Kvantifiering av ekosystemeffekter av Bti- användning i Nedre Dalälven

Kvantifiering av ekosystemeffekter av Bti- användning i Nedre Dalälven Brendan G. McKie, Astrid Taylor, Tobias Nilsson, Willem Goedkoop Sveriges Lantbruksuniversitet Institutionen för Vatten och Miljö, SLU (BGM, TN, WG) Institutionen för Ekologi, SLU (AT) 1

Kvantifiering av ekosystemeffekter av Bti- användning i Nedre Dalälven Brendan G. McKie, Astrid Taylor, Tobias Nilsson, Willem Goedkoop Institutionen för Vatten och Miljö, SLU (BGM, TN, WG) Institutionen för Ekologi, SLU (AT) 1) Inledning 1.1) Bakgrund Naturvårdsverket har fått ett uppdrag av regeringen att utvärdera effekterna av bekämpning av översvämningsmyggor med det biologiska bekämpningsmedlet VectoBac G. Utifrån den litteraturstudie som genomförts inom ramen för uppdraget har man dragit följande slutsatser. Bti- baserade insekticider har använts sedan 1980- talet i många länder och på alla kontinenter. Det finns många studier av olika aspekter på Bti, och det har även gjorts en hel del litteratursammanställningar (review- artiklar) i ämnet. Det finns därmed en relativt stor samlad kunskap inom ämnet och många erfarenheter att ta lärdom av. Trots detta finns det vissa kunskapsluckor, framförallt vad gäller ekosystem- nivå- effekter av Bti och myggkontroll. SLU har av Naturvårdsverket fått ett uppdrag att utreda följande centrala frågor närmare: Hur stora är de indirekta effekterna av Bti- behandling på olika nivåer i ett ekosystem? Leder behandling med Bti till lokala eutrofieringseffekter? Här redovisar vi resultaten från vår utredning. Inledningsvis presenterar vi en litteratursamanställning som fokuserar på indirekta ekologiska effekter av masskläckningar av myggor och andra akvatiska insekter, följt av en allmän beskrivning av vårt tillvägagångssätt i fältstudien. Detta följs sedan av detaljerade metodbeskrivningar, resultat och diskussionen, samt avsluts med en sammanfattning av de viktigaste resultaten och implikationer av en långvarig användning av Vectobact. 1.2) Historik och problematik Områden kring nedre Dalälvens lopp visar periodvis stora mängder stickmyggor, främst av arten Aedes sticticus (Schäfer et al. 2008). Tätheterna av dessa myggor kan uppnå sådana nivåer att människors hälsa och dagliga liv påverkas negativt. Boende i och omkring exempelvis Österfärnebo, Gysinge och Tärnsjö upplever stora besvär av då de stora antalen mygg omöjliggör normal utomhusvistelse, tvingar jordbrukare att hålla 2

djuren inomhus för att undvika stress och påverkar turistnäringen negativt (Nilsson och Renöfält 2009). Samtidigt som det finns starka argument för åtgärder mot myggproblematiken ställer höga naturvärden krav på minimal påverkan på ekosystemen i området från sådana åtgärder. Nedre Dalälven är utpekat som ett av landets mest värdefulla naturområden och rymmer Färnebofjärdens nationalpark samt flera naturreservat och Natura 2000- områden (Nilsson och Renöfält 2009). Översvämningsmyggor lägger sina ägg på översvämningsmarker där de kan ligga livskraftiga i flera år. För att äggen sedan ska kläckas krävs en period av torka följt av en översvämning, samt att vattentemperaturen inte understiger 8-10 C (Schäfer och Lundström 2009). Med sina flacka strandängar som lätt påverkas av Dalälvens varierande vattenstånd utgör miljön kring Nedre Dalälven ett utmärkt habitat för dessa myggor. Vid snösmältning och kraftiga regn under vår och sommar riskerar markerna att svämma över med masskläckning av larver som följd. När översvämningsvattnet börja dra sig tillbaka så lever mygglarverna kvar i kvarvarande vattensamlingar (till exampel vattenfyllda depressioner i terrängen). Mot denna bakgrund inrättades ett program för kontroll av myggpopulationerna (www.mygg.se) som administreras av Nedre Dalälvens Utvecklings AB (NEDAB) (Vinnersten et al. 2010; Schäfer och Lundström 2014). Områden som uppvisar höga tätheter av larver behandlas sedan år 2002 med det Bti- baserade biologiska bekämpningsmedlet VectoBac G (R). Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) är en bakterie som vid sporulering bildar en proteinkristall. När denna kristall hamnar i stickmyggornas basiska magtarmkanal omvandlas den till ett toxin som förstör magtarmkanalens celler och är dödlig för mygglarven (Lahkim- Tsror et al. 1983). Produkten VectoBac G består av en pellets av majskolvens vedartade kärna på vilken en torkad kultur av Bti är fäst med hjälp av majsolja. Denna pellets sprids från helikopter och behandlingen måste utföras efter varje översvämning om antalet mygglarver är minst 4 stycken per liter vatten i stora vattensamlingar och minst 50 larver per liter i mindre områden (www.mygg.se). 1.3) Den befintliga uppföljningsprogram: Fokus på direkt effekter År 2005 pågick Bti- baserad myggbekämpning i 25 länder på alla kontinenter och intresset, liksom mängden använt preparat, ökar år från år (Boisvert och Boisvert 2000). Behandling med Bti anses vara ett selektivt och effektivt sätt att minska mängden stickmygg och en korrekt utförd behandling kan reducera antalet mygglarver med nära 100 % i ett område (Persson Vinnersten et al. 2014). På grund av det stora intresset för Bti- behandling har det utförts ett stort antal studier som utvärderar dess effekter på både mål- och icke- måloranismer. Majoriteten av dessa studier har fokuserat på direkta effekter på mål och icke- mål organismen (Boisvert och Boisvert 2000). Hela 37 av de 75 studier (eller närmare 50%) som ingick i Boisverts och Boisverts (2000) sammanställning visade på någon form av effekt på icke- målorganismer, främst 3

