PLATELIA Candida Ab Plus 96 TEST 62785 DETEKTION AV ANTI-MANNAN CANDIDA-ANTIKROPPAR I HUMANT SERUM ELLER PLASMA GENOM IMMUNOENZYMATISK METOD

PLATELIA Candida Ab Plus 96 TEST 62785 DETEKTION AV ANTI-MANNAN CANDIDA-ANTIKROPPAR I HUMANT SERUM ELLER PLASMA GENOM IMMUNOENZYMATISK METOD 1- AVSEDD ANVÄNDNING Platelia Candida Ab Plus är en immunoenzymatisk mikroplattsanalys av sandwich-typ för detektion av anti-mannan totala Igantikroppar i humant serum eller plasma. 2- INDIKATIONER FÖR ANVÄNDNING En diagnos av invasiv candidainfektion måste baseras på en kombination av detektion av antikroppar och detektion av cirkulerande antigener. 13 Platelia Candida Ab Plus (kat.nr 62785) är ett test som, när det används i kombination med Platelia Candida Ag Plus (kat.nr 62784), ger en möjlighet att ställa en tidig diagnos och förbättrar känsligheten i diagnosen, detta som en del av ett totalt diagnostiskt tillvägagångssätt som integrerar klinisk och mykologisk data samt utvärdering av verkliga och iatrogena riskfaktorer. 10, 13, 14 Kombinationen av test är också en väsentlig del av ett biokliniskt system för patientövervakning som underlättar beslut rörande behandling. 8 3- KLINISK RELEVANS Candida-infektioner är den vanligaste formen av nosokomiala svampinfektioner. Candidemier utgör den fjärde största orsaken 12, 15 16 för nosokomial sepsis. Kliniskt utgör invasiva Candida-infektioner de allvarligaste infektionerna med en dödlighet på mellan 30 och 70 % hos personer med nedsatt immunförsvar. Candida-infektioner är fortfarande svåra att diagnostisera på grund av den dåliga specificiteten i kliniska symtom och odlingarnas låga känslighet. Vanligtvis är det en kombination av data som leder till att diagnosen invasiv candidainfektion ställs och att lämplig behandling kan påbörjas. 2 I detta sammanhang måste diagnosen systemisk candidainfektion alltid innefatta serologiska samt direkta mykologiska metoder. Serologisk övervakning av anti-candida-antikroppar vägleder eller bekräftar den kliniska diagnosen och 10, 13, 14 utgör ett komplement till mykologiska resultat. Platelia Candida Ab Plus detekterar antikroppar mot Candida-mannan-antigenen, den huvudsakliga beståndsdelen i cellväggarna hos jästsvampar som hör till Candida-genuset. Mannan, en markör för candidainfektionen, är en mycket immunogen polysackarid. Regelbunden övervakning av patienter med risk för invasiva Candida-infektioner genom en kombination av detektion av mannan-antigenen och anti-mannan-antikroppar utgör ett stöd för diagnosen av dessa infektioner. 9 4- TESTPRINCIP Platelia Candida Ab Plus är en indirekt immunoenzymatisk mikroplattsanalys i två steg för detektion av antimannanantikroppar i humant serum eller plasma. De spädda serum- eller plasmaproverna tillsätts i brunnarna som är belagda med Candida albicans-renad mannan. Efter inkubering vid 37 C tvättas remsorna för att avlägsna allt obundet material. Sedan tillsätts konjugatet (polyklonal anti-human IgG/IgA/IgM-antikropp från get märkt med peroxidas) i varje brunn och inkuberas vid 37 C. Vid förekomst av anti-mannan-antikroppar i patientprovet bildas ett komplex: mannan human anti-mannan Ig anti-human lgg/iga/igm-antikropp (get) /peroxidas. Remsorna tvättas för att avlägsna allt obundet material. Tillsatsen av kromogent substrat som innehåller peroxidas och inkubering i rumstemperatur påvisar de eventuellt bildade komplexen bundna till mikroplattans brunn. Den enzymatiska reaktionen stoppas när 1-N svavelsyra tillsätts. Absorbansen (optisk densitet) i prover från människa och kalibrator fastställs med en spektrofotometer som är inställd på våglängden 450/620 nm. 5- REAGENSER Reagenserna räcker till 96 test i högst 9 satser. Förvara reagenserna vid +2-8 C. Låt alla reagenser uppnå rumstemperatur (+18-30 C) före användning. Förvara reagenserna vid +2-8 C igen direkt efter användningen. Lägg tillbaka alla oanvända remsor/plattor i påsen och förslut den väl. Ta inte bort torkmedlet. 1

R1 R2 Komponent Innehåll Mängd Microplate Concentrated Washing Solution (20x) R3 Calibrator 0 R4a Calibrator 5 R4b Calibrator 10 R4c Calibrator 20 R4d Calibrator 80 R6 R7a R7b R9 Conjugate Sample Diluent 1 Sample Diluent 2 Chromogen TMB Mikrobrunnsremsplatta: - 96 brunnar (12 remsor med 8 brunnar var) belagda med renad mannan från Candida albicans. Koncentrerad tvättlösning (20 x): (ph 7,4) - 2%Tween 20 - Konserveringsmedel: <1,5% ProClin 300 Kalibrator 0 AU/ml (färdig att använda): - Konserveringsmedel: metylisotiazolon 0,02%, bromonitrodioxan 0,02%, < 1,5% ProClin 300 Kalibrator 5 AU/ml (färdig att använda):, - Humant serum innehållande anti-mannan-antikropp - Konserveringsmedel: metylisotiazolon 0,02%, bromonitrodioxan 0,02%, < 1,5% ProClin 300 Kalibrator 10 AU/ml (färdig att använda): - Humant serum innehållande anti-mannan-antikropp - Konserveringsmedel: metylisotiazolon 0,02%, bromonitrodioxan 0,02%, < 1,5% ProClin 300 Kalibrator 20 AU/ml (färdig att använda): - Humant serum innehållande anti-mannan-antikropp - Konserveringsmedel: metylisotiazolon 0,02%, bromonitrodioxan 0,02%, < 1,5% ProClin 