge: bara intervallpunkterna 0,25 ng/ml och 0,5 ng/ml används; en jämförelse mellan OD av proverna och OD av de 2 intervallpunkterna används för att tolka resultaten som negativa, medelhöga eller positiva serumprover. 5 REAGENSER Platelia Candida Ag: artikelnr 62798 (96 test) Förvara kitet i +2-8 C. Låt alla reagenser uppnå rumstemperatur (+18-25 C) före användning. Förvara reagenserna vid +2-8 C igen direkt efter användningen. Lägg tillbaka alla oanvända remsor/plattor i påsen och förslut den. Ta inte bort torkmedlet. Remsor ska användas inom 5 veckor från det att påsen har öppnats. Efter spädning kan arbetstvättlösningen förvaras i 14 dagar vid +2-8 C. Alla andra reagenser är stabila fram till utgångsdatum efter att de öppnats. Reagenserna räcker till 96 test i högst 6 satser. Komponent Innehåll Mängd R1 Mikrobrunnsremsplatta R2 Koncentrerad tvättlösning (10X) R3 Negativt kontrollserum R4 Kalibratorserum R5 Positivt kontrollserum R6 Konjugat (färdig använda) att - 96 brunnar (12 remsor med 8 brunnar var) belagda med EBCA-1 anti-mannan monoklonal antikropp - Tris-NaCl-buffert (ph 7,4) - 1 % Tween 20 - Konserveringsmedel: 0,01 % thimerosal - Humant kontrollserum negativt för mannan, används för negativ kontroll och spädningsvätska för standardserumet vid beredning av intervallpunkterna 1,0, 0,5 och 0,25 ng/ml i det kvantitativa testet och för beredning av kalibratorserumet i det kvalitativa testet (se "10. Metod") - Negativt för anti-hiv1, anti-hiv2, anti-hcv-antikroppar och HBs-antigen - Konserveringsmedel: < 0,1 % natriumazid - Humant serum som innehåller 2,0 ng/ml mannan, används för beredning av intervallpunkterna 1,0, 0,5 och 0,25 ng/ml i det kvantitativa testet och för beredning av kalibratorserumet i det kvalitativa testet (se "10. Metod") - Negativt för anti-hiv1, anti-hiv2, anti-hcv-antikroppar och HBs-antigen - Konserveringsmedel: < 0,1 % natriumazid - Humant serum som innehåller 0,5-1,5 ng mannan - Negativt för anti-hiv1, anti-hiv2, anti-hcv-antikroppar och HBs-antigen - Konserveringsmedel: < 0,1 % natriumazid - Anti-mannan monoklonal antikropp/peroxidasmärkt - Konserveringsmedel: 0,01 % thimerosal 1 platta/ 12 x 8 brunnar 1 x 100 ml 1 x 10 ml 2 x 2 ml 1 x 2 ml 1 x 8 ml R7 Serumbehandlingslösning (färdig att använda) R8 TMBsubstratbuffert (färdig att använda) R9 Kromogen: TMBlösning (koncentrat) -EDTA-syralösning, utan konserveringsmedel - Citronsyra- och natriumacetatlösning ph 5,2-0,009 % väteperoxid - 4 % dimetylsulfoxid (DMSO) - 90 % dimetylsulfoxidlösning (DMSO) innehållande 0,6 % tetrametylbensidin (TMB)* 1 x 10,5 ml 1 x 60 ml 1 x 1 ml 2
R10 Stopp- - 1,5 N svavelsyra (H2SO4) 1 x 12 ml lösning (färdig att använda) Plattförslutare - Självhäftande folie för mikroplattor 1 x 4 folier *OBS! TMB (tetrametylbensidin) är en icke cancerframkallande och icke mutagen kromogen för peroxidas. 6 VARNINGAR VID ANVÄNDNING 1. För in vitro-diagnostisk användning. 2. Endast för professionellt bruk. 3. Vi rekommenderar inte att detta testkit används för andra prover än humant serum. 4. Det humana materialet som använts vid beredningen av reagenserna har testats och befunnits vara negativt för anti-hiv-1, anti-hiv-2 och anti-hcv-antikroppar samt HBs-antigen. Eftersom ingen testmetod med säkerhet kan garantera att inga smittsamma ämnen finns, ska alla reagenser och alla patientprover hanteras som potentiellt smittsamma. Alla tester ska utföras med de försiktighetsåtgärder som rekommenderas för blodburna patogener. 5. Använd skyddskläder och engångshandskar när du hanterar reagenser och patientprover. Tvätta händerna noggrant efter ett test. 6. Pipettera inte med munnen. 7. Rök, drick och ät inte i områden där prover eller reagenser hanteras. 8. Undvik stänk från prover och lösningar som innehåller prover. 