fjädermyggor (chironomider). Fjädermygglarver bedöms dock vara mindre känsliga och oftast behövs en betydligt högre dos för att döda fjädermygglarver än vad som normalt används vid bekämpning av stickmygg. Trotts detta fann Boisvert och Boisvert (2000) att man i 11 av de 23 studier som visade negativa effekter på fjädermyggor använde normala doser. Känsligheten mot Bti tycks också variera mellan olika arter av fjädermyggor (Kondo et al. 1995). Lundström et al. (2010) fann inga negativa effekter på produktionen av fjädermyggor under en långtidsstudie i nedre Dalälven. 1.4) Bristfälliga kunskaper om indirekt effekter Det finns betydligt färre studier som behandlar de mer långsiktiga, indirekta effekterna av Bti- behandling. Även om Bti inte skulle ha någon direkt dödlig effekt på icke- målorganismer är det ändå inte osannolikt att Bti skulle kunna orsaka effekter högre upp i näringskedjan genom att förändra flödet av stora mängder material och energi, samt på viktiga ekosystemprocesser. Stickmyggors roll i ekosystemet har studerats förvånansvärt lite och kräver mer uppmärksamhet. Nilsson och Renöfält (2009) nämner att stickmyggan bör spela roll som födokälla, störningsfaktor och sjukdomsspridare, men att den relativa betydelsen av dessa faktorer inte är utredd. En studie på häckande hussvalor i Frankrike fann att svalor i områden behandlade med Bti hade lägre intag av Bti- känsliga insekter och lägre häckningsframgång än de som häckade i obehandlade områden (Poulin et al. 2010). Detta pekar på att stickmyggor kan utgöra en viktig födoresurs för konsumenter på land samt på deras roll som länk mellan akvatiska och terrestra ekosystem (se även Strasevicius et al. 2013: knott och fåglar i Norrland). Å andra sidan är det möjligt att stora volymer stickmygg i ett område kan ha negativa effekter på ryggradsdjur (inkl. fåglar, Hellgren et al. 2008). Så fann t.ex. Hagemoen och Reimers (2002) att den reproduktiva framgången hos Caribou i Nordamerika minskade kraftigt vid ett konstant tryck från bitande myggor. Här diskuterar vi både möjligheter. Flödet av energi och näring mellan vatten och land är viktigt för att upprätthålla ekosystemens funktion i dessa olika miljöer (Fig. 1). Samtidigt som många terrestra konsumenter är beroende av föda i form av adulta insekter med akvatiska larvstadier är den akvatiska miljön beroende av input i form av organiskt material från exempelvis lövfällning och avrinning (Fig. 1, samt Polis et al. 1997; Malmqvist 2002). De stora mängderna vuxna insekter som årligen lämnar vattnet utgör en viktig födoresurs för exempelvis fåglar, fladdermöss, spindlar och predatoriska insekter (Fig. 1). Till exempel fann Nakano och Murakami (2001) att insekter med akvatiskt ursprung utgjorde 26 % av det totala årliga energiintaget för områdets fågelpopulationer, med stora variationer mellan arter och årstider. Akamatsu och Toda (2011) fann att spindlarna vid en japansk flod var till mellan 31 och 84 % beroende av insekter med akvatiskt ursprung, beroende på jaktmetod. Collier et al. (2002) fick liknande resultat, och fann att nätbyggande och fritt jagande spindlarna till bestod till respektive 61% och 55% av kol med akvatiskt ursprung. I dessa studier hävdar författarna att spindlarna troligtvis utgör en viktig länk mellan de akvatiska och terrestra näringsvävarna. Ovan nämnda exempel utgör exempel 4

de mycket komplexa system av energiflöden och ekologiska processer på landskapsnivå (i stor skala), som vi ännu har begränsade kunskaper om (Malmqvist 2002) Fig. 1: Baxter et al. s (2005) allmän översikt över ömsesidiga flöden av ryggradslösa bytesdjur och ingångar av växtmaterial (mörka pilar) som har direkta och indirekta effekter i vattendrag och intilliggande strandkants näringsvävarna. Vissa arter av framför allt insekter kan periodvis förekomma i mycket höga populationstätheter. När bitande insekter, som myggor och knott, förekommer i sådana mängder kan det troligen få både negativa (som stressfaktor för värddjur samt sjukdomsspridare) och positiva konsekvenser (en hög tillgång på föda) (Steelman 1976; Malmqvist et al. 2004a; Hellgren et al. 2008). I området kring nedre Dalälven är exempelvis boskap svårt ansatt av de rika myggförekomsterna och diande försvåras då moderdjuren inte kan stå stilla (Nilsson och Renöfält 2009). Angrepp från både knott och myggor kan leda till ekonomiska förluster för boskapsskötare (Steelman 1976). Till vilken grad vilda djur påverkas är mindre känt men det finns exempelvis berättelser om hur älgar tar tillflykt i vatten för att undkomma svärmar av bitande knott (Malmqvist et al. 2004). I Polen fann Bukaciński och Bukacińska (2000) att kolonier av häckande fiskmåsar påverkades negativt vid massutbrott av knott. Under år med massiva utbrott övergavs fler fågelbon och kvarvarande föräldrar spenderade mindre tid med att ta hand om ungarna, vilket ledde till svältande ungar och ökad predation. Malmqvist et al. (2004a) ger en bra sammanställning av knott som en viktig nyckelorganism i boreala miljöer. De nämner att adulta knott äts av framför allt fåglar, fisk, insekter och spindlar men att det inte är troligt att många predatorer uteslutande livnär sig på vuxna knott (även Strasevicius et al. 2013). I områden som exempelvis Island kan dock knott och fjädermyggor, till följd av deras höga abundans, utgöra en väsentlig del av födan hos vissa fåglar och fiskar (Gratton et al. 2008). Som nämnts tidigare hade hussvalor lägre häckningsframgång i Bti- behandlade områden (Poulin et al. 2010). 5

På grund av de oregelbundet förekommande översvämningarna uppvisar stickmyggorna vid nedre Dalälven ett oförutsägbart utbrottsmönster (Persson Vinnersten et al. 2014), vilket torde göra dem till en opålitlig födokälla för predatorer. De oregelbundna massutbrotten av myggor skulle kunna liknas vid en så kallad resurspuls (Yang 2004), d.v.s. en tillfällig episod av ökade resurser som är vanligt förekommande naturen. Vandrande/lekande laxar i nordamerikanska floder, kraftiga regn i annars torra miljöer och utbrott av skadeinsekter i skog- och jordbruksmarker är andra exempel på resurspulsar. Yang et al. (2010) gjorde en meta- analys av interaktioner mellan resurspulser och deras konsumenter. Studien omfattade 189 studier, men saknade exempel där blodsugande insekter som myggor och knott utgjorde resursen. Stickmyggor och knott har potential att både utgöra positiva och negativa effekter på ekosystemen, vilket är en ytterligare komplicerande faktor. Till exempel, knott kan både gynnas fåglar som fodoresurs, samtidigt som de sprider blodparasiter (Malmqvist et al. 2004b; Strasevicius et al. 2013). 1.5: Döda stickmygglarver och den jordbundna näringsväven: scenarier med och utan myggbehandling Då insekter uppträder i sådana mängder som stickmyggan vid nedre Dalälven är det troligt att deras predatorer når en mättnadsfas där de inte längre kan utnyttja överskottet av föda (Yang et al. 2010). En stor del av myggorna som dör på land blir därför troligtvis till slut en del av den jordbundna näringsväven. Deposition av vuxna fjädermyggor har visats leda till ökat antal detrivorer som hoppstjärtar, kvalster och larver av tvåvingar på markytan (Hoekman et al. 2011). Hoekman et al. (2012) beskriver än tydligare hur akvatiska insekter inkorporeras i marklevande nedbrytare (hoppstjärtar) med indirekta effekter på deras predatorer (spindlar). Hoekman et al. (2012) återfann isotopsignalen från deponerade fjädermyggor relativt snabbt i främst hoppstjärtar, men efter två år även i större spindlar och växter. Dessa isotopa signaler gick snabbt tillbaka till ursprungsvärdena efter att experimentet avslutats. Bultman et al. (2014) fann att pilträd som växte nära sjöar med hög produktion av chironomider hade högre kväveinnehåll och därför var av bättre kvalité för herbivorer jämfört med pilträd nära sjöar med lågt antal chironomider och diskuterar att detta åtminstone till viss del kan bero på en gödslingseffekt från de akvatiska insekterna. Likaså fann Yang (2004) att massutbrott av cikador i Nordamerika ledde till ökad mikrobiell aktivitet och mängd tillgängligt kväve i jorden vilket i sin tur ledde till ökad tillväxt och reproduktion hos växter. Stickmyggorna vid nedre Dalälven bör således vara en komponent i den jordbundna näringsväven både i Bti- behandlade och obehandlade områden. Skillnaden är (1) att det bör finnas en mycket mer geografisk utsprid direkt effekt av vuxna myggor i den terrestra näringsväven ovan jord i obehandlade områden, i motsats till (2) de behandlade områdena var ytterst få mygglarver överlever till vuxen- stadiumet och därför aldrig når ut i den omgivande miljön, och således koncentreras deras döda kroppar på mycket mindre ytor (dvs. koncentrerade till de fuktiga/vattenfyllda 6