300 Kalibrator 80 AU/ml (färdig att använda): - Humant serum innehållande anti-mannan-antikropp - Konserveringsmedel: metylisotiazolon 0,02%, bromonitrodioxan 0,02%, < 1,5% ProClin 300 Konjugat (färdig att använda): - Polyklonal antihuman total lg-antikropp från get, peroxidasmärkt - Malakitgrönt - Konserveringsmedel: <1,5% ProClin 300 Provspädningsvätska 1 (färdig att använda): - 0,1% Tween 20 - Fenolrött - Konserveringsmedel: <1,5% ProClin 300 Provspädningsvätska 2 (färdig att använda): - 0,1% Tween 20, - Bromtymolblått - Konserveringsmedel: <1,5% ProClin 300 Kromogen TMB-lösning (färdig att använda): - Lösning av 3,3,5,5 -tetrametylbensidin (< 0,1%), H 2 O 2 (<1,0%) 1 1 x 70 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 26 ml 1 x 28 ml 1 x 26 ml 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Stopplösning (färdig att använda): - 1 N svavelsyra 1 x 28 ml Självhäftande folie 4 6- HÄLSO- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR 1. Endast för in vitro-diagnostisk användning. 2. Endast för professionellt bruk. 3. Vi rekommenderar inte att detta testkit används för andra prover än humant serum eller plasma. 4. Det humana materialet som använts vid beredningen av kalibratorerna R4a, R4b, R4c, och R4d har testats med CE-märkta test och befunnits vara negativt för anti-hiv-1-, anti-hiv-2- och anti-hcv-antikroppar samt HBs-antigen. Trots detta ska alla reagenserna hanteras som potentiellt smittsamma. Alla tester ska utföras med de försiktighetsåtgärder som rekommenderas enligt OSHA-normen för blodburna patogener, biosäkerhetsnivå 2 eller i enlighet med andra lämpliga biosäkerhetsmetoder. 2

5. Använd skyddskläder inklusive labbrock, ögon- och ansiktsskydd och engångshandskar (handskar i syntetiskt material utan latex rekommenderas) och hantera reagenser och patientprover i enlighet med god laboratoriesed (GLP). Tvätta händerna noggrant efter ett test. 6. Pipettera inte med munnen. 7. Rök, drick och ät inte i områden där prover eller reagenser hanteras. 8. Undvik stänk från prover och lösningar. 9. Biologiskt spill som inte innehåller syra ska torkas upp noggrant med ett effektivt desinfektionsmedel. Desinfektionsmedel som kan användas är (men är inte begränsade till) en lösning av 10 % blekmedel (0,5 % lösning natriumhypoklorit), 70 % etanol eller 0,5 % Wescodyne Plus. Material som används för att torka upp spill kan behöva hanteras som miljöfarligt avfall. VARNING: Placera inte lösningar som innehåller blekmedel i autoklaven. 10. Spill som innehåller syra ska absorberas (torkas upp) eller neutraliseras med natriumbikarbonat och området bör sköljas och torkas. I de fall där spillet innehåller miljöfarliga material bör området tvättas med ett kemiskt desinfektionsmedel. 11. Kassera alla prover och allt material som använts i testet som potentiellt smittsamma. Kemiskt och miljöfarligt avfall ska hanteras enligt alla gällande regler för avfallshantering. 12. VARNING: Nedan följer en lista över potentiella kemiska risker som vissa komponenter i kitet kan ge upphov till (se avsnitt 5 Reagenser) Xi - Irriterande Vissa reagenser innehåller ProClin 300 < 1,5%: R43: Kan ge allergi vid hudkontakt. S23-24-37-60: Undvik inandning av ångor/dimma. Undvik kontakt med huden. Använd lämpliga skyddshandskar. Detta material och dess behållare skall tas om hand som farligt avfall. 13. Säkerhetsdatabladet kan fås på begäran. 7- FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER VID ANVÄNDNING 1. FRYSTA SERUM- ELLER PLASMAPROVER SOM FÖRVARAS UNDER OKÄNDA FÖRHÅLLANDEN KAN GE FELAKTIGT POSITIVA RESULTAT PÅ GRUND AV ATT DE SMITTATS MED SVAMP OCH/ELLER BAKTERIER. 2. Använd inte testet eller någon av reagenserna efter sista förbrukningsdatum. 3. Reagenser från testkit med olika satsnummer får inte blandas, med undantag för: OBS: Tvättlösningen (R2, märkning* 20x grönfärgad), kromogen (R9, märkning* TMB turkosfärgad) och stopplösningen (R10, märkning* 1 N rödfärgad), under förutsättning att reagenserna som används är helt likvärdiga och kommer från en och samma sats inom en bestämd serie. OBS: Tvättlösning (R2, märkning* 20x grönfärgad) får inte blandas med tvättlösning (R2, märkning* 10x blåfärgad) från Bio-Rads reagenskit. * på flaskans etikett 4. Se till att alla reagenser har rumstemperatur (+18-30 C) i minst 30 minuter före användning. 5. Använd helst engångsmaterial. Då detta inte är möjligt, använd glasvaror som är perfekt tvättade och sköljda med destillerat vatten. 6. Kontrollera noggrannheten för pipetterna och all annan utrustning, samt att all utrustning fungerar korrekt. 7. Rekonstituera eller späd reagensen R2 noggrant för att undvika kontaminering. 8. Den enzymatiska reaktionen är mycket känslig för metaller och metalljoner. Ingen metall får komma i kontakt med konjugateller substratlösningen. 9. Använd separata pipettspetsar vid pipettering av kontroller och patientprover för att undvika kontaminering. 10. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda för att brunnarna ska vara tvättade på rätt sätt. Tvättningen måste utföras med mikroplattstvättanordning. 