LABKOMPENDIUM. VIRUS och CELLER 17-18/5 2011

Transkript

1 LABKOMPENDIUM VIRUS och CELLER T /5 2011

2 INNEHÅLLSFÖRTECKNING Cellkultur celler odlade in vitro... 3 Allmän introduktion... 3 Olika typer av kulturer... 3 Organkultur... 3 Vävnadskultur... 4 Cellkultur... 4 Primärkultur... 4 Cellinje... 4 Etablerad cellinje... 5 Kontaktinhibition... 5 Serumfaktorer och näringsmedier för cellodling... 6 Biologiskt material... 6 Kemiskt definierade medier... 6 Dispergering av celler... 7 Kontamination... 7 Ordlista... 8 Att arbeta sterilt Passage av mammaliecellskultur Materiel Dag Bilder Dag Illustration Bilder

3 CELLKULTUR CELLER ODLADE IN VITRO Allmän introduktion Vävnader och celler från djur sägs befinna sig i kultur om de får växa in vitro * i mer än 24 timmar. Vävnads- och cellkulturer * är bra experimentella system för att studera flera medicinska och biologiska företeelser. Cellkulturen tillåter studier av biokemiska processer i enskilda typer av celler, vilket är en stor fördel jämfört med att arbeta med försöksdjur. Organ- och cellkulturer * är också oumbärliga redskap inom virusdiagnostiken, och vid framställning av vaccin används ofta cell- eller bakteriekulturer. Olika typer av kulturer Under talet började framför allt embryologer att utveckla metoder att studera levande celler och organ in vitro. År 1885 upptäckte Vilhelm Roux att delar av kycklingembryon kunde hållas vid liv ett par dagar i buffrade fysiologiska koksaltslösningar. Allt eftersom det fysiologiska och biokemiska vetandet fördjupades kunde mer avancerade tekniker tas i anspråk. Framför allt har de kemiskt definierade medierna och god aseptisk teknik möjliggjort att man kan hålla flera typer av celler och organ från varmblodiga djur under lång tid in vitro. I detta avsnitt beskrivs närmare olika typer av organ-, vävnads- och cellkulturer. Organkultur Karaktäristiskt för denna kultur är att flera olika, differentierade *, celler samverkar som om de fortfarande vore i funktion inuti kroppen. Typiska exempel är trachea, där cellernas slemtransporterande rörelse fortfarande kan iakttagas, eller nervvävnad, ovarier, tyreoidea och tarmvävnad. Dessa kulturer används för studier av organfunktioner, samt för studier av speciella, oftast färdigdifferentierade, celler. De är också lämpliga för odling av virus som har specifika krav på värdcellen. * anger att termen återfinns i ordlistan på sidorna 8 och 9 3

4 Vävnadskultur Begreppet har sitt ursprung i in vitro- odlingen av fragment från sönderdelad vävnad i suspension, eller vävnadsexplantat som bäddats in i koagulerad plasma. På senare tid har begreppet vävnadskultur kommit att associeras med in vitro- odlingen av celler i allmänhet. Cellkultur Det finns huvudsakligen tre typer av cellkulturer, som alla kan framställas från den ursprungliga vävnaden på tre olika sätt: Vävnaden sönderdelas till enskilda celler på mekanisk väg. Vävnaden sönderdelas till enskilda celler med hjälp av proteolytiska enzym. Enskilda celler växer ut från ett vävnadsfragment. Primärkultur * Består av ett eller flera olika cellslag från en bit vävnad där vävnadens struktur har utplånats genom dissociering, till enskilda celler. Cellerna växer, omflutna av näringsvätska som ett monolager * på odlingskärlets botten, eller flytande i aggregat som cellsuspension *. De ingående cellslagen är differentierade i olika grad. Sorting out * - fenomen leder till att områden av lika celler bildas. Cellerna i primärkulturen motsvarar inte nödvändigtvis cellerna i den levande vävnaden, eftersom vissa cellslag gynnas och andra missgynnas i den primära cellkulturmiljön. Primärkulturen används till att studera virus som kräver värdceller med delvis bevarade differentieringskaraktäristika. Cellinje * När celler överförs från en primärkultur till en ny odlingsflaska, dvs. passeras *, benämnes den nya kulturen cellinje. Detta innebär en ytterligare selektion och begränsning av antalet ingående cellslag. Fortsätter man att passera cellinjen går man mot en allt mer konstant cellsammansättning. Vill man framställa en kultur av i hög grad enhetliga celler, måste man framställa s.k. kloner *. Härvid fås initialt celler med identisk genuppsättning och differentieringsgrad. Efter några passager divergerar cellerna från varandra i varierande grad, beroende på mutationer av olika slag. Differentieringsdynamiken i cellkulturen är dock mycket komplex. Cellinjer används för studier av kulturer som besitter ursprungscellens fulla genetiska uppsättning, samt inom virologin. 4