depressioner som finns kvar i terrängen efter översvämningsvattnet har sjunkit). Vi har därför inom ramen för uppdraget att utreda de eventuella effekterna av Bti- behandling på olika nivåer i ett ekosystem, valt att provta både land/mark- levande predatorer (spindlar, skalbaggar mm.) och nedbrytare/detrivorer (hoppstjärtar, daggmask, hornkvalster mm). 1.6) Stabila isotoper som verktyg att utreda effekten av myggbekämpning på näringsvävet Boisvert och Boisvert (2000) nämner att analyser av stabila isotoper kan ge en inblick i eventuella ekosystemeffekter till följd av långvarig användning av Bti, men oss veterligen har detta inte gjorts. Analyser av stabila isotoper, framför allt 13 C och 15 N används flitigt för att studera näringsvävar och trofiska interaktioner (exempelvis vanderzanden och Rasmussen 2001; Gratton et al. 2008; Hoekman et al. 2012). Metoden utnyttjar skillnader i isotopsignal (förhållandet mellan 12 C och den tyngre isotopen 13 C och mellan 14 N och 15 N) som uppstår som följd av det faktum att organismernas enzymsystem som är inblandade i nedbrytningen av proteiner och kolhydrater diskriminerar mot den tyngre isotopen då enzymerna har en större affinitet för den lättare isotopen. De tyngre isotoperna ( 13 C och 15 N) anrikas därmed i organismerna och förhållandet mellan båda isotoperna, som uttrycks som ett δ- värde ändras. Kunskapen om stabila isotoper har sedan länge utnyttjats för att studera trofiska samband och för att spåra ursprunget av kolet i organismerna (Peterson och Fry 1987; Post 2002). Kol från akvatiska primärproducenter (till exampel, Fig 1: algae ) skiljer sig avsevärt från det med terrestert ursprung (till exampel, Fig. 1: leaves ) genom att vara mindre anrikat med den stabila isotopen 13 C. Likaså ökar den relativa andelen 15 N för organismer på högre trofiska nivåer. Kväveisotopsignalen berättar därmed något om på vilken trofisk nivå som en organism befinner sig (Petersen and Fry 1987). En organisms isotopsignal ger således ett integrerat mått på de födoresurser som organismen använder och kan användas för att undersöka långtidseffekter på näringsvävens tillstånd och struktur. Dessutom förväntar vi oss att Vectobact G, som består till stor del av majs, har en avvikande isotopsignal då. Majs är en så kallad C4- växt som uppvisar en betydligt lägre fraktionering av kolet under fotosyntesen än C3- växter, som omfattar de allra flesta växter i den svenska naturen. Som följd av detta har C4- växter en betydligt lägre anrikning (δ) av 13 C ( 9 till 16 ) än C3- växter ( 23 till 33 ). Majs har en δ13c av ca 10 till 11 och skiljer sig därmed väsentligt från de andra (C3) växterna som växer på översvämningsmarkerna utmed Nedre Dalälven. Detta gör att den av majsens isotopsignal lätt kan spåras i näringsväven. Inom detta projekt har vi analyserat bland annat hornkvalster och maskar i de fuktiga markerna, samt spindlar för att mäta om det sker en långsiktig inkorporering av kol från VectoBact G i sumpmarksfaunan. Dessa organismgrupper utgör, vid sidan om flygande insekter, en viktig trofisk länk till 7

fågelfaunan i området. Dessa organismer ger tillsammans svar på frågan om effekter av behandlingen med Vectobact går att spåra i markens och landlevande evertebratfauna. Genom att karakterisera isotoper av 13 C i Aedes sticticus och deras födoresurser i vattensamlingarna, till ex. alger, lövdetritus, får vi en inblick i vilken omfattning myggorna kan spåras i den terrestra näringsväven. Vidare indikerar dessa analyser i vilken omfattning myggornas födoresurser är av akvatiskt eller av terrestert ursprung. Vi studerar även om för alger och bakterier specifika fleromättade fettsyror (PUFA) ger en bättre inblick i myggornas kvalitet som födoresurs för högre trofiska nivåer (Goedkoop et al. 2000; Arts et al. 2009). Essentiella fleromättade fettsyror av omeaga- 3- typ (t.ex. EPA) produceras enbart av alger och är viktiga för organismers tillväxt och reproduktion. Vissa fettsyror är också specifika för alger, respektive för bakterier och förekomst i översvämningsmyggor kan ge en indikation om deras koppling till dessa födoresurser (Goedkoop et al. 2000). Denna kvalitet ska jämföras med den från andra akvatiska insekter och spindlar. Genom att kvantifiera anrikningen av 15 N i spindlar av samma arter får vi en inblick i skillnaderna i näringsvävens längd mellan behandlade och kontrollområden. 1.7) Nyckelfrågor Förutom Naturvårdverkets övervägande frågor om ekologiska och eutrofierings effekter, uppdraget omfattade följande, mer specifika, nyckelfrågor: 1) Bidrar larver av stickmyggan Aedes sticticus till en ökad kvalitet i födoresurs för landlevande evertebrater? 2) Hur ser isotopsignalen av Vectobac G ut i förhållande till andra, naturliga födoresurser? 3) Vilken är effekten av Bti- behandlingen av översvämningsområden på nyckelorganismers isotopsignal ( 13 C och 15 N), samt på näringsvävens struktur och komplexitet? 2) Metodik 2.1) Nedre Dalälven Miljön kring Nedre Dalälven karakteriseras av ett flackt landskap, våtmarker och andra områden anslutna till älven är starkt påverkade av återkommande årliga översvämningar. Sådana tillfällen med hög vattenföring och följande översvämning kan inträffa flera gånger under loppet av en växtsäsong. Områdets höga artrikedom och det faktum att det är hemvist för många hotade arter gör det mycket värdefullt ur naturvårdssynpunkt varför stora arealer också utgörs av skyddad natur. På grund av de extremt höga tätheterna av stickmygg har kläckningsoråden i Nedre Dalälven behandlats med Bti sedan år 2002. 8