11. Se till att mikroplattan inte hinner torka efter tvättproceduren innan reagenser har hällts i. 12. Använd inte samma behållare för konjugat- och substratlösning. 13. Undvik att utsätta kromogen TMB-lösning för starkt ljus vid förvaring och inkubation. Låt inte kromogenlösningen komma i kontakt med oxiderande medel. 14. Kromogenlösningen (R9) måste vara färglös. Om lösningen blir blå tyder det på att reagensen inte kan användas utan måste kastas. 15. Undvik all kontakt mellan stopplösningen och oxiderande medel, metall eller metalljoner. 16. Häll inte tillbaka oanvänt konjugat i originalbehållaren. 8- BEREDNING OCH FÖRVARING AV REAGENS Mikrobrunnsremsplatta (R1) Varje platthållare innehållande 12 remsor är förpackad i en påse. Klipp upp påsen under förseglingen med en sax. Öppna påsen och ta ut platthållaren. Lägg tillbaka platthållaren med oanvända remsor i originalförpackningen. Återslut påsen ordentligt och förvara vid +2-8 C. När den vakuumförpackade påsen har öppnats är mikrobrunnsremsorna hållbara i 8 veckor vid förvaring i +2-8 C i den tättförslutna originalpåsen i närvaro av torkmedel. 3

Tvättlösning (R2) Bered arbetstvättlösning genom att späda den koncentrerade tvättlösningen 20 gånger med destillerat vatten: 50 ml R2 i 950 ml destillerat vatten. (Använd 650 ml arbetstvättlösning för en hel platta med 12 remsor, icke räknat dödvolymen för utrustningen som används). Efter spädning kan arbetstvättlösningen förvaras i 14 dagar vid +2-8 C. När den koncentrerade tvättlösningen har öppnats och förvaras vid +2-30 C är den hållbar till det sista förbrukningsdatumet på etiketten, om den inte kontamineras. Kalibrator 0 (R3), Kalibrator 5 (R4a), Kalibrator 10 (R4b), Kalibrator 20 (R4c), Kalibrator 80 (R4d): Kalibratorerna är färdiga för användning. Efter att de har öppnats är dessa reagenser hållbara i 8 veckor, om de förvaras i +2-8 C utan att kontamineras. Konjugat (R6), Provspädningsvätska 1 (R7a), Provspädningsvätska 2 (R7b), Kromogen TMB-lösning (R9): Dessa reagenser är färdiga för användning. Efter att de har öppnats är dessa reagenser hållbara i 8 veckor, om de förvaras i +2-8 C utan att kontamineras. Stopplösning (R10): Denna reagens är färdigt för användning. Efter att den har öppnats är denna reagens hållbar till det sista förbrukningsdatumet på etiketten, om den inte kontamineras. 9- PROVER 1. Testen utförs på prover av serum eller plasma insamlat med antikoagulantia såsom EDTA, heparin eller citrat. 2. Följ följande riktlinjer för hantering, bearbetning och lagring av blodprov: - Ta blodprov enligt gällande laboratorierutiner. - Tillåt serumprover att koagulera fullständigt innan centrifugering. - Se till att rören alltid är stängda. - Separera serumet eller plasman efter centrifugering och förvara i ett slutet provrör. - Proverna kan förvaras vid +2-8 C om testet utförs inom 4 dagar. - Om testet inte utförs inom 4 dagar ska proverna frysas vid -20 C (eller -80 C). - Serum- och plasmaprover kan frysas/tinas maximalt 3 gånger. Proverna ska blandas ordentligt efter upptining och innan testet utförs. 3. Resultaten påverkas inte av prover som innehåller 60 g/l humant albumin eller 120 g/l totala proteiner eller 200 mg/l okonjugerad bilirubin eller 200 mg/l konjugerad bilirubin, lipemiska prover som innehåller motsvarande 30 g/l triolein (triglycerid) eller 5 g/l kolesterol eller hemolyserade prover som innehåller 2 g/l hemoglobin. 4. Värm inte på proverna. 10- METOD Material som ingår Se avsnitt 5-REAGENSER. Nödvändigt men ej bifogat material 1. Sterilt destillerat eller avjoniserat vatten för spädning av koncentrerad tvättlösning. 2. Absorberande papper. 3. Engångshandskar. 4. Skyddsglasögon. 5. Natriumhypoklorit (blekmedel) och natriumbikarbonat. 6. Automatiska eller halvautomatiska, justerbara eller förinställda, pipetter eller multipipetter för mätning och fördelning av 10 μl till 1 000 μl samt 1 ml, 2 ml och 10 ml. 7. Graderade provrör för 25 ml, 50 ml, 100 ml och 1 000 ml. 8. Engångsprovrör. 9. Behållare för miljöfarligt avfall. 10. Vortexblandare. 11. Mikroplattsinkubator termostatiskt inställbar på 37 ± 1 C(*). 12. Automatisk eller halvautomatisk tvättanordning för mikroplattor(*). 13. Avläsare för mikroplattor med 450 nm och 620 nm filter(*). (*) Kontakta oss för detaljerad information om utrustning som rekommenderats av vår tekniska tjänst. EIA-metod Följ anvisningarna noga. Tillämpa god laboratoriesed. Se till att alla reagenser har rumstemperatur (18-30 C) i minst 30 minuter före användning. Använd alla kalibratorer vid varje serie för att validera testresultatet. 4