9. Biologiskt spill som inte innehåller syra ska torkas upp noggrant med ett effektivt desinfektionsmedel. Desinfektionsmedel som kan användas är (men är inte begränsade till) en lösning av 10 % blekmedel (0,5 % lösning natriumhypoklorit), 70 % etanol eller 0,5 % Wescodyne. Spill som innehåller syra ska torkas torrt eller neutraliseras med natriumbikarbonat och sedan rengöras med ett kemiskt desinfektionsmedel. Material som används för att torka upp spill ska hanteras som smittfarligt avfall. VARNING! Placera inte lösningar som innehåller blekmedel i autoklaven. 10. Kassera alla prover och allt material som använts i testet som potentiellt smittsamma. Följ alla gällande regler för avfallshantering. 11. Vissa reagenser innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Natriumazid kan bilda blyeller kopparazider i laboratoriets avloppsledningar. Sådana azider är explosiva. För att undvika att azider samlas ska du spola riktligt med vatten när lösningar som innehåller azid hälls ut i avloppet efter att de inaktiverats. 12. VARNING! Svavelsyra (H 2 SO 4 ) 1,5 N och DMSO (dimetylsulfoxid) 90 % R36/38: Irriterar ögonen och huden. S:2-26-30: Förvaras oåtkomligt för barn. Vid kontakt med ögonen, spola genast med mycket vatten och kontakta läkare. Häll aldrig vatten på eller i produkten. 13. Undvik kontakt med TMB-substratbuffert, kromogen: TMB-lösning och stopplösning i ögonen, huden och slemhinnor (risk för förgiftning, irritation och brännskador). 14. Ett informationsblad om materialets säkerhet kan fås på begäran. 7 FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER VID ANVÄNDNING 1. FRYSTA SERUMPROVER SOM FÖRVARAS UNDER OKÄNDA FÖRHÅLLANDEN KAN GE FELAKTIGT POSITIVA RESULTAT PÅ GRUND AV ATT DE SMITTATS MED SVAMP OCH/ELLER BAKTERIER. 2. Använd inte testet eller reagenserna efter sista förbrukningsdatum. 3. Förutom koncentrerad tvättlösning (R2) och stopplösning (R10) får inte reagenser från testkit med olika batchnummer blandas. 4. Se till att alla reagenser har rumstemperatur i minst 15 minuter före användning. 5. Blanda noggrant när du rekonstituerar reagenser, undvik mikrobiell kontaminering. 6. Utför inte testet om det finns reaktiva ångor (syror, alkalier, aldehyder) eller damm som skulle kunna påverka konjugatets enzymatiska aktivitet. 3
7. Använd rena engångsbehållare av polypropylenplast för att bereda reaktionslösningen med substrat-kromogen. Om glas måste användas ska det först diskas med 1N saltsyra, sköljas med destillerat vatten och sedan torkas. 8. Använd separata pipettspetsar vid manuell pipettering av kontroller och patientprover för att undvika överföring mellan prover (carryover). 9. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda för att brunnarna ska vara tvättade på rätt sätt. Tvätta inte manuellt med en klämflaska. 10. Se till att mikroplattan inte hinner torka efter tvättproceduren innan reagenser har hällts i. 11. Använd inte samma behållare för konjugat- och substratlösningarna. 12. Se till att inte konjugat- eller substratlösning kommer i kontakt med metall eller metalljoner. 13. Undvik att utsätta kromogen: TMB-lösning eller substratkromogenreaktionslösning för starkt ljus vid förvaring och inkubation. Låt inte kromogenlösningarna komma i kontakt med oxiderande medel. 14. Undvik all kontakt mellan stopplösningen och oxiderande medel. Se till att inte stopplösning kommer i kontakt med metall eller metalljoner. 15. Undvik i så hög grad som möjligt att utsätta lösningarna (serum, serumbehandlingslösning, konjugat) eller öppna behållare (plattor, rör, pipetter) för luft. 16. Häll inte tillbaka oanvänt konjugat i originalbehållaren. 17. Substrat-kromogenlösningen måste vara färglös. Om lösningen blir blå när den späds betyder det att reagensen är förorenad och ska inte användas. Kassera och bered ny reagens. 