De lokaler som användes i studien är de samma som Biologisk Myggkontrol (www.mygg.se) använder i sitt egenkontrollprogram. Lokalerna ligger i och omkring Färnebofjärdens nationalpark (Fig. 2, Tabell 1) och utgörs av öppna översvämingsängar som påverkas av områdets periodiska översvämningar. Material för analys av stabila isotoper samlades in från fem obehandlade referensområden och fem områden som tidigare år vid upprepade tillfällena (från och med 2002) har behandlats med Bti. B1# B2# B4# K3# B3# B5# K4# K5# K2# K1# B# Behandladeområde# K# Kontrolområde# Figur 2: Karta över de kontrollområden (K) och Vectobact - behandlade områden (B) grupperad i par (1 5). Lokalnamn: K1 = Göknäset, K2 = Rönnsmyran, K3 = Kyrkänget, K4 = Hamrevallen, K5 = Gångbroholmen. B1 = Koversta, B2 = Fängsjön, B3 = Fågle, B4 = Ista 1, B5 = Ista 2. 9

Tabell 1: Kontrollområden (K) och Vectobact - behandlade områden (B) grupperad i par, med information om dominerande jord- och vegetationstyper. Paren 1-3 omfattar våtmarken dominerade av Carex och gräs, medan paren 1-2 även karaktäriseras av Salix (sälg). Paren 4-5 karaktäriseras av mossor, framförallt Sphagnum, som saknas i paren 1-3 Typ Par Lokalnamn Jorddjup Dominerande jordarter Markvegetation - % täckning (m) Jordart 1 Jordart 2 Elev. (masl) Carex sp. Gräs Mossor Sphagnum Salix % täckning K 1 Gök 1-10 Sandig morän Glaciallera 55 86 13 0 0 5 B 1 Koversta 1-20 Sandig morän Kärrtorv 55 86 8 5 0 10 K 2 Rönn 5-20 Sandig morän Glaciallera 55 88 8 0 0 5 B 2 Fängsjö 5-20 Sandig morän Glaciallera 55 92 2 0 0 8 K 3 Kyrk 3-20 Sandig morän Svämlera 55 10 84 0 0 0 B 3 Fågle 5-20 Sandig morän Glaciallera 60 44 56 0 0 0 K 4 Ham 3-10 Sandig morän Glaciallera 55 54 14 29 20 0 B 4 Ista 1 5-10 Glaciallera - 60 34 40 22 22 5 K 5 Gång 10-20 Kärrtorv Sandig morän 55 52 5 42 42 0 B 5 Ista 2 10-20 Glaciallera Kärrtorv 60 17 34 46 46 17

2.2) Provtagning Insamlingen av organismer för analys av stabila isotoper genomfördes 22-24 juli 2014, ca två veckor efter årets andra kläckningsperiod och efterföljande bekämpningsinsats som ägde rum 9-10 juli. Vid tillfället för insamlingen hade vattnet redan sjunkit bort och områdena var relativt torra. Ett andra besök i gjordes 11-12 augusti för en kompletterande provtagning av hoppstjärtar (Collembola) samt jordprover från värje lokal, och akvatisk biofilm från växter i Dalälven, närliggande till våra lokaler. Spindlar av arten kärrspindel (Dolomedes fimbriatus) samt individer av familjen vargspindlar (Lycosidae) valdes som representanter för olika födostrategier. Kärrspindlar samlades in genom att visuellt söka efter individer som fångades in och förvarades i individuella burkar. Individer från familjen vargspindlar (Lycosidae) samlades in genom att svepa vegetationen med en slag håv nära marknivå. Med denna metod fick vi även juvenila kärrspindlar som samlades in om antalet vuxnar var lågt. För att få ett representativt prov var målsättningen att samla in åtminstone 5 individer per grupp och lokal. Alla infångade spindlar hölls levande i individuella burkar och förvarades kallt och mörkt tills fortsatt bearbetning på laboratoriet. Organismer från den markbundna näringsväven samlades in genom utdrivning av jordprover. Jordprover togs både från tuvor samt från de lite fuktigare partierna mellan tuvorna. Om lokalen inte hade en tuvig karaktär togs proverna från högre torrare och lägre fuktigare partier så långt detta var möjligt. Två tuvor från varje lokal skars av med en spade och ett prov på ca 0.5 m 3 skars ut. Eventuella maskar som hittades under denna procedur sparades i en burk med jord. Två prover mellan tuvorna togs med en s.k. soil corer. Alla prover förvarades kallt fram till utdrivning. Proverna från tuvorna extraherades över Tullgren- trattar i totalt tre dygn, proverna från de lägre områdena extraherades vått genom att proven lades ovan vattenfyllda trattar och djuren samlades upp i vattenfyllda rör. Under utdrivningen plockades djuren dagligen och förvarades kallt. För att samla hoppstjärtar togs ett stort jordprov (ca 25 cm 3 ) och las i ett spann med vatten, hoppstjärtarna plockades i fält då de flöt upp till ytan. Under en rekognosceringstur till lokalerna bedömdes kråkklöver (Potentilla palustris) samt Carex- arter vara de dominerande växterna som även var möjliga att hitta på varje lokal. Blad från kråkklöver och den dominerande carex- arten samlades in och förvarades kallt. För att få ett representativt prov togs blad från många individer över ett större område. Vid det andra besöket togs 5 stycken jordprover per lokal med en soil corer. Eventuell biofilm samlades in genom att växter skars av nära marknivå och lades i 1l- burkar fylda med destillerat vatten. I de fall våra provtagningsområden inte låg långt ifrån älven samlade vi även stjälkar med biofilm från vattenlevande växter i närheten av lokalen. 11

Till följd av en mindre översvämning strax innan vår provtagningsperiod var det möjligt för personal från bolaget Biologiskt myggkontrol att samla i några vuxna myggor framkläckta från larver. Larverna samlades ifrån ett av våra provtagningsområden (Ista). Eftersom dessa myggor var nykläckta och ännu inte hade ätit som vuxna, så speglar deras isotopsammansättning helt och hållet den föda som de hade tillgång till som larv, dvs. i vattenpölarna på översvämningsområdena. 2.3) Beredning och analys: isotoper och fettsyror Insamlade organismer sorterades i följande taxonomiska grupper: juvenila och adulta kärrspindlar (Dolomedes fimbriatus), vargspindlar (Lycosidae sp.), hornkvalster (Acari: Oribatidae), övriga kvalster, hoppstjärtar (Collembola), daggmaskar (Lumbricidae) och småringsmaskar (Enchytraeidae), samt juveniler (d.v.s. larvstadier) av fjädermyggor (Diptera: Chironomidae och harkrankar (Diptera: Tipulidae) och skalbaggarna som tillhör kortvingar (Coleoptera: Staphylinidae). I väntan på infrysning förvarades organismerna kallt utan tillgång till mat. De provtagna grupperna representerar de viktigaste funktionella komponenterna i den marknära näringsväven, d.v.s. (i) maskar (inklusive både den vanliga daggmasken och fukttoleranta småringsmaskarna), som livnär sig på växtmaterial, alger, bakteriemattor med mera, (ii) mikrodetrivorna (hoppstjärtar och hornkvalster), som äter svamp (framfröralt hornkvalsterna) samt död växt- och djur material, (iii) rovkvalster (andra kvalster förrutom hornkvalster), (iv) större mark- levande rovdjur, som spindlar och skalbaggarna, och (v) akvatiska och semi- akvatiska larver av tvåvingar (fjädermygg- och harkrankslarv), som också livnär sig på en blandning av bakterier, alger och dött organiskt material. Det flesta grupperna samlades in från samtliga våtmarker, förutom daggmaskar och harkrankslarver som saknades från endast 5-6 områden (Tabell 2). Tabell 2: Antalet våtmarker inom Vectobact - behandlade områden och kontrollområden värje kategori (kontroll och behandlad) var de olika organism grupper samlades ifrån Taxonomisk grupp Kontroll Behandlade Daggmaskar 2 3 Småringsmaskar 5 5 Hoppstjärtar 5 5 Hornkvalster 5 5 Fjädermyggor larv 5 5 Harkrankslarver 2 4 Predatoriska kvalster 5 5 Kortvingar 5 5 Kärrspindlar 5 5 Vargspindlar 5 5 12