5 Etablerad cellinje * Av olika anledningar kan ibland en cellkultur övergå till att kunna passeras i oändlighet. Denna förändring kan ske spontant eller genom inverkan av olika agens, så som mutagena substanser, joniserande strålning eller vissa virus. Förändringen kallas transformation *. De transformerade cellerna får nytt utseende; de blir kortare, rundare och kontaktinhibitionen (se nedan) minskar ofta så att cellerna ibland kan ge upphov till tumörer, både maligna och benigna, när de injiceras på försöksdjur. Eftersom samma agens även kan framkalla cancer hos försöksdjur ligger det nära till hands att knyta samman tumörutveckling med transformation. En etablerad cellinje kan också fås fram via odling av tumörceller eller genom fusion av en normal cell och en etablerad cell (inte nödvändigtvis av samma sort). Vid varje passage av den etablerade cellinjen sker en förändring av cellpopulationen på grund av de, från cellens ursprungsmiljö, kraftigt avvikande cellkulturbetingelserna. Efter ett antal passager har de egenskaper som gynnar växt i cellkultur förstärkts, medan de onödiga funktionerna har selekterats bort. Detta kan ske genom förlust av vissa kromosomsegment och mångdubblande av andra. Därmed förvandlas den diploida * cellen till en heteroploid *. Den etablerade cellinjen kan betraktas som ett slutet evolutionärt system; nya mutanter uppstår, prövas och förkastas eller förökas ständigt. De mutanter som kan förena snabb delning med optimalt utnyttjande av miljön kommer snabbt att dominera cellinjen. Situationen kommer att vara lik den i en snabbt växande cancersvulst. Etablerade cellinjer används där stora mängder eukaryota celler behövs och mindre vikt läggs vid definierad genuppsättning. Kontaktinhibition Kontaktinhibition kan innebära dels inhibition av cellens rörelse, som inträffar när celler berör varandra, dels inhibition av celldelning vid kontakt med grannceller. Med den generella termen kontaktinhibition avses oftast det senare. Kontaktinhibitionen får som konsekvens att celldelningen i en kultur upphör när en viss kritisk celltäthet uppnåtts. Att celldelningen upphör tyder inte på någon brist på näringsfaktorer i mediet, då medium från en kontaktinhiberad kultur kan understödja utväxt av celler i en ny kultur. Det verkar i stället finnas receptorer på cellens yta, som reagerar på närvaron av en intilliggande cell. När tillräckligt många sådana receptorer har aktiverats hämmas cellens delning. Det molekylära underlaget för detta fenomen är fortfarande till största del okänt. En kontaktinhiberad cell 5

6 stannar i G1- fasen i celldelningscykeln. Genom kontaktinhibitionen hindras cellerna från att växa ovanpå varandra och om cellerna är adherenta (fastväxande) bildas ett monolager. Serumfaktorer och näringsmedier för cellodling Biologiskt material För att celler skall kunna växa i kultur måste oftast serum eller liknande extrakt tillsättas. Det finns i serum en mängd ofullständigt kända faktorer som påverkar cellernas tillväxt, bl.a. hormoner och peptider (tillväxthormoner, vitaminer, insulin), transportproteiner som binder t.ex. mineraler eller lipider (transferrin binder järn, albumin binder kolesterol) samt fria fettsyror och mineraler. Serumfaktorerna är många och måste samverka för att den tillväxtstimulerande effekten skall uppstå. Man har även funnit att många cellslag utsöndrar egna tillväxtfaktorer som har serumlika effekter på celltillväxten. Kemiskt definierade medier De tidigaste näringsvätskorna vid cellodling in vitro utgjordes av plasma, serum och vävnadsextrakt. Efter hand som kunskapen om cellernas metabolism ökades kunde syntetiska, fullständigt kemiskt definierade media introduceras. Deras fördel framför kalvserum, som annars används mycket, är att man vet precis vad de består av, vilket ökar reproducerbarheten i försökssammanhang. För tillväxt av celler in vitro är det nödvändigt att upprätthålla gynnsamma koncentrationer av nödvändiga oorganiska joner samt fysiologiskt osmotiskt tryck och ph. Dessa betingelser uppfylls av den s.k. balanserade saltlösningen (balanced salt solution, BSS), som är basen i alla kemiskt definierade cellkulturmedier. Vissa balanserade saltlösningar innehåller dessutom glukos. De flesta balanserade saltlösningar innehåller CO 2 - bikarbonatbuffertsystem, vilket innebär att cellerna måste odlas i tillslutna kärl eller i en atmosfär som innehåller 5 % CO 2 för att förhindra att förlust av CO 2 leder till en toxisk höjning av ph. Balanserade saltlösningar berikas sedan med aminosyror, vitaminer och andra kemiskt definierade näringsämnen för att producera de syntetiska medier som används idag. 6