8 BEREDNING OCH FÖRVARING AV REAGENS Mikrobrunnsremsplatta (R1) När påsen har öppnats är mikrobrunnsremsorna hållbara i 5 veckor vid förvaring i +2-8 C i den tätt förslutna originalpåsen när den innehåller torkmedel. Tvättlösning (R2) Bered så mycket arbetstvättlösning som behövs genom att tillsätta en del koncentrerad tvättlösning till 9 delar sterilt avjoniserat eller destillerat vatten. Bered tillräcklig mängd tvättlösning för en omgång (80 ml för en remsa: 8 ml R2 + 72 ml destillerat vatten). Arbetstvättlösningen kan förvaras i 14 dagar vid +2-8 C. När den koncentrerade tvättlösningen har öppnats och förvaras vid +2-25 C är den stabil till det sista förbrukningsdatumet på etiketten, om den inte kontamineras. Substrat-/kromogenreaktionslösning (R8+R9) Bered substrat-/kromogenreaktionslösningen genom att tillsätta en del koncentrerad kromogen: TMBlösning, R9, till 50 delar TMB-substratbuffert, R8. Bered 2 ml substrat-/kromogenreaktionslösning per remsa: 40 µl R9 + 2 ml R8. Lösningen är stabil i 6 timmar om den förvaras mörkt i rumstemperatur (+18-25 C). När R8- och R9- reagenserna har öppnats är de stabila till sista förbrukningsdatum på etiketten, om de förvaras i +2-8 C utan att kontamineras. Negativt kontrollserum (R3), kalibratorserum (R4), positivt kontrollserum (R5), konjugat (R6), serumbehandlingslösning (R7) och stopplösning (R10) När reagenserna R3, R4, R5, R6, R7 och R10 har öppnats är de stabila till sista förbrukningsdatum på etiketten, om de förvaras i +2-8 C utan att kontamineras. 9 PROVTAGNING Ta blodprov enligt sedvanligt förfarande. Testet görs med serum. Serumprover får inte vara kontaminerade med svampsporer och/eller bakterier. Transportera och förvara proverna i förslutna rör så att de inte utsätts för luft. Proverna kan förvaras vid +2-8 C i 24 timmar innan de testas. Förvara serumet vid -70 C om det måste förvaras längre. Serumprover kan frysas/tinas högst 3 gånger. Prover som har varit frysta ska blandas ordentligt efter upptining innan testet utförs. Resultaten påverkas inte av prover som innehåller 90 g/l albumin, 200 mg/l bilirubin, lipemiska prover som innehåller motsvarande 360 g/l triolein (triglycerid) eller hemolyserade prover som innehåller 200 g/l hemoglobin. 4
Späd inte serumproverna. 10 METOD Material som ingår Se avsnittet REAGENSER. Nödvändigt men ej bifogat material 1. Sterilt destillerat eller avjoniserat vatten för spädning av koncentrerad tvättlösning. 2. Absorberande papper. 3. Engångshandskar. 4. Skyddsglasögon. 5. Natriumhypoklorit (blekmedel) och natriumbikarbonat. 6. Justerbara eller fasta pipetter och multipipetter för mätning och fördelning av 50 µl, 100 µl, 300 µl och 1 000 µl. 7. 1,5 ml polypropylen-mikrocentrifugrör med lufttäta lock som tål värme upp till 120 C (värmeblock) eller 100 C (kokande vattenbad): Rör med skruvlock: 1,5 ml koniska rör, Bio-Rad kat.nr 224-0010 eller motsvarande. ELLER Rör med snäpplock: EZ-mikroprovrör, 1,5 ml, Bio-Rad kat.nr 223-9480 eller motsvarande. Lockspärrar till mikrorör: VWR kat.nr 6054001 eller motsvarande. Dessa spärrar försluter rör med snäpplock säkert så att locken inte öppnas vid temperatur- och tryckändringar. De gör också att rören enkelt kan lyftas ur värmeblock eller kokande vattenbad. 8. Laboratoriebänkcentrifug för 1,5 ml polypropylenrör som kan innehålla upp till 10 000 g. 9. Om värmeblock används för att behandla serumprover: Värmeblock. Följande värmeblocksmodeller rekommenderas: - Blockmodell 1: Grant kat.nr QBD1 (VWR kat.nr 460-0074) - Blockmodell 2: Grant kat.nr QBD2 (VWR kat.nr 460-0076) Block för värmeblock. Båda värmeblocken (QBD1 och QBD2) måste användas med Grant-block kat.nr QB-E1 (VWR-kat.nr 460-8517) Om kokande vattenbad används för att behandla serumprover: Runt, flytande mikrocentrifugrack för 1-litersbägare. Kokande vattenbad, 100 C 10. Vortex-blandare. 11. Mikroplattsinkubator vid 37 ± 1 C. 12. Halvautomatisk eller automatisk tvättanordning för mikroplattor. 13. Avläsare för mikroplattor med 450 nm och 620 nm filter. 