Gör på följande sätt: 1. Förbered ett diagram för tillsättning och identifiering av kalibratorer och prover. 2. Gör en förspädning av proverna som ska testas till 1:20, dvs. 10 μl serum eller plasma + 190 μl provspädningsvätska 1 (R7a). Förspädningen av provet ger upphov till en mörkröd färg. 3. Ta ut platthållaren och mikrobrunnsremsorna (R1) ur påsen. Lägg tillbaka remsor som inte ska användas i originalpåsen och förslut påsen väl. 4. Tillsätt 190 μl provspädningsvätska 2 (R7b) i brunnarna som ska användas för de prover som ska testas, och häll sedan i 10 μl av proven som förspätts till 1:20, blanda försiktigt med återuppsugning 2 eller 3 gånger. OBS: Tillsättningen av proven kan i detta skede kontrolleras då det efter tillsättning av 10 μl förspädd provspädningsvätska uppstår en brun färg i de brunnar som innehåller prov. Brunnarna som inte innehåller prov är grönfärgade. 5. Fördela 200 μl per brunn av kalibratorerna, som är färdiga för användning, i enlighet med följande schema: - A1: Kalibrator 0 AU/ml (R3) - B1: Kalibrator 5 AU/ml (R4a) - C1: Kalibrator 10 AU/ml (R4b) - D1: Kalibrator 20 AU/ml (R4c) - E1: Kalibrator 80 AU/ml (R4d) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S4 S12 B R4a S5 C R4b S6 D R4c S7 E R4d S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Täck mikroplattan med självhäftande folie, tryck sen stadigt för att försäkra att förslutningen är tät. 7. Inkubera omedelbart mikroplattan i en torr mikroplattsinkubator i 60 ± 5 minuter vid 37 C (±1 C). 8. Bered arbetstvättlösningen (se avsnitt 8). 9. Ta bort den självhäftande folien. Aspirera innehållet i alla brunnar i en avfallsbehållare för miljöfarligt avfall (som innehåller natriumhypoklorit). 10. Tvätta mikroplattan 4 gånger i en mikroplattstvättanordning med 800 μl utspädd tvättlösning. Efter den sista tvättningen ska mikroplattan vändas upp och ner och slås med lätta slag mot det absorberande papperet för att få bort resterande vätska. 11. Blanda innehållet i konjugatflaskan (R6) genom att vända den upp och ner före användning. Med tanke på att en multikanalspipett ska användas, ta endast den volym som krävs för att utföra serien, dvs. 3,5 ml för två remsor med 8 brunnar. 12. Tillsätt 200 µl konjugat (R6) i varje brunn. 13. Täck mikroplattan med självhäftande folie, tryck sen stadigt för att försäkra att förslutningen är tät. 14. Inkubera omedelbart mikroplattan i en torr mikroplattsinkubator i 60 ± 5 minuter vid 37 C (±1 C). 15. Ta bort den självhäftande folien. Aspirera innehållet i alla brunnar i en avfallsbehållare för miljöfarligt avfall (som innehåller natriumhypoklorit). 16. Tvätta mikroplattan 4 gånger i en mikroplattstvättanordning med 800 μl utspädd tvättlösning. Efter den sista tvättningen ska mikroplattan vändas upp och ner och slås med lätta slag mot det absorberande papperet för att få bort resterande vätska. 17. Tillsätt snabbt 200 µl kromogen TMB-lösning (R9) i varje brunn, undvik starkt ljus. 18. Inkubera mikroplattan i mörker i rumstemperatur (+18-30 C) i 30 ±5 minuter. Använd inte självhäftande folie i detta inkuberingssteg. 19. Tillsätt 100 µi stopplösning (R10) i varje brunn. Använd samma ordningsföljd och samma fördelningshastighet för fördelning som för kromogenlösningen. Blanda väl. 20. Torka noga av botten på varje platta. 21. Läs av den optiska densiteten i varje brunn vid 450 nm (referensfilter med 620 nm). Mikroplattorna måste läsas av inom 30 minuter efter att stopplösning tillsatts (remsorna måste alltid förvaras skyddade för ljus före avläsning). 22. Se till att det finns en korrelation mellan avläsningen och plattschemat innan resultaten noteras. 11- KVALITETSKONTROLL (VALIDERINGSKRITERIER) Använd kalibratorer på varje mikroplatta i varje test. Följande kriterier måste uppfyllas för att validera testproceduren: Värde för optisk densitet: OD R4a > 0,160 Kvoter: OD R4a /OD R3 > 6,00 OD R4b / OD R4a > 1,20 OD R4c / OD R4b > 1,20 OD R4d / OD R4c > 1,20 5

12- UTVÄRDERING AV RESULTATEN Fastställande av kalibreringskurvan Kalibreringskurvan ritas med 5 intervallpunkter (kalibratorer) 0, 5, 10, 20 och 80 AU/ml. Rita kalibreringskurvan [OD = funktion (AU/ml)] genom att på den vertikala axeln (Y-axeln) markera OD från kalibratorerna R3, R4a, R4b, R4c och R4d och sedan markera på den horisontella axeln (x-axeln) deras respektive koncentration i AU/ml. Försök att uppnå en kurva som sammanbinder de olika intervallpunkterna. Bestämning av koncentrationen av anti-mannan-antikroppar (AU/ml) i testproverna Kalibreringskurvan kan användas för att bestämma koncentrationen av anti-mannan-antikroppar, uttryckt i AU/ml, för varje testprov. Utvärdering av resultaten Prover med en koncentration av anti-mannan-antikroppar som är mindre än 5 AU/ml (C < 5) betraktas som "negativa" med avseende på förekomst av anti-mannan-antikroppar. Prover med en koncentration av anti-mannan-antikroppar som ligger mellan 5 och 10 AU/ml (5 C < 10) betraktas som "medelhöga" med avseende på förekomst av anti-mannan-antikroppar. Prover med en koncentration av anti-mannan-antikroppar som är större än eller lika med 10 AU/ml (C 10) betraktas som "positiva" med avseende på förekomst av anti-mannan-antikroppar. Kalibratorerna som användes för att rita kalibreringskurvan medger inte exakt bestämning av koncentrationer som är större än 80 AU/ml. Testet måste göras en gång till när serumet eller plasman har spätts till 1:10 i provspädningsvätska 1 (R7a). Efter denna första förspädning, följ instruktionerna i avsnitt 10 (förspädning till 1:20 med R7a och därefter spädning till 1:20 med R7b). Koncentrationen i det mycket positiva provet fås därefter genom att multiplicera koncentrationen som uppnås i detta test med 10. Ett medelhögt resultat kan bekräftas på ett nytt patientprov som tas inom några veckor efter det prov som gett upphov till den medelhöga koncentrationen. 