Biofilmen från de insamlade växterna borstades försiktigt av i det vatten de förvarats i. Detta vatten filtrerades sedan genom Whatman glasfiberfilter för att fånga biofilmassociareade alger och andra mikrober. 1,5-2,5 deciliter vatten filtrerades beroende på hur snabbt porerna i filtret täpptes igen. Filtrerna inspekterades sedan för att ta bort eventuella större partiklar och lades i 4 ml rör. Allt erhållet material frystes i flytande kväve ( 196 C) och förvarades i frys tills frystorkning utfördes. Vid tidpunkten för infrysning var alla organismer förutom Staphyliniderna levande. Efter frystorkning vägdes prover in och paketerades i 5x9 mm tennkapslar. Större djur och växter finfördelades och homogeniserades innan invägning för att erhålla ett representativt delprov. Målvikterna vid invägningen av evertebrater och växter var 1,25 mg och 3,48 mg respektive, för jord ca 6 mg. För filtrena med biofilm togs 10 stycken 4 mm diskar per filter med en håltagare och staplades i tennkapslar. Tre prover med blanka filter vägdes in för att erhålla signalen från själva filtrena. För att erhålla variationen i de primära födoresursernas isotopsignal analyserades tre replikat av växterna och jorden från varje lokal. Detta kunde tyvärr inte göras för biofilmen. Proverna analyserades med avseende på stabila isotoper av kol och kväve. Analyserna utfördes av Stable Isotope Facility vid University of California. För fasta prover (exkl. Glasfiberfilter, markprover, sediment, se nedan) analyserades med avseende på 13 C och 15 N med en PDZ Europa ANCA- GSL elementanalysator utrustad med en PDZ Europa 20-20 isotopkvot masspektrometer (Sercon Ltd., Cheshire, UK). I analysen förbränns proverna vid 1000 C, renas upp och analyseras med masspektrometri (se Lau et al. (2014) för detaljer). Isotopkvoten beräknas enligt en internationell standard där förhållandet mellan den lätta och tunga isotopen i organismerna jämförs med den för internationella standarder, d.v.s förhållandet mellan C- isotoper i kalksten (Vienna Pee Dee Belemnite) och förhållandet mellan kväveisotoper i luften. Isotopkvoter beräknas enligt följande formell: (Rprov/Rstandard) 1] x 1000, där R = 13 C: 12 C eller 15 N: 14 N. Precisionen för upprepade analyser är 0,03 för δ 13 C och 0,20 för δ 15 N. Ett stickprov på nykläkta adulta översvämningsmyggor analyserades med avseende på fettsyrasammansättning enligt de metoder som beskrivs i Lau et al. (2012). 4.4) Statistisk analys Innan statistisk analys delades behandlade översvämningsområden och obehandlade kontrollområden in i 5 par baserat på markens beskaffenhet och vegetationens sammansättning (Tabell 1, Figur 2). Information om markens beskaffenhet erhölls från Sveriges Geologiska Undersökning (SGU), medan en bedömning av vegetationens sammansättning gjordes på plats i de olika områdena (3 rutor motsvarande 5 m 2 vardera). Användningen av dessa parade områden täcker in variation mellan områdena, särskilt vad gäller vegetationens beskaffenhet, som annars kunde ha dolt effekter av myggbehandling. Tre ansatser användes för att utvärdera isotopdata: 13

1) Isotopdiagram ( biplots ): Diagram där δ 13 C för varje prov avsattes mot dess δ 15 N producerades med SIAR, som är del av programmet R (SIAR: Stable Isotope Analysis in R (version 4.1.3)). Dessa diagram visar likheten av olika födokällor till olika grupper av evertebrater. Vid framtagandet av dessa isotopdiagram slogs data från de 5 kontrollområden ihop. Likaså slogs data för de 5 behandlade områdena ihop. Detta resulterade i två diagram som summerar data för de behandlade- och kontrollområden. För att skapa en bättre översikt over datan förenklades diagrammen ytterligare genom att slå ihop olika taxonomiska grupper till följande funktionella grupper: mikrodetritivorer (hornkvalster och hoppstjärtar), maskar (daggmaskar och småringsmaskar), semi- akvatiska tvåvingar (fjädermyggor och harkrankar), samt predatoriska skalbaggar (Staphylinidae) och rovkvalster (övriga Acari). För födoresurser plottades medelvärden (± standardavvikelse) för de fem områdena i varje kategori. För VectobactG och vuxna myggor plottades medelvärden (± standardavvikelse) för 3 upprepade analyser. 2) Isotopic Niche Space: Organismernas nischutrymme, som bestäms av deras isotopsammansättning, ger för behandlade områden och obehandlade kontrollområden en skattning av variationen i deras isotopsammansättning. Isotopnichutrymmet beräknas som den standardiserade arean på en elips (Standardised Elips Area, SEA) för samtliga arter i δ 13 C- δ 15 N diagrammet för de olika typer av områden (Jackson et al. 2011). Den standardiserade elipsen omfattar ca 40 % av alla data och kan användas för att uppskatta den av isotoperna bestämda nischen för organismsamhällena (Jackson et al. 2011). Signifikanstester: Statistisk signifikans och skillnader mellan behandlade områden och obehandlade kontrollområden (tabell 1) gjordes med parade t- tester i programmet JMP (Version. 11.0, SAS institute). Tester gjordes inte för de organismgrupper (se tabell, 2) som saknade tillräcklig replikering i de olika typerna av områdena. Alla tester är ensidiga, för att testar hypoteserna att δ 13 C efter behandling med Vectobact ändras i riktning mot värden av VectobacG (dvs. mot mindre negativa värden), samt att δ15n ändras mot ökade värden, som en indikation av ökad trofisk komplexitet. 3) RESULTAT OCH DISKUSSION 3.1) Isotopdiagram Isotopdata för behandlade områden och icke behandlade kontrollområden visas i figur 3. Diagrammen visar för varje typ av område medelvärden för olika taxa av evertebrater och deras födoresurser (n=5), d.v.s. alger från översvämningsområden och sjöar, samt VectobactG (n=3) och översvämningsmyggor Aedes sticticus (n=3), som också utgör potentiella födoresurser. Olika taxoners position i förhållande till födoresurser utmed Y- axeln (δ 15 N) ger en inblick i vad som är deras huvudsakliga föda och deras position i näringsväven (föda och konsumenter på olika trofiska nivåer). Organismernas position utmed X- axeln (δ 13 C) ger en inblick i den relativa betydelsen av olika födotyper för organismerna. Figuren visar att det finns en del iögonfallande skillnader i isotopsammansättning mellan taxa i behandlade områden och kontrollområden. Nedan förklaras mer ingående vad diagrammen visar, både för födotyperna och konsumenter. Sedan fokuserar vi på en jämförelse mellan behandlade områden och kontrollområden. 14