14. Behållare för smittfarligt avfall. Kommentarer till metoden Negativa, positiva kontroller och intervallpunkter måste testas i varje analysomgång för att validera testresultaten. Förberedelse av invervallpunkter Kvantitativt läge: R3 Negativt kontrollserum För 1 serie För 6 serier (*) R4 R3 2 ng/ml Negativt kalibratorserum kontrollserum R4 2 ng/ml kalibratorserum 2 ng/ml-punkt - 300 µl - 2 000 µl 1 ng/ml-punkt 150 µl 150 µl 1 000 µl 1 000 µl 0,5 ng/ml-punkt 225 µl 75 µl 1 500 µl 500 µl 0,25 ng/ml-punkt 262,5 µl 37,5 µl 1 750 µl 250 µl (*) en reagensvolym motsvarande 6 serier kan beredas i förväg: dela upp i portioner om 300 µl för varje intervallpunkt och förvara vid -20 C. Låt reagenserna uppnå rumstemperatur (18-25 C) före användning. 5
Kvalitativt läge: Förbered intervallpunkterna 0,5 ng/ml (kalibratorserum) och 0,25 ng/ml enligt tabellen ovan. Behandling av serumprover Allt kontrollserum: negativt (R3), positivt (R5) samt intervallpunkterna 2,0, 1,0, 0,5 och 0,25 ng/ml måste analyseras samtidigt med patientproverna: 1. Pipettera 300 µl av varje testserum, kontroll och intervallpunkt i separata 1,5 ml polypropylenrör. 2. Tillsätt 100 µl serumbehandlingslösning (R7) i varje rör. 3. Blanda rören noga genom att röra kraftigt eller i vortexapparat. Förslut röret noga för att förhindra att det öppnas vid värme. Gör inte hål i locket. 4. Värmeblock: Värm rören i 6 minuter i ett värmeblock vid 120 o C. Rören får först placeras i blocket när den angivna temperaturen har nåtts. (*) ELLER Vattenbad: Om kokande vattenbad används: Värm rören i 3 minuter vid 100 o C. Rören får först placeras i vattenbadet när den angivna temperaturen har nåtts. (*) 5. Ta försiktigt ut de heta rören från värmeblocket eller vattenbadet och placera dem i en centrifug. Centrifugera rören vid 10 000 x g i 10 minuter. Supernatanten används för detektion av mannanantigen. 6. Testa supernatanterna med följande metod. När serumet har behandlats måste testet utföras så snart som möjligt. Om analysen av resultaten innebär att ett nytt test måste göras måste en ny alikvot serum behandlas för testning. (*) Det är viktigt att följa den föreskrivna temperaturen och vändningstiden samt att de rekommenderade materialen används för att testet ska lyckas. Förlita dig inte på temperaturen som utrustningen visar, utan kontrollera att temperaturen följer specifikationerna genom att använda en kalibrerad termometer som sätts in i ett rör med mineralolja: 120 C måste uppnås i röret i ett värmeblock och 100 C i ett kokande vattenbad. Observera! - Alla serumprover som behandlas enligt detta förfarande kan användas för att utföra Platelia Aspergillus EIA-testet, eftersom serumbehandlingsmetoderna är identiska för de två testen. - Förvara inte serum (kontroll-, intervallpunkts- och testprov) efter behandling. EIA-metod Följ anvisningarna noga. Tillämpa god laboratoriesed. 1. Se till att alla reagenser har rumstemperatur (18-25 C) i minst 15 minuter före användning. 2. Bered arbetstvättlösningen, substrat-/kromogenreaktionslösningen, negativa och positiva kontroller och intervallpunkter. 3. Förbered ett diagram för identifiering av testserum, kontroller och intervallpunkter i mikroplattan. Kvantitativt läge: Kontrollserum och intervallpunkterna (0,25, 0,50, 1,0 och 2,0 ng/ml) kan placeras enligt följande schema: - A1: Negativt kontrollserum (R3) - B1: 0,25 ng/ml-intervallpunkt - C1: 0,50 ng/ml-intervallpunkt - D1: 1,0 ng/ml-intervallpunkt - E1: 2,0 ng/ml-intervallpunkt (R4) - F1: Positivt kontrollserum (R5) - G1: Positivt kontrollserum (R5) Kvalitativt läge: Kontrollserum och intervallpunkterna 0,5 ng/ml och 0,25 ng/ml kan placeras enligt följande schema: - A1: Negativt kontrollserum (R3) - B1: 0,25 ng/ml-intervallpunkt - C1: 0,5 ng/ml-intervallpunkt (kalibratorserum) - D1: 0,5 ng/ml-intervallpunkt (kalibratorserum) - E1: Positivt kontrollserum (R5) 6
