Virus struktur och förökning"

Transkript

1 Jean-Yves Sgro! Virus struktur och förökning Maria Söderlund-Venermo, FD, doc. Haartman-institutet, Virologiska avdelningen Helsingfors universitet Vad är ett virus? Virus avviker från alla andra organismer - Fullständigt egen livsform Obligatoriska intracellulära parasiter, som har en minimimängd gener vilka omgivs av ett skyddande skal som ger viruset dess infektionsförmåga Virus kan inte föröka sig utan levande celler. Utanför värdcellen är viruset en metaboliskt inaktiv partikel. Viruspartikeln måste klara sig i två miljöer: både utanför och innanför cellen samt kunna upplösas i en passlig cell. Efter att ha trängt in i cellen tar viruset cellen i eget bruk och använder sig av dess metaboliska och syntetiska apparatur med bekostnad av cellens välbefinnande. Virus finns i alla livsformer, djur-, växt-, bakterie-, alg-, och svampceller. Det finns över 10 miljoner viruspartiklar/ml vatten Virus består av protein och nukleinsyra, endel har även lipider och kolhydrater. 1

2 Vad är virus: LWOFFS KRITERIER Egenskap Bakterier! Riketsia! Virus! Gen! Storlek (> 500nm) + ± Förökning: delning + + replikation + + Ribosomer + + Egen energiproduktion + Egen proteinsynees + + Arvsmassa: DNA DNA ellerrna + Infektionsduglighet (Antibiotika känslighet) + + Bakterier förökar sig genom celldelning i syntetiskt medium. Virus förökar sig endast i levande celler: cellen fungerar som fabrik och producerar virusets beståndsdelar på skilda håll i cellen. - först efter detta går virusdelarna samman till nya viruspartiklar. Viruspartikeln växer inte i storlek! Bakterien växer André Lwoff ( ) VIRUS STORLEK Viruspartikelns storlek är endast nm! [1000nm = 1 µm; 1000µm = 1 mm] - Virus kan inte ses, man behöver ett elektronmikroskop Ljusmikroskop elektronmikroskop röntgen NMR Upplösningsförmågan: ögat 0,1 mm = 100 µm ljusmikroskop 0,2 µm EM 0,2-2 nm storlek genom (MW) Albumin 5nm - Polio 28nm 2,6 x 10 6 Influensa 100nm 4 x 10 6 Smittkoppor 250nm 160 x 10 6 Stafylokock 1000nm 3000 x 10 6 Mänskocell nm x

3 VIROLOGINS HISTORIA 1000-talet-> Variolation smittkoppor 1796 Edward Jenner Smittkopsvaccin (vaccination) 1881 Louis Pasteur Rabies i kaniner 1892 Dimitri Iwanowsky TMV är mindre än andra sjukdomsalstrare 1898 Martinus Beijerinck Virus = sjukdomsalstrare, virulent Virus hittades : Tobakens mosaikvirus (TMV) var mindre än andra sjukdomsalstrare. Kan inte filtreras bort. Nytt slags sjukdomsalstrare => smittande levande vätska Contagium vivum fluidum eller smittande giftig vätska Contagium virum fluidum 1898 Loeffler och Frosch Mun och klövsjuka smittar likt TMV och förökar sig varje gång 1902 Walter Reed Gula febern smittar via myggor, orsakar viremi 1908 Landsteiner, Popper Barnförlamning orsakades av ett virus 1911 Peyton Rous Första tumörviruset från sarkom, RSV 1916 Twort, d Herelle Bakterievirus hittades (fager) 1923 Theiler och Smith Mus och hönsäggs virus isolation Wendell Stanley Kristallisering av TMV:n modellvirus Ernst Ruska et al. Elektronmikroskopi 1949 John Enders Cellodlingar; odling av polio Salk / Sabin Poliovaccin 1952 Hershey & Chase Bakteriofags genom är ensamt infektiöst 1964 Epstein & Barr Första viruscancern hos människan: EBV, Burkitts lymfom 1977 Sista smittkoppsfallet. WHO:s program ledde till sjukdomens försvinnande 1983 Montagnier / Gallo AIDS orsakande virus (HIV) isolerades 1983 Karry Mullis PCR dvs DNA-amplifikation 1986 Första rekombinations-dna-vaccinet (Hepatit B) togs i bruk VIRUS SAMMANSÄTTNING NUKLEINSYRA 1-30% - DNA eller RNA - 1- eller 2-strängad - lineär eller cirkulär - enhetlig eller segmenterad - storlek ~4-400 x 10 6 d (begränsad genetisk kapacitet) PROTEIN 60-80% - skyddande skal runt genomet - oftast enbart några sorter - immunologisk specifitet - receptor igenkänning - enzymfunktion (polymeras) - Kodade av virusgenomet KOLHYDRATER - höljets glykoproteiner och lipider LIPIDER 0-20% - värdcellens enzymer ansvarar för syntesen - i höljet - från värdcellen - sammansättningen följer maturationsstället - kan variera enligt värdcell 3