15 N 0 2 4 6 8 10 Kontroll områden 30 25 20 15 10 13C Behandlade områden 15 N 0 2 4 6 8 30 25 20 15 10 13 C Biofilm från ängen Sjö biofilm Kråkklover (P. palustris) Starrsläktet (Carex) Jord Vectobac-G Mygg (A. sticticus) Daggmaskar och småringsmaskar Hornkvalster och hoppstjärtar Fjädermyggor och harkrankar Övriga kvalster (rovkvalster) Kortvingar (Skalbagge) Vargspindlar och kärrspindel Figur 3: Diagram som visar isotopdata för fem kontrollområden och fem Vectobact - behandlade områden. Födoresurser visas med färgade punkter (± 95% konfidensintervall), medan olika organismgrupper visas med andra symboler 15

3.1.1) Födotyper (δ 13 C) 1) Som väntat visar C- isotopsignalen att VectobactG (den rosa punkten i figur 3) har en betydligt mindre negativ signal än alla andra prover. Detta beror på att VectobactG är gjort på majs, som är en C4- växt. C4- växter har en avvikande fotosyntesreaktion jämfört med C3- växter och har fördelar i varma klimat. Då inga andra växter i den svenska naturen är en C4- växt ger det majsbaserade VectobactG således en för ekosystemen unik, betydligt mindre negativt, isotopsignal. Denna avvikande signal ger oss en möjlighet att spåra VectobactG i ekosystemen. 2) Det faktum att VectobactG avviker i isotopsignal gör att de övriga punkterna blir ihop tryckta i diagrammen (Figur 3). Trots detta visar de övriga födoresurserna en förväntad fördelning utmed x- axeln, med mera negative värden för alg proverna än för landväxterna. Alg proverna är dock inte så negativ som rena alg prover ((δ 13 C = ca 30), vilket tyder på alg proverna också innehöll material med ett ursprung i landekosystemen (t.ex. organiska partiklar eller fekalier från evertebrat som livnär sig på växtdelar). Att så sker är inte ovanligt i fältstudier av isotoper (Lepori et al. 2006). 3) Intressant är också att jordproverna visar mera negativa δ 13 C- värden än växtproverna, förmodligen som en följd av upprepade översvämningstillfällen i områdena (Fig. 3). Varje gång som älvens vatten drar sig tillbaka lämnar det sannolikt rester av organiskt material med ett akvatiskt ursprung (d.v.s. alger, delar av vattenväxter och/eller amorft material) och minskar därmed markens δ 13 C signal (exampelvis Tockner et al. 1999; Bastow et al. 2002; Hein et al. 2003). 4) δ 13 C signalen för översvämningsmyggor (medelvärdet δ 13 C = - 27.8) var närmare signalen för terrestriella växter (- 27.6) än den för akvatiska biofilmer (29.9) (Fig. 3). Detta tyder på att algproduktionen i biofilmer i de tillfälliga vattensamlingar på översvämningsmarkerna, där mygglarverna fullbordar större delen av sin livscykel, är låg. Större delar av den föda (kol) som mygglarverna konsumerar har sitt ursprung i landekosystemen. Förmodligen förmedlas denna signal av bakterier som bryter ned organiskt material och utgör den huvudsakliga födan för mygglarverna (Nilsson 1987). 3.1.2) Positionen för organismer i isotopdiagrammen 1. Utmed Y- axeln (δ 15 N) fördelar sig organismerna sig enligt ett förväntat mönster, med organismer som livnär sig på levande och dött organiskt material (t.ex. mikrodetritivorer, maskar och semi- akvatiska tvåvingar) längst ned och predatorer (t.ex. kvalster, spindlar och skalbaggar) högst upp (Figur 3). Detta beror att en anrikning sker med varje trofisk nivå genom isotopfraktionering, det vill säga att organismernas fysiologi diskriminerar mot den tunga kväveisotopen ( 15 N), som därmed i större omfattning anrikas i organismerna. Detta leder till högre (δ 15 N- värden för predatorer än för primärkonsumenter (växtätare och detritivorer). 2. Ett intressant resultat är att mikrodetritivorer, maskar och semi- akvatiska tvåvingar alla har en δ 13 C- signal som är betydligt mera negativt, d.v.s. kring - 25, 16

än de landväxter som provtogs (Figur 3). Detta visar, i likhet med det mycket negativa värdet för jordproverna, att en stor del av kolet som härstammar från akvatisk primärproduktion (växtplankton, påväxtalger, amorft material) som deponerats på översvämningsområdena under högvattentillfällen, inkorporeras i den terrestra näringsväven. Efter deposition inkorporeras materialet i maskar, hoppstjärtar och andra konsumenter som livnär sig denna basresurs (Tockner et al. 1999; Bastow et al. 2002). Akvatisk kol kan även inkorporeras i landekosystemens näringsväv genom svärmande akvatiska insekter som utgör byte för terrestra predatorer eller som dör i landekosystemen efter parning och blir för asätare (Collier et al. 2002; Akamatsu och Toda 2011). 3.1.3) Jämförelse mellan isotopdiagrammen från behandlade områden och kontrollområden Den mest väsentliga skillnaden mellan behandlade områden och kontrollområden (Figur 3, se även Fig. 4) var att δ 13 C- signalen för organismer vid näringsvävens bas, särskilt mikrodetritivorer och maskar, har skiftat mot mindre negativa värden. Detta kan inte förklaras med förändringar i landväxternas isotopsammansättning, som inte skiljde mellan behandlade områden och kontrollområden. I stället är det troligt att förändringar mot mindre negativa δ 13 C- värden i behandlade områden orsakas av de två födoresurser som endast förekommer i behandlade områden, VectobactG - associerad majs och döda mygglarver och puppor som blir kvar i översvämningsområdena som följd av behandlingen (i stället för att kläcka och flyga ut). Den statistiska signifikansen av dessa förändringar behandlas i stycke 3.3 nedan. δ 13 C- signalen för organismerna varierade mellan - 25 och - 30 i de behandlade områdena och mellan - 26 och - 33 i kontrollområdena (Figur 3), vilket tyder på en förändring i födoresursers isotopsignal som följd av behandlingen (förändring är signifikant, paired t- test t = - 2.51, df = 8, p = 0.018). Samtidigt visar behandlade områden högre maximumvärden för δ 15 N- signalen. Detta betyder på att organismer med samma taxonomiska tillhörighet har en högre trofisk nivå i de behandlade områdena än i kontrollområdena. Det tyder på att behandlade områden har en högre trofisk komplexitet (fler trofiska nivåer) än kontrollområden. Den statistiska signifikansen av dessa förändringar behandlas i stycke 3.2-3.3 nedan. 3.2) Isotopnischutrymmet Det så kallade isotopnichutrymmet har beräknats som den standardiserade arean på en elips (Standardised Elipse Area, SEA) för samtliga arter i δ 13 C- δ 15 N diagrammet för de olika typer av områden (Jackson et al. 2011). Elipsdiagrammet (Figur 4) illustrerar den ovan nämnda förskjutning av organismsamhällena på behandlade områden mot lägre δ 13 C- värden och högre δ 15 N- värden. Dessutom är elipsen för behandlade områden signifikant mindre än för kontrollområdena, vilket tyder på en reduktion i det totala nischutrymmet i behandlade områden. Det innebär att primärkonsumenter vid näringskedjans bas livnär sig på en smalare resursbas i behandlade områden. 17