4. Ta ut platthållaren och mikrobrunnsremsorna (R1) ur plattpåsen. Lägg tillbaka remsor som inte ska användas i påsen tillsammans med torkmedel, förslut påsen igen. 5. Blanda innehållet i konjugatflaskan (R6) genom att vända den upp och ner före användning. Tillsätt 50 µl konjugat i varje brunn. Tillsätt sedan 50 µl behandlad serumsupernatant i varje brunn enligt anvisningarna ovan. Tillsätt inte serumprover i brunnarna före konjugatet. 6. Täck mikroplattan med folie eller på annat vis så att inget avdunstar. Se till att hela ytan är täckt och vattentät. 7. Inkubera mikroplattan i en torr mikroplattsinkubator i 90 ± 5 minuter vid 37 C (±1 C). 8. Ta bort den självhäftande folien. Aspirera innehållet i alla brunnar i en avfallsbehållare (som innehåller natriumhypoklorit). Tvätta platten 5 gånger, använd minst 370 µl arbetstvättlösning. Efter den sista tvättningen ska mikroplattan vändas upp och ner, slå med lätta slag mot det absorberande papperet för att få bort resterande vätska. 9. Tillsätt snabbt 200 µl substrat-/kromogenreaktionslösning (R8 + R9) i varje brunn, undvik starkt ljus. 10. Inkubera mikroplattan i mörker i rumstemperatur (18-25 C) i 30 ±5 minuter. Använd inte självhäftande folie i detta inkuberingssteg. 11. Tillsätt 100 µi stopplösning (R10) i varje brunn. Använd samma ordningsföljd för fördelning som för substrat-/kromogenreaktionslösningen. Blanda väl. 12. Torka noga av botten på varje platta. 13. Läs av den optiska densiteten i varje brunn vid 450 nm (referensfilter med 620/630 nm). Mikroplattorna måste läsas av inom 30 minuter efter att stopplösning tillsatts. 11 KVALITETSKONTROLL (VALIDERINGSKRITERIER) Kvantitativt läge Använd kontrollserum och intervallpunkter på varje mikroplatta i varje test. Följande kriterier måste uppfyllas för att validera testproceduren: Värde för optisk densitet: 0,300 < OD av intervallpunkten 0,5 ng/ml < 1,100 Kvoter: OD (2,0 ng/ml-intervallpunkt)/od (0,5 ng/ml-intervallpunkt) > 2,1 OD (1,0 ng/ml-intervallpunkt)/od (0,5 ng/ml-intervallpunkt) > 1,25 OD (0,25 ng/ml-intervallpunkt)/od (0,5 ng/ml-intervallpunkt) < 0,85 OD (R3)/OD (0,25 ng/ml-intervallpunkt) 0,80 Mannan-koncentration: R5-koncentration lika med koncentrationen som indikeras på flaskan ± 20 %. Kvalitativt läge Beräkning av gränsvärdet (CO) Addera OD-värdena som beräknats för varje brunn innehållande 0,5 ng/ml-intervallpunkt och dividera med 2. Valideringskriterier 0,300 < CO < 1,100 OD R5 > CO OD R3 < 0,7 CO 0,25 ng/ml-intervallpunkt OD < 0,85 CO 12 UTVÄRDERING AV RESULTATEN Kvantitativt läge Fastställ standardkurvan Standardkurvan ritas med 4 intervallpunkter, 2,0, 1,0, 0,5 och 0,25 ng/ml, beredd från kalibratorserum R4. Positiva (R5) och negativa (R3) kontroller finns inte med i kurvan. För att uppnå maximal precision kan du rita upp en sigmoidkurva med extrapolation genom att rita mannan-koncentrationen i ng/ml på x-axeln (logaritmskala) och den optiska densiteten på y-axeln (linjär skala). 7
Om mikroplattans avläsare inte tillåter denna typ av framställning ritar du en kurva som sammanbinder de olika intervallpunkterna. Bestämning av mannan-koncentrationen i testserum Kalibreringskurvan kan användas för att bestämma koncentrationen av mannan-antigen, uttryckt i ng/ml, för varje testprov. Utvärdering av resultaten Serumprover med en mannan-koncentration som är mindre än 0,25 ng/ml (C < 0,25) betraktas som "negativa" med avseende på förekomst av mannan-antigen. Serumprover med en mannan-koncentration mellan 0,25 och 0,5 ng/ml (0,25 C < 0,5) betraktas som "medelhöga" med avseende på förekomst av mannan-antigen. Serumprover med en mannan-koncentration som är högre än eller lika med 0,5 ng/ml (C 0,5) betraktas som "positiva" med avseende på förekomst av mannan-antigen. Intervallpunkterna som används för att rita kalibreringskurvan medger inte exakt