13- TESTETS BEGRÄNSNINGAR 1. Ett negativt test utesluter inte förekomsten av invasiv candidainfektion. Det är svårt att avgöra om antikroppar inte finns hos patienter med nedsatt immunförsvar. Diagnosen invasiv candidainfektion kan endast ställas efter att hänsyn har tagits till kliniska, terapeutiska, radiologiska, cytologiska, direkt mykologiska och serologiska argument, där varje enskild komponent bör tolkas med försiktighet. 2. Ett negativt test för anti-mannan-antikroppar kan även utvärderas mot bakgrund av resultaten av mannan-antigentester. Även om invasiv candidainfektion finns är antigenen svårare att upptäcka hos patienter som testats positiva för antimannan-antikroppar (se avsnitt 15-Prestanda). 3. Detektionsprestandan av anti-mannan-antikroppen i serum eller plasma beror på hur många test som utförts på patienterna. Regelbunden övervakning av högriskpatienter och screening med avseende på mannan-antigenen rekommenderas för att öka testets känslighet och för att nå en tidig positiv reaktion. 4. Proceduren för Platelia Candida Ab Plus och utvärderingen av resultaten måste följas när proverna analyseras med avseende på förekomst av anti-mannan-antikroppar. Användaren av detta test rekommenderas att läsa den medföljande instruktionen noga innan testet genomförs. Testanvisningarna måste följas mycket noga, i synnerhet när det gäller pipettering av prover och reagenser, tvättning av plattor och tider vid inkubation. 5. Om anvisningarna inte följs vid tillsättning av prover eller reagenser kan det resultera i ett falskt negativt testresultat. Ytterligare prov från samma patient måste testas om det finns klinisk misstanke om invasiv candidainfektion eller i fall av felaktig testning. 6. Kontaminering av negativa patientprovbrunnar från brunnar med positiv kontroll/patientprover är möjlig om innehållet i en brunn kommer över till en annan brunn på grund av oförsiktig hantering av mikroplattan eller dålig pipetteringsteknik när reagenser tillsätts. 7. Prestandan av Platelia Candida Ab Plus har inte utvärderats på serum- eller plasmaprover från neonatala eller pediatriska patienter. 8. Prestandan av Platelia Candida Ab Plus har inte utvärderats för en manuell avläsning och/eller visuell bestämning av resultaten. 9. Falskt positiva resultat har observerats när proverna innehållit halter av humant gammaglobulin 60 g/l samt för vissa prover som testats positiva med avseende på reumatoid faktor, på anti-ds-dna eller för förekomst av anti-aspergillus IgG. 14- FÖRVÄNTADE VÄRDEN Prevalensen av antikroppar som riktas mot specifika Candida mannan-antigenen mätt med testet Platelia Candida Ab Plus har utvärderats på en panel av 613 prover från 51 holländska patienter (Plats 1 Nederländerna) som lagts in på sjukhus för intensiv cellgiftsbehandling av cancer (hematologiska maligniteter hos 49 patienter och icke-hematologisk cancer hos 2 patienter). Utav 613 prover var 114 positiva och 136 medelhöga, dvs. en prevalens på 114/613 = 18,6 % [KI 95 %: 15,6-21,9 %] om de medelhöga resultaten anses negativa, och 250/613 = 40,8 % [KI 95 %: 36,9-44,8 %] om de medelhöga resultaten anses positiva. Avseende patienterna, utav 51 testade, har 14 påvisat minst ett positivt prov och 20 påvisat minst ett medelhögt prov utan något positivt prov, dvs. en prevalens på 14/51 = 27,5 % [KI 95 %: 15,9-41,7 %] om de medelhöga resultaten betraktas som negativa och 34/51 = 66,7 % [KI 95 %: 52,1-79,2 %] om de medelhöga resultaten betraktas som positiva. 6

Utav dessa 51 patienter, har 30 (388 prover) inte påvisat någon dokumenterad invasiv candidainfektion. Utav dessa har 20 koloniserats av jäst (12 av Candida albicans, 7 av Candida albicans förenad med en annan art av Candida och 1 koloniserats av åtminstone en art av Candida non albicans). Fyra av dessa patienter uppvisade kliniska symtom och en ytlig candidainfektion som påvisades mikrobiologiskt. Allvarliga slemhinneskador sågs hos 24 av patienterna. Utav de 388 proverna har 53 visat sig vara positiva och 95 medelhöga, dvs. en prevalens på 53/388 = 13,7 % [KI 95 %: 10,4-17,5 %] om de medelhöga resultaten anses negativa och 148/388 = 38,1 % [KI 95 %: 33,3-43,2 %] om de medelhöga resultaten anses positiva. Med avseende på patienterna, utav 30 test, har 7 innehållit minst ett positivt prov och 12 innehållit minst ett medelhögt men utan något positivt resultat, dvs. en prevalens på 7/30 = 23,3 % [KI 95 %: 9,9-42,3 %] om de medelhöga resultaten anses negativa och 19/30 = 63,3 % [KI 95 %: 43,9-80,1 %] om de medelhöga resultaten anses positiva. 