Kontroll Behandlade Figur 4: Isotopbaserade s.k. nisch- elipser för kontrollområden (svart) och Vectobact - behandlade områden (rött). Figuren visar en signifikant minskning i den totala nischen för organismsamhällen i de behandlade områdena (parad t- test: t = - 1.95, df = 8, p = 0.043). 3.3 Statistisk analys av data för behandlade områden och kontrollområden Resultat av parade t- tester som testar om det finns skillnader mellan δ 13 C och δ 15 N för olika evertebrater i behandlade områden och kontrollområden redovisas i tabell 3. Nedan beskriver vi kort huvuddragen för dessa resultat för olika djurgrupper. Tabell 3: Resultaten ifrån en- sidiga parade t- tester för olika organismgrupper, som testar hypoteserna att δ 13 C ändras mot mindre negativa värden efter behandling med Vectobact, samt att δ15n ändras mot ökade värden. Observera att inga tester gjordes för daggmaskar eller harkarkar, då dessa hittades inte i alla områden (Tabell 2), vilket ledde till allvarliga frihetsgradsförsluster. Alla tester är gjorda med 4 frihetsgrader. Ns anger icke signifikanta resultat. δ 13C δ 15N Group Taxon t p-värde t p-värde Maskar Enchytraeidae (småringsmaskar) 6.42 <0.001 0.44 ns Lumbricidae (daggmaskar) - - Alla maskar 4.23 0.001 1.49 0.086 Mikrodetrivorna Collembola (hoppstjärtar) 0.13 ns 0.07 ns Oribatidae (hornkvalster) 2.27 0.026 2.75 0.014 Tvåvingar Chironomidae (fjädermyggor) 1.43 ns 1.6 ns Tipulidae (harkrankar) - - Spindlar Lycosidae (vargspindlar) 0.49 ns 0.25 ns Dolomedes fimbriatus (kärrspindel) 2.23 0.028 3.48 0.004 Alla spindlar 2.3 0.025 2.62 0.015 Andra-predatörer Övriga Acari (dvs, rovkvalster) -0.08 ns 0.64 ns Staphylinidae (Kortvingar) 2.74 0.013 0.75 ns 18

3.3.1 Daggmaskar och småringsmaskar 1. En signifikant skillnad fanns mellan δ 13 C- signalen om data för både daggmaskar (Aporrectodae) och småringsmaskar (Enchytraedae) slogs ihop (figur 5). Även data för endast småringsmaskar visade på signifikant högre δ 13 C- värden för behandlade områden än för kontrollområden (Figur 5). För endast daggmaskar fann vi ingen signifikant skillnad, vilket berodde på ett lägre antal frihetsgrader som följd av att daggmaskar inte påträffades på varje område. 2. Resultaten pekar mot högre δ 15 N- värden för daggmaskar i behandlade områden (Figur 5), men detta kunde inte testas av samma anledning som beskrivits ovan för δ 13 C. Småringmaskar visade inte samma trend mot högre δ 15 N- värden och skillnaden mellan områdena var inte signifikant. Även en sammanslagning av data för båda grupper av maskar visade inte någon signifikant skillnad mellan områdena. 3. De statistisk signifikanta skillnaderna i δ 13 C (Fig. 5) stödjer det som isotopdiagrammen (Figur 3-4) visar, nämligen att isotopvärdena för maskar rör sig mot mindre negativa värden, d.v.s. bort från kolsignalen för de akvatiska födoresurserna och mot kolisotopsignalen för VectobactG. Sannolikt är det en effekt av den upprepade appliceringen med VectobactG, dels direkta effekter genom tillförseln av en kolkälla med ett lågt δ 13 C- värde, dels indirekt genom de stora antalen döda larver/puppor av översvämningamyggor som blir kvar efter VectobactG - appliceringen. Daggmaskar'δ13C' Aporrectodea 13C -22-24 -26-28! Aporrectodea 15N Daggmaskar'δ15N' 5 4 3 2 1! Småringsmaskar'δ13C' Enchytraeidae 13C Samtliga'makar'δ13C' All worms 13C -30-22 -24-26 -28-30 -22-24 -26-28 -30 *** ** Reference Treated Kontroll'''''''Behandlade' Kontroll'''''''Behandlade' Figur 5: Medelvärden (± 1 standard ' avvikelse) för 13C (vänster) och 15N (höger) ' för Aporrectodae (daggmaskar), Enchytraeidae (småringsmaskar) och samtliga maskar (båda grupper ihopslagna) i Vectobact - behandlade områden och kontrollområden. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, = 0.1 > p > 0.05, = ej signifikant,! = ingen test möjlig som följd av för låga frihetsgrader. Enchytraeidae 15N Småringsmaskar'δ15N' All worms 15N Samtliga'maskar'δ15N' 0 4 3 2 1 0 4 3 2 1 0! " Reference Treated 19

3.3.2 Hoppstjärtar och hornkvalster (Mikrodetrivorer) 1) Ingen skillnad i varken δ 13 C eller δ 15 N observerades för hoppstjärtar från behandlade områden och kontrollområden (Figur 6). 2) En signifikant förändring i både δ 13 C och δ 15 N- signal observerades för hornkvalster. Hornkvalster från VectobactG - behandlade områden hade högre δ 13 C och högre δ 15 N än kontrollområdena (Figur 6). Förskjutningar i δ 13 C- signalen mot högre (d.v.s. mindre negativa) värden liknade den som vi fann för småringmaskarna, vilket sannolikt är en effekt av tillförseln av födoresurser i form av VectobactG och döda larver av Aedes sticticus (se ovan). 3) De observerade ökningarna i δ 15 N för hornkvalster tyder på fler eller mindre effektiva fraktioneringar av kvävet mellan trofiska nivåer innan det inkorporeras i kvalsterbiomassa (se nedan). Collembola 13C Hoppstjärter'δ13C' -22-24 -26-28! Collembola 15N Hoppstjärter'δ15N' 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5! -30 0.0-22 * 4 *** Oribatidae 13C Hornkvalster'δ13C' -24-26 -28 Oribatidae 15N Hornkvalster'δ15N' 3 2 1-30 Reference Treated Kontroll''''''''''Behandlade' Wetland '''' Type 0 Reference Treated Kontroll''''''''''''''''''''Behandlade' Wetland '''' Type Figur 6: Medelvärden (± 1 standard avvikelse) för 13C (vänster) och 15N (höger) för Collembola (hoppstjärtar) och Oribatidae (hornkvalster) i Vectobact - behandlade områden och kontrollområden. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, = 0.1 > p > 0.05, = ej signifikant,! = ingen test möjlig som följd av för låga frihetsgrader. 20