bestämning av koncentrationer som är högre än 2,5 ng/ml. Testet bör göras en gång till när serumet har spätts till 1:5 i negativt serum (R3) för att få en mer exakt bestämning av koncentrationen av starkt positivt serum. OBS! Platelia Candida Ag är avsedd att användas som ett hjälpmedel vid diagnos av invasiv candidainfektion. Positiva resultat som fastställs med Platelia Candida Ag ska beaktas i anslutning till andra diagnosmetoder som mikrobiologisk kultur, histologisk undersökning av biopsiprover och radiografiska bevis. Regelbunden screening av högriskpatienter rekommenderas för att öka testets känslighet och tidiga positiva reaktion. Kvalitativt läge Utvärdering av resultaten Prov-OD < 0,25 ng/ml-intervallpunkt-od: serum anses som "negativt" med avseende på förekomst av mannan-antigen. 0,25 ng/ml-intervallpunkt-od prov-od < CO: serum anses som "medelhögt" med avseende på förekomst av mannan-antigen. Prov-OD CO: serum anses som "positivt" med avseende på förekomst av mannanantigen. OBS! Platelia Candida Ag är avsedd att användas som ett hjälpmedel vid diagnos av invasiv candidainfektion. Positiva resultat som fastställs med Platelia Candida Ag ska beaktas i anslutning till andra diagnosmetoder som mikrobiologisk kultur, histologisk undersökning av biopsiprover och radiografiska bevis. Regelbunden screening av högriskpatienter rekommenderas för att öka testets känslighet och tidiga positiva reaktion. Observera! För att avgöra intensiteten i positiva resultat kan man beräkna ett index (I): I = positivt serum OD/CO Med detta index kan man uttrycka resultat i semikvantitativt läge. 13 TESTETS BEGRÄNSNINGAR 1. Ett negativt test kan inte utesluta diagnosen invasiv candidainfektion på grund av väldigt låg koncentration och det snabba eliminerandet av mannan under infektion. 2. Ett negativt mannan-antigentest måste även utvärderas mot bakgrund av resultaten av antimannan-antikroppstester. Även om invasiv candidainfektion finns är antigenen svårare att upptäcka hos patienter som testats positiva för antimannan-antikroppar (se avsnitt 14. Särskilda prestandaegenskaper). 3. Detektionsprestandan av mannan-antigen i serum beror på hur många test som utförts på patienten. 4 Regelbunden övervakning av högriskpatienter och screening med avseende på antimannan-antikroppar rekommenderas för att öka testets känslighet och tidiga positiva reaktion. 8
4. Proceduren för Platelia Candida Ag och utvärderingen av resultaten måste följas när resultaten analyseras med avseende på förekomst av mannan-antigen. Användaren av detta test rekommenderas att läsa den medföljande instruktionen noga innan testet genomförs. Testanvisningarna måste följas mycket noga, i synnerhet när det gäller pipettering av prover och reagenser, tvättning av plattor och tider vid inkubation. 5. Om anvisningarna inte följs vid tillsättning av prover eller reagenser kan det resultera i ett falskt negativt testresultat. Upprepad testning av ytterligare prover rekommenderas om det finns klinisk misstanke om invasiv candidainfektion eller misstanke om felaktig testning. 6. Kontamination av negativa patientprovbrunnar från brunnar med positiv kontroll/patientprover är möjlig om innehållet i en brunn kommer över till en annan brunn på grund av oförsiktig hantering av mikroplattan eller dålig pipetteringsteknik när reagenser tillsätts. 7. En korsreaktion har observerats hos patienter som fick en infusion med speciella portioner plasmaexpanderare med hydroxyetylstärkelse (till exempel Hesteril 6 %), som används vid behandling av blodcirkulationsproblem: hypovolemi, hemorragisk chock, septisk chock. 