4 VIRUS STRUKTUR (MORFOLOGIA) EM (1950): Ytstrukturen är inte jämn utan består av underkomponenter Röntgendifraktion (1972): Viruspartikeln är inte amorfisk - Består av regelbundet återkommande enheter - lätt att kristallisera och symmetriska - forskar redan med < 2 Å noggrannhet Kryo-EM + datamaskin-gjord 3D-bildrekonstruktion Provet fryses snabbt så att inte förstörande iskristaller bildas Mikroskopering i -160 C. Virus former: stav, boll, ikosaheder, kula, mask... VIRUSTERMINOLOGI Kapsid (kapsidi, capsid) Strukturell enhet Kapsomer Nukleinsyra (DNA eller RNA) Nukleokapsid (eller RNP) Lipid Glykoprotein, spike Hölje (vaippa, envelope) Matrix-protein Virion: infektionsdugligt färdigt virus Replikation: genomets amplifikation Transkription: bildning av mrna Translation: proteinsyntes Paramyxovirus Cytomegalovirus 4

5 HELIKAL VIRUSSYMMETRI Proteinenheterna fördelar sig sida vid sida runt nukleinsyrasträngen formande en spiral, där varje strukturell enhet är lika till sin granne = nukleokapsid. Tobakens mosaikvirus fungerar som modellvirus > Genomet kodar endast ett protein, men väldiga mängder av detta Hela kapsidens längd är beroende av RNA-strängens längd Endast en symmetriaxel, längs med centralkanalen Virusets utseende kan ändå vara antingen rund eller långsmal TMV Rabies Paramyxovirus Helikal symmetri Filo: Ebola Ortomyxo: Influensa A Arenavirus Paramyxo Coronavirus Rhabdo: Vesicular Stomatitis (VSV) 5

6 IKOSAHEDRAL! VIRUSSYMMETRI Genomet är löst inuti skalet (=kapsiden), dvs inte fast i proteinskalet likt de helikala virusen Konstruktionen bygger på att man kan dela ytan i ett jämnsidigt triangelnät, så att varje triangel motsvaras av tre strukturella proteinenheter (20 x 3), vilka man behöver 60 av. Ursprungstrianglarna formar en ikosaheder så att runt vart och ett av de 12 spetsarna bildas en ring av fem enheter. Den minsta ikosahedern är T=1 (triangulationsnumret x 60 enheter) symmetri: Parvovirus kapsid Parvovirusens kapsid följer T=1 ikosahedral symmetri > virion består av 60 VP2-protein kopior. CPV: Agbandje, Parrish, Rossman Agbandje, Parrish, Rossman. Semin Virol 6; 1995 MVM: Agbandje-McKenna 6

7 Ikosahedral symmetri Herpesvirus Parvovirus Papillomvirus Enterovirus Rotavirus Adenovirus VIRUSSYMMETRI! The Eden Project with geodesic domes near St Austell, England. Climatron at the Missouri Botanical Garden, St. Louis, 1960 Fuller s geodesic system consists of dividing a sphere into equal triangles; Geodesic Dome! A geodesic grid is a technique used to model the surface of a sphere with a subdivided polyhedron, usually an icosahedron. 7

8 VIRUSSYMMETRI KOMPLEX Pox-virus (t.ex. smittkoppsvirus) är varken helikala eller ikosahedrala, utan mycket komplexa stora partiklar (250 nm) - ser ut som tegelstenar - följer ingen symmetri! Finns även virus i andra former, t.ex. citron, droppe eller vinflaska... Molluscum contagiosum poxvirus Fusellovirus Acidianus bottle-shaped virus (Ampullavirus) VIRUS KLASSIFICERING Man betraktar kemiska, fysikaliska och biologiska egenskaper: VIRION: virionets storlek, form, hölje, kapsidens symmetri GENOM: DNA/RNA, en/tvåsträngad, lineär/cirkulär, +/- polaritet (ambisens), segmenterad eller segmentens antal, storlek, sekvensen, etc. PROTEIN: antal sorter, storlek, funktioner, aminosyresekvens REPLIKATION: strategi, transkriptionssätt, translationssätt, maturationsställe, effekt på cellen FYSIKALISKA: ph-tolerans, kation beroende, värme-, lösnings-, detergent- eller strålningskänslighet BIOLOGISKA: serologiska relationer, släktskap, värd- eller vävnadsspektrum, sjukdomsalstringsförmåga (patogenitet) RNA DNA Ikosahedral Helikal Ikosahedral Helikal Okänd 8