7 Dispergering av celler Vid anläggande av en cellkultur och passage av celler är det nödvändigt att dispergera (finfördela) vävnadsbitar och cellaggregat till en suspension. Detta sker vanligen med hjälp av proteolytiska enzym och/eller kelatbildare. Det proteolytiska enzymet spjälkar intercellulära proteinbryggor och kelatbildaren binder divalenta katjoner, främst Ca 2+ och Mg 2+, som fungerar som stabilisatorer för de intercellulära bindningarna. Flera olika enzym kan användas för celldispergering; kollagenas rekommenderas för vävnad som innehåller mycket bindväv och pronas ger mycket snabb och komplett dispersion av vissa humana vävnadstyper. Trypsin har dock blivit det mest använda enzymet i dessa sammanhang. De mest använda kelatbildarna är EDTA (etylendiaminotetraättiksyra) och citrat. Dessa är mest effektiva för dispersion av celler som redan befinner sig i monolager. Kontamination Alla cellkulturer är oerhört känsliga för angrepp av virus, svampar och bakterier. För att bemästra bakterieinfektioner tillsätts ofta en blandning av penicillin och streptomycin (PEST) i mediet. Svampinfektioner kan förebyggas genom tillsats av en kombination av mycostatin och nebocetin i mediet. Svårare att komma tillrätta med är infektioner av mykoplasma, som är ytterst små bakterier, på grund av deras resistens mot flera typer av antibiotika. Dessa bakterier lever ytterst intimt förenade med cellerna; de är ofta cytoplasmatiskt lokaliserade, vilket gör att antibiotika riktade mot mykoplasma måste vara verksamma även intracellulärt i den infekterade cellkulturen. Flera långvariga behandlingar med bl.a. kanamycin och aureomycin trycker ned infektionen och kan i vissa fall helt utplåna bakterien. De flesta primära cellkulturer synes vara fria från mykoplasma, vilket tyder på att det är det laborativa handhavandet som ger upphov till infektionen. Preventiva åtgärder, så som fullgod aseptisk teknik, är därför viktigt vid cellodling. 7

8 ORDLISTA Det råder en språklig förbistring inom cellodlingstekniken; flera begrepp används med skiftande och ofta oklar betydelse i olika framställningar. Nedanstående ordlista är en förkortad översättning av Tissue Culture Associations terminologi (Schaeffer, W.I., In Vitro Cell Dev Biol 26, ). Dessutom är listan kompletterad med några ytterligare termer. Cellkultur: Odling av celler in vitro. I cellkulturen är cellerna inte längre organiserade i organ eller organliknande vävnad. Cellinje: Uppkommer då en primärkultur passeras. Cellsuspension: En typ av kultur där celler, eller aggregat av celler, befinner sig fritt i mediet. Cytopatogen effekt: Förändring hos cell, exempelvis i utseendet, som orsakas av infektion. Differentiering: Specialisering av celler för en specifik funktion. Diploid: Cell med två kompletta kromosomuppsättningar. Människans vanliga celler är diploida. Etablerad cellinje: En cellinje sägs vara etablerad när den kan passeras ett obegränsat antal gånger. Den kan, men måste inte, orsaka tumörutveckling in vivo. Haploid: Cell med en kopia av varje kromosom. Människans könsceller är haploida. Heteroploid: Cell med kompletterande kromosomuppsättningar, där antalet kromosomer avviker från det normala för celltypen. In silico: Simulering av ett försök i datorprogram. Inkorrekt anspelning på in vitro och in vivo; korrekt latinsk form skulle vara in silicio (av silicium, kisel). 8