15- PRESTANDA A. Reproducerbarhetsstudier Variabilitet inom testet (repeterbarhet): För att utvärdera repeterbarheten inom testet, har 1 negativt prov och 5 positiva prover testats 32 gånger i en och samma serie. Koncentrationen i AU/ml bestämdes för varje prov. Medelkoncentrationen, standardavvikelsen (SD) och variationskoefficienten (CV%) för varje prov anges i tabellen nedan: Variabilitet inom testet (repeterbarhet) N=32 Negativt prov positivt prov Nr. 1 positivt prov Nr. 2 positivt prov Nr. 3 Medelhögt positivt prov Mycket positivt prov Medelkoncentration (AU/ml) 3,14 7,91 10,17 10,06 38,42 67,62 SD 0,123 0,547 0,424 0,464 3,836 4,070 CV% 3,9% 6,9% 4,2% 4,6% 10,0% 6,0% Variabilitet mellan tester (reproducerbarhet): För att utvärdera reproducerbarheten mellan tester har sex prover (ett negativt och fem positiva) testats två gånger var, i två serier per dag, under en period av totalt 20 dagar. Koncentrationen i AU/ml har bestämts för varje prov. Medelkoncentrationen, standardavvikelsen (SD) och variationskoefficienten (CV%) för varje prov anges i tabellen nedan: Variabilitet mellan tester (reproducerbarhet) N=80 Negativt prov Medelhögt Mycket positivt prov positivt prov positivt prov positivt prov positivt prov Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Medelkoncentration (AU/ml) 3,54 8,16 11,51 11,42 31,54 62,58 SD 0,332 0,814 1,481 1,452 6,55 7,162 CV% 9,4% 10,0% 12,9% 12,7% 20,8% 11,4% B. Korsreaktioner Patologi Antal testade prover Antal positiva resultat Antal medelhöga resultat Antal positiva resultat bekräftade på kommersiellt test Antal medelhöga resultat bekräftade på kommersiellt test Anti-Aspergillusantikroppar 110 12 30 9/12 12/30 Anti-ds-DNA-antikroppar 10 2 2 0/2 0/2 Positiva ANA 10 0 1 NA 0/1 Myelom IgG/IgM 20 0 0 NA NA Anti-Toxoplasma IgG 10 1 1 0/1 1/1 Humana anti-musantikroppar 12 1 1 0/1 0/1 Reumatoid faktor 31 5 4 4/5 1/4 Proverna som testats positiva eller medelhöga med Platelia Candida Ab Plus testades därefter med ett konkurrerande kommersiellt test för detektion av anti-candida-antikroppar (bestående av ett test för detektion av anti-candida IgG och ett för detektion av anti-candida IgM). C. Linearitet Lineariteten av testet Platelia Candida Ab Plus har upprättats mellan 2 och 78 AU/ml från spädningsundersökningar som gjorts på 5 positiva prov. 7

D. Kliniska studier Prestandan av testet Platelia Candida Ab Plus har utvärderats på 3 platser med totalt 836 prover från 489 patienter. KÄNSLIGHET Känsligheten för testet Platelia Candida Ab Plus har utvärderats på en panel av 436 prover från 89 patienter från 2 sjukhus i Nederländerna och i Frankrike. Fördelningen av proverna är den följande: Plats 1 (Nederländerna): 225 prover från 21 holländska patienter inlagda på en onko-hematologisk avdelning för intensiv cellgiftsbehandling av hematologiska maligniteter (19 fall) eller icke-hematologisk cancer (2 fall) eventuellt följt av transplantation av hematopoetiska stamceller. Alla patienterna hade en invasiv candidainfektion som påvisades mikrobiologiskt med minst en positiv odling med avseende på Candida (blododling eller odling av vanligtvis sterilt vävnadsprov). 17 Plats 2 (Frankrike): 211 prover från 68 franska patienter inlagda på olika intensivvårdsavdelningar eller onko-hematologiska avdelningar och med invasiv candidainfektion som påvisats mikrobiologiskt med minst en positiv odling med avseende på Candida spp. OBS: Panelerna med prover som använts för dessa två studier kom från patienter vars blodprov tagits mellan 1999 och 2007. Den relativa stabiliteten av mannan-antigenen och anti-mannan-antikroppen i dessa prov under frystiden, samt efter varje frysning/upptining, gör att de presenterade resultaten är beroende av konserveringstillståndet av den testade panelen. Känslighetsvärdena som bestämts inom ramen för retrospektiva kliniska studier kan därför vara lägre än de som uppnåtts vid prospektiva kliniska studier som utförts på nyligen tagna prover. Resultat från Plats 1 De 21 nederländska patienterna i denna studie var inlagda på sjukhus för intensiv cellgiftsbehandling av hematologiska maligniteter (akut myeloisk leukemi, akut lymfatisk leukemi, kronisk lymfatisk leukemi, myelom, myelodysplastiskt syndrom, aplastisk anemi, eller non-hodgkins lymfom) eller icke-hematologisk cancer, eventuellt följt av transplantation av hematopoetiska stamceller. 17 Dessa 21 patienter utvecklade en invasiv candidainfektion som kunde påvisas mikrobiologiskt med minst en positiv odling av Candida spp. (blododling eller odling av vanligtvis sterilt vävnadsprov). Statusen för dessa patienter, avseende närvaron av antikroppar mot den specifika mannan-antigenen för Candida, som detekteras med testet Platelia Candida Ab Plus, anses som positivt när minst ett av patientproverna är positivt. I avsaknad av positivt prov anses statusen vara medelhög om minst ett patientprov är medelhögt, eller negativ om alla patientproven är negativa. 