9 RNA-VIRUS Exempel: Rota IBDV Noro polio Sapo rino HAV entero dengue rubella TBEV sindbis gula febern HCV HIV HTLV SARS Ebola Marburg rabies VSV Hantaan Influensa Puumala Inkoo Uukuniemi RSV Lassa påssjuka mässling parainfluensa sendai hendra DNA-VIRUS Papillom Polyom Exemple: B19 papillom (egen familj) Boca polyom (egen familj) Parv4 SV40 AAV BK, JC, MVM KI, WU, MCV,TSV CPV HBV HSV LCV CMV rana EBV HHV-6, 7, 8 AcMNPV smittkoppor vaccinia molluscum contagiosum 9

10 Stort och litet virus Mimivirus: 1,2 Mega bp Anellovirus: TTV: 3,8 kbp Bendinelli et al. Clin Microbiol Rev 14; 2001 Raoult et al. Science 306; 2004 Mimi: 400nm Circo: 20nm BAKTERIOFAG Bakterie ätare, dvs bakterievirus, dvs bakteriofager, eller fager (phage, faagi) Troligtvis har alla bakterier sina egna fager, vars värdspecificitet beror på receptorerna på cellytan. Olika morfologityper (A-F). Används i fagterapi! T4 fag T4 fag Tectiviridae fag Inovirus, M13 Enterobacteria virus P2 10

11 Virophage = virusets fag! Jättevirusen har sina egna virus som gör dem sjuka Fagen heter Sputnik ~50 nm ikosahedral kapsid ~18 kbp dsdna cirkulärt genom Innehåller 21 gener, som har homologer med olika organismdomäner (eukaryoter, arkebakterier och bakterier) Different morphological aspects of mamavirus and Sputnik. La Scola et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi: /nature07218 VIRUS FÖRÖKNING I CELLEN 1. ADSORPTION (FASTSÄTTNING) - virus fäster sig vid cellreseptor 2. PENETRATION - virus kommer igenom cellmembranen Infektiösa partiklar per cell Infektiösa partiklar i cellen Extracellulära viruspartiklar 3. NUKLEINSYRESYNTES - genomet frigörs och replikerar 4. PROTEINSYNTES - cellen producerar virala proteiner 1, 2 3, Eklips Tid 5. VIRUSENS MONTERING/ ASSEMBLY (MOGNAD) - proteinenheterna formar kapsiden, inuti vilken nukleinsyran packas 6. FRIGÖRELSE AV FÄRDIGA VIRUS - de färdiga virusen lämnar cellen 1954 R Dulbecco, M Vogt Renato Dulbecco 11

12 1. ADSORPTION Slumpmässig kollision, fysikaliskt fenomen, fordrar ej energi > hög virionkoncentration, varav inte många fäster sig vid cellen Virus känner igen en receptor på cellens yta och fastnar i den > mycket specifik bindning Virus infekterar bara några få celler Virus kan även komma in i celler som det inte kan replikera i Beanpod mottle virus (växt) Chlorellavirus (alg) CELLMEMRAN OCH RECEPTORER Hundens parvovirus transferrinreceptor!! (C.R. Parrish 2001)! Exempel av cellreceptorer: Integrin, heparinsulfat, sialsyra, CD21, CD4, CCR5, globosid, ICAM-1, laminin-receptor, EGF-rcseptor... Endel virus behöver co-receptor för att komma in i cellen Reseptorerna utgör oftast en viktig andel i cell-och vävnadstropismen 12

13 2. PENETRATION Många olika metoder hur virus tar sig in i cellen a) Viruset lämnar över sin nukleinsyra eller nukleokapsid direkt till cytoplasman genom plasmamembranen b) Virushöljet går samman (fusionerar) med cellmembranen c) Virus passerar igenom cellen i cellvesikler (endocytos) - fusion med endosomens membran (influensa) - Lys av endosom-membranen (adeno) b) HI-viruset fastnar och kommer in a) PBCV-1 virusets DNA matas in i Chlorella algen Virus endocytotiska transportleder Marsh, Helenius: Virus entry Cell