14 SÄRSKILDA PRESTANDAEGENSKAPER 14.1 Kvantitativt läge A Reproducerbarhetsstudier Variabilitet inom testet: Fyra serumprover (ett negativt, ett medelhögt vid 0,48 ng/ml och två positiva serumprover med koncentrationer på 0,69 ng/ml respektive 1,39 ng/ml) testades i 30 replikat. Variationskoefficienterna var 3,1 %, 6,9 %, 9,1 % respektive 7,0 %. Variabilitet mellan tester: Åtta negativa och fyra positiva serumprover testades i fem serier under en 5-veckorsperiod. Variationskoefficienterna var < 20 % för koncentrationerna av positivt serum och < 13 % för OD-värdet av negativt serum. B Klinisk testning SPECIFICITET Specificitetsresultaten sammanfattas i följande tabell: Patientkategori Antal patienter (antal serum) Koncentration (ng/ml) C < 0,25 0,25 C < 0,5 C 0,5 Ej inlagd på sjukhus 184 (184) 183 (99,5 %) 1 (0,5 %) Sjukhuspatient, ej drabbad 151 (200) 140 (92,8 %) 7 (4,6 %) 4 (2,6 %) av: - Crohns sjukdom 52 (52) 49 (98,1 %) 3 (1,9 %) - Ulcerös kolit 43 (43) 41 (95,4 %) 1 (2,3 %) 1 (2,3 %) - Aspergillos 26 (35) 23 (88,5 %) 1 (3,8 %) 2 (7,7 %) - Pneumocystos 4 (4) 4 (100 %) - Kryptokockos 13 (13) 12 (92,3 %) 1 (7,7 %) Sjukhuspatient drabbad av 41 (160) 35 (85,3 %) 4 (9,8 %) 2 (4,9 %) Candida: KÄNSLIGHET Klinisk testning för utvärdering av känsligheten för Platelia Candida Ag utfördes vid tre universitetssjukhus i Frankrike. Studien utfördes retrospektivt med totalt 366 serumprover från 106 patienter på olika sjukhusavdelningar: kirurgiska avdelningen, hematologiska avdelningen, intensivvården, brännskadeavdelningen... Candida-jäst isolerades från blodkulturer eller djupa prov från dessa patienter. 8,9 I denna patientpopulation var den genomsnittliga känsligheten för Platelia Candida Ag 51,5 % (förutom serum med en mannan-koncentration mellan 0,25 och 0,5 ng/ml som betraktas som "medelhög" med avseende på förekomst av mannan-antigen: 6,6 % av patienterna). 9
Beroende på den isolerade Candida-arten varierar känsligheten enligt tabellen nedan: Isolerade Candida-arter Antal patienter (antal serum) C 0,5 Känslighet C 0,5 och 0,25 C < 0,5 C. tropicalis 10 (72) 70,0 % 70,0 % C. glabrata 12 (31) 58,3 % 58,3 % C. albicans 64 (208) 52,5 % 60,3 % C. kefyr 2 (5) 50,0 % 50,0 % C. parapsilosis 10 (29) 37,5 % 57,5 % C. krusei 8 (21) 20,0 % 20,0 % Känsligheten beror på antalet prover och hur ofta de tagits. 13 Dessa kliniska studier visade även på vikten av att kombinera detektion av mannan-antigen med Platelia Candida Ag och detektion av antimannan-antikroppar med Platelia Candida Ab/Ac/Ak. Patienterna kan delas in i två tydligt olika populationer (Chi-kvadratstest, p < 0,0005), vilket tydligt framgår av resultaten i följande tabell: Patienter som är negativa med avseende på antimannan-antikroppar: känslighet för Platelia Candida Ag är 78,8 % vid C. albicans-infektioner och 66,6 % vid kombinerade Candida-arter. Patienter som är positiva med avseende på antimannan-antikroppar: antigen-mannan är svårare att upptäcka. Infektionsarter (antal patienter) Kombination av Candida-arter (106) C. albicans (64) Känslighet Platelia Candida Ag Antimannan Abnegativa patienter Antimannan Ab-positiva patienter Alla patienter 66,6 % 17,5 % 51,5 % 78,8 % 16,1 % 52,5 % Utvärderingen av testning med Platelia Candida Ag måste innehålla information om patientens immunstatus mot Candida-mannan. Den kombinerade serologiska detektionen av mannan-antigen och antimannan-antikroppar visar en känslighet på 84,8 % (förutom 6,6 % av patienterna med medelhög koncentration av mannanantigen). En del patienter uppvisar dock ett positivt svar på de två markörerna vid olika tidpunkter under samma infektionsfas. Infektionsprognosen har ett samband med balansen mellan mannanemi- och antimannan-antikroppssvar. 13 14.2 Kvalitativt läge A Reproducerbarhetsstudier Variabilitet inom testet: Fyra serumprover (ett negativt, ett medelhögt vid index = 0.95 och två positiva serumprover med index = 1,24 respektive 2,00) testades i 30 replikat. Variationskoefficienterna i procent (CV %) var 3,1 %, 7,2 %, 5,9 % och 5,9 %. Variabilitet mellan tester: Tio positiva serumprover och fyra medelhöga serumprover testades på sex serier. Variationskoeffecienterna i procent (CV %) var < 15 % för koncentrationerna av positiva eller medelhöga serumprover. B Klinisk testning SPECIFICITET - KÄNSLIGHET Eftersom koncentrationer 0,5ng/ml eller < 0,25 ng/ml i serum i kvantitativt läge motsvarar positivt och negativt serum i kvalitativt läge, kan man utgå från att prestandaegenskaperna för testet i kvalitativt läge motsvarar dem som beskrivs i avsnittet "Kvantitativt läge". 10