17 Patientkategori 21 patienter (225 prover) som visar minst en positiv odling av Candida spp. Resultat från Platelia Candida Ab Plus Antal patienter (antal prover) Känslighet Positiv Medelhög Negativ resultat anses negativa) 7 (61) 8 (41) 6 (123) 33,3 % [14,6-57,0%] Känslighet resultat anses positiva) 71,4 % [47,8-88,7%] Parallellt med testet Platelia Candida Ab Plus har dessa prover också testats för närvaro av den specifika mannan-antigenen för Candida, med testet Platelia Candida Ag Plus 9. Statusen för patienten för närvaro av denna specifika mannan-antigenen eller Candida anti-mannan antikroppar anses som positiv om minst ett av de två testerna är positiv. I avsaknad av ett positivt test anses statusen som medelhög om minst ett av de två proverna är medelhöga eller som negativ om de två proverna är negativa. Patientkategori 21 patienter (225 prover) som visar minst en positiv odling av Candida spp. Kombination av resultat från Platelia Candida Ab Plus och Platelia TM Candida Ag Plus Antal patienter (antal prover) Känslighet Känslighet Positiv Medelhög Negativ resultat anses resultat anses negativa) positiva) 15 (98) 4 (34) 2 (93) 71,4 % [47,8-90,5%] 90,5 % [69,9-98,8%] Resultat från Plats 2 De 68 franska patienterna som ingår i denna studie var inlagda på olika intensivvårdsavdelningar (kirurgi, transplantation, brännskador, trauma, lungvård, m.m.) eller onko-hematologiska avdelningar (hematologiska maligniteter). Alla utvecklade en invasiv candidainfektion som kunde påvisas mikrobiologiskt med minst en positiv blododling av Candida (albicans, parapsilosis, norvegensis, glabrata, krusei eller tropicalis) 6, 7, 14 dagarna före eller efter att det studerade blodprovet tagits. Blodproven togs i genomsnitt 6 dagar efter det första blodprovet med positivt resultat av Candida, (som minst 61 dagar innan, som mest 67 dagar efter). Statusen för dessa patienter, avseende närvaron av antikroppar mot den specifika mannan antigenen för Candida, som detekteras med testet Platelia Candida Ab Plus, anses som positivt när minst ett av patientproverna är positivt. I avsaknad av positivt prov anses statusen vara medelhög om minst ett patientprov är medelhögt, eller negativ om alla patientproven är negativa. 8

Patientkategori 68 patienter (211 prover) som visar minst en positiv blododling av Candida spp. Resultat från Platelia Candida Ab Plus Antal patienter (antal prover) Känslighet Positiv Medelhög Negativ resultat anses negativa) 30 (71) 13 (51) 25 (89) - varav 34 av C. albicans (113 prover) 17 (45) 6 (31) 11 (37) - varav 15 av C. parapsilosis (37 prover) 4 (5) 6 (15) 5 (17) - varav 12 av C. glabrata (32 prover) 7 (15) 1 (4) 4 (13) 44,1% [32,1-56,7%] 50,0% [32,4-67,6%] 26,7% [7,8-55,1%] 58,3% [27,7-84,8%] Känslighet resultat anses positiva) 63,2% [50,7-74,6%] 67,6% [49,5-82,6%] 66,7% [38,4-88,2%] 66,7% [34,9-90,1%] - varav 4 av C. tropicalis (19 prover) 2 (6) 0 (1) 2 (12) 50,0% * 50,0% * - varav 2 av C. krusei (8 prover) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0% * 0,0% * - varav 1 av C. norvegensis (2 prover) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0% * 0,0% * *: Konfidensintervallet på 95 % har inte kunnat beräknas på grund av ett för litet antal prover. Parallellt med testet Platelia Candida Ab Plus har dessa prover också testats för närvaro av den specifika mannan antigenen för Candida, med testet Platelia Candida Ag Plus 9. Statusen för patienten för närvaro av denna specifika mannan-antigen eller Candida anti-mannan-antikroppar anses som positiv om minst ett av de två testerna är positiv. I avsaknad av ett positivt test anses statusen som medelhög om minst ett av de två proverna är medelhöga eller som negativ om de två proverna är negativa. 17 Patientkategori 68 patienter (211 prover) som visar minst en positiv blododling av Candida spp. Kombination av resultat från Platelia Candida Ab Plus och Platelia TM Candida Ag Plus Antal patienter (antal prover) Känslighet Känslighet Positiv Medelhög Negativ resultat anses resultat anses negativa) positiva) 48 (122) 8 (40) 12 (49) - varav 34 av C. albicans (113 prover) 28 (74) 2 (22) 4 (17) - varav 15 av C. parapsilosis (37 prover) 5 (7) 6 (15) 4 (15) - varav 12 av C. glabrata (32 prover) 11 (24) 0 (3) 1 (5) 70,6% [58,3-81,0%] 82,4% [65,5-93,2%] 33,3% [11,8-61,6%] 91,7% [61,5-99,8%] 82,4% [71,2-90,5%] 88,2% [72,6-96,7%] 73,3% [44,9-92,2%] 91,7% [61,5-99,8%] - varav 4 av C. tropicalis (19 prover) 4 (17) 0 (0) 0 (2) 100,0% * 100,0% * - varav 2 av C. krusei (8 prover) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0% * 0,0% * - varav 1 av C. norvegensis (2 prover) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0% * 0,0% * *: Konfidensintervallet på 95 % har inte kunnat beräknas på grund av ett för litet antal prover. SPECIFICITET Specificiteten har bestämts på en panel av 400 prover från 2 platser i Frankrike med följande fördelning: Plats 1: 200 prover från 200 franska patienter som kontrolleras för toxoplasmos under graviditet och inte visar några kliniska symptom på infektion med Candida. Plats 2: 200 prover från 200 franska blodgivare. 9