14 TRANSPORT AV VIRUS INUTI CELLEN Höljelösa DNA-viruset (CPV) transporteras i cellvesiklerna till nucleus: Cytoplasm! Viruses Clathrin- Coated vesicles Early endosome Carrier vesicle Late endosome Lysosome Nucleus! Maija Vihinen-Ranta Jyväskylä universitet TRANSPORT AV VIRUS INUTI CELLEN Cytoplasman är för viruset som ett stort visköst hav igenom vilket det måste ta sig för att komma till cellkärnan. För viruset tar 1 cm resa ca i vatten i cytoplasma Poliovirus kapsid 16 nm 45 d 61 år Adenovirus kapsid 45 nm 122 d 166 år HSV kapsid 63 nm 169 d 231 år Från Sodeik, Trends Microbiol 8: 465 Många virus (rabies, influenssa, herpes, adeno, parvo) använder sig av cellens stödstrukturer, dvs mikrotubulus, samt cellens cellkärnstransportpotein: dynein och kinesin Nucleus MTs Maija Vihinen-Ranta, Jyväskylä 14

15 PENETRATION Smith, Helenius: Virus entry Science 2004 TRANSPORT AV VIRUS INUTI CELLEN Transport av virus till cellkärnan och DNA-genomets frigivning! 1) Frigivna genomets (+ protein) transport - genomet frigörs i cytoplasman: HIV, influensa i cellkärnan: herpesvirus, adenovirus, hepatit B virus 2) Hela viruspartikeln transporteras till nucleus - genomet frigörs i nucleus - ex. geminivirus, parvovirus (?) 3) Virus kommer in i kärnan under celldelningens mitos - simian retrovirus 1 Nukleärpor Cellkärna Genomets frigörelse från sitt skal uncoating 15

16 VIRUS TRANSPORT I CELLEN! Virus transport till cellkärnan och genomets frigivning dvs. uncoating Whittaker GR, Kann M, Helenius A Viral entry into the nucleus. Annu. Rev. Cell Dev. Biol.16: BAKTERIOFAGERS PENETRATION E. coli T4-fagen sprutar in sin nukleinsyra genom cellväggen 16

17 3-4 EKLIPS (NUKLEINSYRA- OCH PROTEINSYNTES) Tiden då vi inte ser virusen inne i cellen för viruset har upplösts. Virus är en högt utvecklad parasit: cellens egna metoboliska verksamhet stannar nästan helt och cellen börjar producera virusdelar. Endel virus använder cellens polymeras till sin replikation, emedan andra har eget polymeras enzym. DNA-virus går till cellkärnan men RNA-virus går till cytoplasman. Virus förökar sig INTE genom att integrera sig i cellens kromosomer. VIRUS-RNA:S PROCESSERING Capping: RNA-polymeras II tillsätter efter RNA-syntesen en inverterad metylerad G -trifosfat till RNA:s 5-ända. Polyadenylering: Alla RNA:n skärs av och polya-polymeras tillsätter en poly A-sekvens ( nt) vid ett speciellt ställe. En viktig konsensus sekvens är AAUAAA. CAP-molekyl 7megG Splicing: mrna är inte en enhetlig kopia av DNA:t, utan består av bitar som fogats samman. Många virus använder splicing för reglering av translationen samt för att få tillstånd så många protein som möjligt av ett litet genom: alternative splicing. Cap och Poly A bibehålls pre-mrna mrna 17

18 VIRUS TRANSKRIPTIONSKARTA Exempel ssdna-virus: parvovirus B19 R e a d i n g f r a m e M a p u n i t s N u c l e o t i d e s m R N A s : p P r o t e i n s : V P 1 ( 83 k D a ) a n d 7. 5 k D a p r o t e i n V P 1 ( 83 k D a ) N S 1 ( 77 k D a ) V P 2 ( 58 k D a ) a n d 7. 5 k D a p r o t e i n V P 2 ( 58 k D a ) 7. 5 k D a p r o t e i n? 7. 5 a n d 11 k D a p r o t e i n s 11 k D a p r o t e i n VIRUS REPLIKATIONSSTRATEGI - tai + ssdna (parvo, circo, anello) +ssrna -ssdna (retrovirus) Bär med sig reverse-transkriptas ±dsdna (papillom, polyom, adeno, herpes, HBV, irido, pox) +ssrna (picorna, flavi, toga, corona) Kodar till RNA/RNA-polymeras -ssrna +RNA -ssrna ±dsrna (rhabdo, paramyxo, orthomyxo, arena, filo, bunya, borna) Bär med sig RNA/RNA-polymeras (reo, birna) Bär med sig RNA/RNA-polymeras 18