9 In situ: I intakt cell eller vävnad. Denna behöver dock ej vara vid liv, som är fallet vid in vivo. Från latin, på plats. In vitro: I en artificiell miljö som består av små delar av en organism, som inte kan fungera av sig själv, i t.ex. ett provrör. Från latin, "i glas". In vivo: I intakt organism. Från latin, "i liv". Klon: Betecknar en cellpopulation som uppkommit från en enda cell, genom mitoser. Konfluensgrad: Täckningsgrad, dvs. hur stor del av en yta som är täckt med celler. Organkultur: Avser bitar av, eller hela, organ som odlas in vitro, så att organets uppbyggnad och/eller funktion helt eller delvis bevaras. Monolager: Avser ett cellager, av en cells tjocklek, som växer på en yta. Passage: Överförande av celler, med eller utan utspädning, från ett odlingskärl till ett annat. Plack: Område på ett cellulärt monolager där virusreplikation skadat cellerna. Primärkultur: En kultur som härrör från celler, vävnader eller organ som tagits från en organism utan ytterligare passage in vitro. Sorting out: När ett organ finfördelas, aggregerar lika celler selektivt. Detta ger i en primärkultur ett monolager med områden av lika celler. Syncytium: Cell- lik struktur som bildats genom sammanslagning av två eller flera celler. Transformation: Begreppet omfattar minskad kontaktinhibition, ändrad cellmorfologi, ökad tillväxthastighet, ökad förmåga att passeras många gånger. Vävnadskultur: Avser bitar av, eller hela, vävnader som odlas in vitro, så att dess uppbyggnad och/eller funktion helt eller delvis bevaras. 9

10 ATT ARBETA STERILT I laborationsarbete med celler, bakterier och virus måste man tänka på att alltid arbeta så sterilt som möjligt, för att skydda sitt preparat från infektioner och kontaminationer av icke önskvärda bakterier och svampar. Dessa finns överallt: i luften, på arbetsbänken, på dina händer och kläder, i utandningsluft och hostningar och så vidare. Det sterila arbetet underlättas av planering och av att man är införstådd med vad som ska göras under laborationen. Genom att torka av arbetsbänken med ytdesinfektion och genom att täcka kläder och händer med labrock och skyddshandskar minskar man risken för kontamination. På så sätt undviker man också att utsätta sig själv och sina kläder för potentiellt infekterat material. Plastmateriel som används i denna laboration, så som sexhålsplattor och pipetter, är sterila så länge den omgivande plasten är oöppnad. Så fort förpackningen bryts kommer de att påverkas av den omgivande luften. Därför bör man inte använda en pipett som varit uttagen ur sin förpackning för länge eller som har kommit i beröring med exempelvis arbetsbänk eller labrock, utan hellre slänga den och byta till en ny. Inte heller sexhålsplattor eller flaskor med odlingsmedium bör vara utan lock respektive kork annat än när arbetet så kräver. Kom ihåg att ta av skyddshandskarna när ni använder miniräknare och tar i pennor eller liknande! 10

11 PASSAGE AV MAMMALIECELLSKULTUR Arbeta 2 studenter/grupp. Använd skyddshandskar under laborationen! Materiel (per grupp) Dag 1 1 flaska GMK (green monkey kidney)- celler (adherent cellinje) 1 flaska 30 ml Eagles medium, innehållande 4 % KS (kalvserum) och 1 % PEST (penicillin/streptomycin) 1 rör 10 ml EDTA 1 rör 0,4 ml trypsin 1 st. 6- hålsplatta för cellodling Bürkerkammare och täckglas Sterila pipetter och uppdragare Mikropipett och gula spetsar Ytdesinfektion Dag 2 (materiel i kursiv stil finns utplacerat vid invertmikroskopen) Er egen 6- hålsplatta med GMK- celler 1 st. 6- hålsplatta med herpesinfekterade GMK- celler, fixerade och färgade med kristallviolett 2 st. 6- hålsplattor med infekterade GMK- celler, avdödade med glutaraldehydfixering 1 liten flaska med SP2/0- celler 1 liten flaska med Hum- celler Cellinje Ursprung Celltyp Etablerad? Användning GMK Njurceller från grön markatta Epitelcell (adherent) Ja Odling av herpes, polio, coxsackie, echo, RS, CMV, parainfluensa SP2/0 Myelomceller från musmjälte B- lymfocyt (suspensionscell) Ja Antikroppstillverkning Hum Celler från humanembryo Fibroblastcell (adherent) Nej Odling av de flesta humana virus 11