15 TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL Alla reagenser tillverkas och bereds i enlighet med vårt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till den slutliga marknadsföringen av produkten. Varje batch genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med fördefinierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion och kontroll av varje enskild batch sparas hos Bio-Rad. 16 REFERENSER 1. FAILLE, C., D. W. MACKENZIE, J. C. MICHALSKI, and D. POULAIN. 1992. Evaluation of an enzyme immunoassay using neoglycolipids constructed from Candida albicans oligomannosides to define the specificity of anti- mannan antibodies. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11: s. 438-46. 2. FRIDKIN, S. K. and W. R. JARVIS. 1996. Epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin. Microbiol. Rev. 9: s. 499-511. 3. FUKAZAWA, Y. 1989. Antigenic structure of Candida albicans. Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts. Immunol. Ser. 47: s. 37-62. 4. HERENT, P., D. STYNEN, F. HERNANDO, J. FRUIT, and D. POULAIN. 1992. Retrospective evaluation of two latex agglutination tests for detection of circulating antigens during invasive candidosis. J. Clin. Microbiol. 30: s. 2158-64. 5. JACQUINOT, P. M., Y. PLANCKE, B. SENDID, G. STRECKER, and D. POULAIN. 1998. Nature of Candida albicans-derived carbohydrate antigen recognized by a monoclonal antibody in patient sera and distribution over Candida species. FEMS Microbiol. Lett. 169: s. 131-8. 6. PONTON, J., M. MORAGUES, and G. QUINDOS. 2002. Non-Culture-Based Diagnostics, s. 395-425. In R. Calderone (ed.), Candida and Candidiasis. ASM Press, Washington, D.C. 7. RUHNKE, M. and G. MASCHMEYER. 2002. Management of mycoses in patients with hematologic disease and cancer - review of the literature. Eur. J. Med. Res. 7: s. 227-235. 8. SENDID, B., J. L. POIROT, M. TABOURET, A. BONNIN, D. CAILLOT, D. CAMUS, and D. POULAIN. 2002. Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: s. 433-442. 9. SENDID, B., M. TABOURET, J. L. POIROT, D. MATHIEU, J. FRUIT, and D. POULAIN. 1999. New enzyme immunoassays for sensitive detection of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies: useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J. Clin. Microbiol. 37: s. 1510-1517. 10. TIRABOSCHI, I. N., J. E. BENNETT, C. A. KAUFFMAN, J. H. REX, C. GIRMENIA, J. D. SOBEL, and F. MENICHETTI. 2000. Deep Candida infections in the neutropenic and nonneutropenic host: an ISHAM symposium. Med. Mycol. 38 Suppl 1: s. 199-204. 11. TRINEL, P. A., C. FAILLE, P. M. JACQUINOT, J. C. CAILLIEZ, and D. POULAIN. 1992. Mapping of Candida albicans oligomannosidic epitopes by using monoclonal antibodies. Infect. Immun. 60: s. 3845-51. 12. VERWEIJ, P. E., D. POULAIN, T. OBAYASHI, T. F. PATTERSON, D. W. DENNING, and J. PONTON. 1998. Current trends in the detection of antigenaemia, metabolites and cell wall markers for the diagnosis and therapeutic monitoring of fungal infections. Med. Mycol. 36 Suppl 1: s. 146-155. 13. YERA, H., B. SENDID, N. FRANCOIS, D. CAMUS, and D. POULAIN. 2001. Contribution of serological tests and blood culture to the early diagnosis of systemic candidiasis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20: s. 864-870. 11
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette Frankrike Tlf.: +33 (0) 1 47 95 60 00 03/2008 Faks: +33 (0) 1 47 41 91 33 880018 12