19 DNA-virus! DNA > tidig mrna > tidigt protein (enzym) DNA-virus DNA replikerar sent mrna > sena protein (strukturella) DNA-virus går ända till cellkärnan! - små virus använder cellens polymeras och stora virus har eget polymeras ex. HSV:s transkription, translation & replikation > ssdna: Parvovirus replikation MVM: Agbandje-McKenna B19: Clinical Virology,

20 RNA-virus Oftast ett relativt litet genom, kanske för att större genom skulle medföra för mycket mutationer i.o.m. att RNA-polymeras inte har RNAfelkorrigering Behöver eget RNA-RNA-polymeras, ty finns inte normalt i cellen Inga protein kan produceras utan mrna, därför påverkar virionens RNAtyp virusets replikation: +ssrna! -ssrna! dsrna! RNA->DNA! Genomet fungerar som mrna +RNA-virus protein (RNA-polymeras) Syntes av komplementär RNA-sträng (-RNA) Nya virala RNA (+RNA) protein +ssrna: Picornavirus Replikation: Translation: +ssrna > -ssrna > +ssrna => replikation!!!!enkapsidation translation 20

21 -ssrna: Paramyxovirus! Replikation:! -ssrna > +ssrna > -ssrna!! Transkription:! -ssrna > 6 mrna! Virusgenetik Virus förökar sig mycket snabbt Bra exempel på evolution! En endaste viruspartikel kan producera mycket avkomma > quasispecies! Transformationsmekanismerna är Mutationer! Rekombination! Omorganisation (reassortment)! Blandning av olika fenotyper! 21

22 MOGNAD AV VIRUSETS HÖLJEPROTEIN! Höljeproteinens sekretionsrutt: 1. ER: - proteinsyntes - vikning av proteinet - svavelbindningar - glykosylationens början 2. Golgi: - Glykosylationen slutförs - Transportvesikler för proteinen till cellmembranen 5-6. MOGNAD OCH FRIGÖRELSE! Nukleinsyran och proteinerna sammanförs till nya viruspartiklar. Viruskapsidens ihopmontering är programmerat i proteinens aminosyresekvens = self assembly Proteinen sammanfogas på ett för viruset säreget sätt. Höljeproteinen glykosyleras och transporteras till cellmembranen. Vissa virus får omkring sig ett hölje bestående av lipider (och glykoprotein). a) P.g.a. virusinfektionen har cellen inte kapacitet att lappa och förnya sig och virusen söndrar cellen = cellen lysar och virionerna frigörs och cellen dör. b) En virustriggad signal leder till cellens självförstörelse (apoptos). c) Höljebeklädda virus kan komma ut genom avknoppning ( budding ). Viruset hamnar i de delar av cellmembranen där virusglykoproteinen lagrats. d) Viruspartikeln kommer ut via exocytosrutten. 22

23 VIRUS TRANSPORT UT UR CELLEN! Virusgenomets eller partikelns transport från cellkärnan till cytoplasman Transport av RNA genom poren - Retrovirus (HIV, SIV) - Influensavirus - DNA-virus som har reverese transriptas aktivitet (RNA >DNA) (hepatit B virus) Viruspartikeln frigörs vid cell lysis (adeno, polyom) Viruspartikeln går genom poren (gemini, parvo) Partikeln avknoppas genom cellmembranen (herpes, baculo, SV40?) Whittaker GR, & Helenius A Nuclear import and export of viruses and virus genomes. Virology 246:1-23. BAKTERIOFAGERS UTGÅNG! Höljelösa virus lysar cellen burst 23

24 ADSORPTION PENETRATION FRIGÖRELSE Värdcellfunktion REPLIKATION Transkription Translation VIRUS FÖRÖKNING Assembly (mognad) FRIGÖRELSE VIRIONER KÄLLOR! Virus Ultrastructure by Linda Stannard [ All the virology on the web by David Sander [ ICTV [ Molecular genetics by Ulrich Melcher OSU [ Maija Vihinen Ranta, Jyväskylän yliopisto Fundamental Virology, Fields and Knipe, Raven Press Principles of Virology, Flint et al, ASM Press Grundvirologikurs: Johdanto viruksiin (Biotdk) Fortsättningskurser: Molecular Virology, Molecular epidemiology of virus infections Clinical virology 24