3.3.3 Semi- akvatiska larver av tvåvingar (Diptera) 1) Inga signifikanta skillnader i isotopsammansättning observerades för fjädermygglarver insamlade i behandlade områden och kontrolområden (Figur 7). 2) För harkrankslarver fanns en trend mot en mera negativ δ 13 C- signal i behandlade områden, men eftersom dessa larver endast kunde hittas i två av kontrollområdena var antalet replikat för lågt för att testa skillnaderna statistiskt (Tabell 2). Trenden är dock den omvända jämfört med den för maskar och hornkvalster (Figur 7, Tabell 2).!! Fjädermyggor'δ13C' Chironomidae larvae 13C -22-24 -26-28 Chironomidae larvae 15N Fjädermyggor'δ15N' 4 3 2 1 Harkrankar'δ13C' Tipulidae larvae 13C -30-22 -24-26 -28! Tipulidae larvae 15N Harkrankar'δ15N' 0 6 5 4 3 2 1! -30 Reference Treated Kontroll'''''''''Behandlade' Wetland Type '''' 0 Reference Treated Kontroll''''''''''''''''''''Behandlade' Wetland '''' Type Figur 7: Medelvärden (± 1 standard avvikelse) för 13C (vänster) och 15N (höger) för Chironomidae (fjädermyggor) och Tipulidae (harkrankar) i Vectobact - behandlade områden och kontrollområden. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, = 0.1 > p > 0.05, = ej signifikant,! = ingen test möjlig som följd av för låga frihetsgrader. 21

3.3.4 Spindlar 1) Kärrspindlar (arten Dolomedes fimbriatus) visade samma skillnad i δ 13 C och δ 15 N (Figur 8) som den som observerades för andra djurgrupper (Figur 5 och 6). Även för kärrspindlar noterades högre δ 13 C och δ 15 N- värden i behandlade områden än i kontrollområden. 2) Vargspindlarna visade samma trend som kärrspindlar, men skillnaderna var inte signifikanta (Figur 8) 3) Även en sammanslagning av data för båda grupper av spindlar visade samma signifikanta trender. Lycosidae 13C Vargspindlar!δ13C! Dolomedes 13C Kärrspindel!δ13C! All spiders 13C Samtliga!spindlar!δ13C! -22-24 -26-28 -30-22 -24-26 -28-30 -22-24 -26-28 -30 * Reference Treated Lycosidae 15N Vargspindlar!δ15N! Dolomedes 15N Kärrspindel!δ15N! All spiders 15N Samtliga!spindlar!δ15N! 7 6 5 4!! * Kontroll!!!!!!!Behandlade! Wetland! Type 3 2 1 0 8 7 6 5 4 3 2 1 0 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ** * Reference Treated!!!Kontroll!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Behandlade! Wetland! Type Figur 8: Medelvärden (± 1 standard avvikelse) för 13C (vänster) och 15N (höger) för Lycosidae (vargspindlar) och Dolomedes fimbriatus (kärrspindel) i Vectobact - behandlade områden och kontrollområden. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, = 0.1 > p > 0.05, = ej signifikant,! = ingen test möjlig som följd av för låga frihetsgrader. 22

3.3.5 Andra predatorer 1) Inga skillnader i isotopkvoter observerades för predatoriska kvalster från behandlade områden och de från kontrollområden (Figur 9). 2) Även för larver av skalbaggar som hör till kortvingarna (Staphylinidae - kortvingar) observerades en signifikant trend mot högre δ 13 C- värden i den behandlade områdena (Figur 9). δ 15 N för denna grupp skiljde sig inte mellan behandlade områden och kontrollområden. Rovkvalster'δ13C' Predacious mites 13C -22-24 -26-28! Rovkvalster'δ15N' Predacious mites 15N 7 6 5 4 3 2 1! Staphylinidae Kortvingar'δ13C' larvae 13C -30-22 -24-26 -28 * Kortvingar'δ15N' Staphylinidae larvae 15N 0 5 4 3 2 1! -30 Reference Treated Kontroll'''''''''Behandlade' Wetland '''' Type 0 Reference Treated Kontroll''''''''''''''''''''Behandlade' Wetland '''' Type Figur 9: Medelvärden (± 1 standard avvikelse) för 13C (vänster) och 15N (höger) för rovkvalster och Staphylinidae (skalbaggar) i Vectobact - behandlade områden och kontrollområden. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, = 0.1 > p > 0.05, = ej signifikant,! = ingen test möjlig som följd av för låga frihetsgrader. 23

3.4 Fettsuraanalys av larver av översvämningmyggan Fettsyror kan användas som biomarkörer då de assimileras och inkorporeras i organismernas vävnader (se Napolitano 1999) och för att vissa fettsyror är essentiella för organismernas tillväxt och utveckling (Brett och Müller- Navarra 1997; Arts et al. 2009). 26 olika fettsyror kunde detekteras i larverna (Tabell 4). Vanligast förekommande var de enkelomättade fettsyrorna oljesyra (18:1ω9) och palmitolsyra (16:1ω7), som tillsammans utgjorde 52% av fettsyrorna. Dessa fettsyror är vanligt förekommande i växtmaterial. Palmitolsyra är t.ex. vanlig i kiselalger (Brett och Müller- Navarra 1997; Napolitano 1999; Goedkoop et al. 2000; Arts et al. 2009) och vissa arter av cyanobakterier (Ahlgren et al. 1997). Även 20:5ω3 (EPA), som utgjorde nästan 5% av fettsyrorna i mygglarverna (Tabell 4), är en fettsyra som är vanligt förekommande i kiselalger. Dock anses dessa halter som lågt i jämförelse med andra akvatiska organismer (se nedan). 3.5: Huvudfrågorna i uppdraget 3.5.1 Mygglarvers kvalitet som föda för landlevande predatorer. Adulta insekter som kläcker från akvatiska ekosystem utgör en viktig och högkvalitativ föda för predatorer och asätare i landekosystemen. Att dessa insekter utgör en högkvalitativ föda beror på de höga halterna av långa fleromättade fettsyror, särskilt 20:5ω3 (EPA), som karaktäriserar akvatiska insekter. Dessa fettsyror har visat sig vara viktiga för tillväxt och reproduktion hos akvatiska evertebrater (Müller- Navarra 1995; Goedkoop et al. 2000; Brett et al. 2009). Dock anses dessa halter som lågt i jämförelse med andra akvatiska organismer, där 30- >50% av fettsyrorna kommer från akvatiska alger (Brett et al. 2009; Komínková et al. 2012). Mygglarverna hade också låga koncentrationer av palmitolinsyra (16:1ω7), som också anses vara en indikator för kiselalger. Isotopsignalen visar att myggorna har en δ 13 C- signal som ligger närmare den för landväxter än för akvatiska alger, vilket tyder på att deras huvudsakliga föda ändå kommer från bakterier och växtmaterial av terrestert ursprung. Att alger inte tycks utgöra en kvantitativt viktig födoresurs för myggorna kan beror på den ringa produktionen i de vattensamlingarna som finns kvar efter översvämningsvattnet har sjunkit, som ofta ligger djupt (och mörkt) mellan grästuvorna. Adulta myggor kan utgör under kläckningsperioder en viktig födoresurs för landlevande djur som spindlar, fåglar och fladdermöss. Det är dock oklart i vilken omfattning dessa predatorer livnär sig på adulta myggor under de relativt korta kläckningsperioderna och om effekter av myggkläckningarna snarare har negativa effekter på predatorer, t.ex. genom att de blir bitna och tappade på blod. Resultaten från fettsyra analysen tyder på att adulta myggor inte har en extra kvalitet som födoresurs jämförbart med andra insekter, därför att mängden av omega- 3 fettsyror var inte speciellt höga. 24