Patientkategori 200 gravida kvinnor (200 prover) som kontrolleras för toxoplasmos Resultat från Platelia Candida Ab Plus Antal patienter (antal prover) Specificitet Positiv Medelhög Negativ resultat anses positiva) 9 35 156 200 blodgivare (200 prover) 8 28 164 78,0 % [71,6-83,5%] 82,0 % [76,0-87,1%] Specificitet resultat anses negativa) 95,5 % [91,6-97,9%] 96,0 % [92,3-98,3%] 16- TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL Alla tillverkade och marknadsförda produkter från företaget Bio-Rad kontrolleras i enlighet med ett kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till den slutliga marknadsföringen av produkten. Varje sats genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om den överensstämmer med fördefinierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion och kontroll av varje enskild sats sparas hos Bio-Rad. 17- REFERENSER 1- Alam, F.F., Mustafa, A.S., Khan, Z.U. 2007. Comparative evaluation of (1,3)-beta-D-glucan, mannan and anti-mannan antibodies, and Candidaspecies-specific snpcr in patients with candidemia. BMC Infectious Diseases 7(103):p. 1-9. 2- Ascioglu, S., Rex, J.H., de Pauw, B., Bennett, J.E., Bille, J., Crokaert, F., Denning, D.W., Donnelly, J.P., Edwards, J.E., Erjavec, Z., Fiere, D., Lortholary, O., Maertens, J., Meis, J.F., Patterson, T.F., Ritter, J., Selleslag,D., Shah, P.M., Stevens, D.A., Walsh,T.J. 2002. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: An international consensus. Clinical Infectious Diseases 34: p. 7 14. 3- Ellepola, A.N.B., Morrison, C.J. 2005. Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis. Journal of Microbiology 43(No. S): p. 65-84. 4- Ellis, M., Al-Ramadi, B., Bernsen, R., Kristensen, J., Alizadeh, H., Hedstrom, U. 2009. Prospective evaluation of mannan and anti-mannan antibodies for diagnosis of invasive Candidainfections in patients with neutropenic fever. Journal of medical microbiology 58(5): p. 606-615. 5- Guery, B.P., Arendrup, M.C., Auzinger, G., Azoulay, E., Borges Sá, M.,Johnson, E.M., Müller, E., Putensen, C., Rotstein, C., Sganga, G., Venditti, M., Zaragoza Crespo, R., Kullberg, B.J. 2009. Management of invasive candidiasis and candidemia in adult non-neutropenic intensive care unit patients: Part I. Epidemiology and diagnosis. Intensive Care Med. 35: p. 55 62. 6- Nucci, M.,, Colombo, A.L. 2007. Candidemia due to Candida tropicalis: clinical, epidemiologic, and microbiologic characteristics of 188 episodes occurring in tertiary care hospitals. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 58: p. 77 82. 7- Oliveri, S., Trovato, L., Betta, P., Romeo, M.G., Nicoletti, G. 2008. Experience with the Platelia Candida ELISA for the diagnosis of invasive candidiosis in neonatal patients. Clinical Microbiology and Infection 14 (4): p. 377-397. 8- Pappas, P.G., Kauffman, C.A., Andes, D., Benjamin D.K.Jr., Calandra, T.F.,Edwards, J.E.Jr, Filler, S.G., Fisher, J.F., Kullberg, B.J., Ostrosky-Zeichner, L., Reboli, A.C., Rex, J.H., Walsh, T.J., Sobel, J.D. 2009. Clinical Practice Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 48: p. 503 535. 9- Persat, F., Topenot, R., Piens, M.A., Thiebaut, A., Dannaoui, E., Picot, S. 2002. Evaluation of different commercial ELISA methods for the serodiagnosis of systemic candidiosis. Mycoses 45: p. 455 460. 10- Prella, M., Bille, J., Pugnale, M., Duvoisin, B., Cavassini, M., Calandra, T., Marchetti, O. 2005. Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan antigenemia and antimannan antibodies. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 51: p. 95 101. 11- Rentz, A.M., Halpern, M.T., Bowden, R. 1998. The Impact of Candidemia on Length of Hospital Stay, Outcome, and Overall Cost of Illness. Clinical Infectious Diseases 27: p. 781 788. 12- Ruan, S.-Y., Hsueh, P.-R. 2009. Invasive Candidiasis: An Overview from Taiwan. J. Formos. Med. Assoc. 108(6): p. 443 451. 13- Sendid, B., Poirot, J.L., Tabouret, M., Bonnin, A., Caillot, D., Camus, D., Poulain, D. 2002. Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p. 433 442. 14- Sendid, B., Caillot, D., Baccouch-Humbert, B., Klingspor, L., Grandjean, M., Bonnin, A., Poulain, D. 2003. Contribution of the Platelia Candida-specific antibody and antigen tests to early diagnosis of systemic Candida tropicalis infection in neutropenic adults. Journal of Clinical Microbiology 41(10): p. 4551 4558. 10

15- Tortorano, A.M., Peman, J., Bernhardt, H., Klingspor, L., Kibbler, C.C., Faure, O., Biraghi, E., Canton, E., Zimmermann, K., Seaton, S., Grillot, R. 2004. Epidemiology of Candidaemia in Europe: Results of 28-Month European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Hospital-Based Surveillance Study.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 23: p. 317 322. 16- Vardakas, K. Z., Michalopoulos, A., Kiriakidou, K. G., Siampli, E. P., Samonis, G., Falagas, M. E. 2009. Candidaemia: incidence, risk factors, characteristics and outcomes in immunocompetent critically ill patients. Clin. Microbiol. Infect. 15: p. 289 292. 17- Verduyn Lunel, F.M., Donnelly, J.P., van der Lee, H. A. L., Blijlevens, N.M. A., Verweij, P. E. 2009. Circulating Candida-specific anti-mannan antibodies precede invasive candidiasis in patients undergoing myelo-ablative chemotherapy. Clin. Microbiol. Infect. 15(4): p. 380-386. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 881050 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 08/2009 11