12 Dag 1 Passage av fastväxande celler (GMK) Torka av arbetsbänken med ytdesinfektion och märk cellodlingskärl med labgruppnummer. 1. Studera cellerna i invertmikroskop. GMK- celler är epitellika och bildar en konfluent (heltäckande), fastsittande cellmatta. 2. Tillsätt hela volymen EDTA (10 ml) till röret med trypsin (0,4 ml) och blanda. 3. Häll av (i vasken) mediet från flaskan med GMK- celler och tillsätt ca 4 ml av blandningen EDTA/trypsin. Vagga ut vätskan över cellytan. 4. Häll av EDTA/trypsin- lösningen och tillsätt åter 4 ml EDTA/trypsin som ovan. Detta tvättar bort kalvserum i mediet, som annars skulle hämma trypsinet. 5. Häll lite slarvigt av EDTA/trypsin- lösningen från GMK- flaskan så att det återstår några hundra mikroliter vätska i flaskan. Placera flaskan i termostat (37 C) ute i korridoren i min tills cellerna börjar lossna från odlingskärlet. 6. Tillsätt 8 ml medium (Eagles medium, 4 % KS, 1 % PEST). Sug upp och spruta ut upprepade gånger med pipetten, tills cellerna lossnat från varandra och odlingskärlet. Kontrollera i invertmikroskop att cellerna har lossnat och ej befinner sig i aggregat. Mindre aggregat går knappast att undvika, men notera om ni ser tussar av celler i flaskorna. 7. Överför 1 ml cellsuspension till varje brunn i 6- hålsplattan. Tillsätt därefter 2 ml nytt medium per brunn. Ställ 6- hålsplattan med celler på anvisad plats för inkubering i CO 2 - termostat över natt. 8. Från det som återstår av cellsuspensionen tas prov för cellräkning i Bürkerkammare (se protokoll på nästa sida). 12

13 Räkning av celler i Bürkerkammare 1. Fukta klackarna och fäst täckglaset genom att skjuta fram det i klackarnas riktning (se bild Bürkerkammare från sidan ). 2. Skaka lätt på flaskan så att cellerna blir jämnt fördelade i suspensionen. Placera en mikropipett med suspension vid täckglaskanten på det grå fältet (se bild Bürkerkammare från ovan ) och låt en droppe sugas in mellan täckglaset och plattformen, av kapillärkraften, tills det ena fältet är täckt med cellsuspensionen. 3. Titta på Bürkerkammaren i ett vanligt mikroskop eller i ett invertmikroskop. Använd 10 - objektivet. Är det svårt att hitta celler eller rutnät, försök att hitta en lämplig ljusstyrka. 4. Två till tre A- rutor, det grå fältet (se bild Förstoring av rutnät ), räknas för att få ett medelvärde på antal celler per A- ruta. En A- rutas volym är 0,1 µl, bottenytan på cellodlingsflaskan är 25 cm 2. Beräkna det totala antalet celler per cm 2 i den konfluenta kulturen, dvs. det ni hade i flaskan från början. Medelvärde (antal GMK- celler/a- ruta):.. Antal GMK- celler/ml:.. Totalt antal GMK- celler:. Antal GMK- celler/cm 2 :.. 5. Tvätta av Bürkerkammaren och täckglaset med vatten. Torka och lägg tillbaka båda två i asken. Släng INTE täckglasen! Redovisa och skriv upp dig på listan! 13

14 Bürkerkammare från ovan Bürkerkammare från sidan Förstoring av rutnät (definition av A- och B- ruta) 14

15 Dag 2 Tänk på att ni INTE behöver ta av 6- hålsplattans lock när ni använder invertmikroskopet. Infektion av GMK- celler 1. Studera 6- hålsplattan med GMK- celler i invertmikroskop och notera celltillväxt och ungefärlig konfluensgrad *, dvs. hur stor del av odlingsytan i kärlet som täcks av celler? 2. Är cellkulturerna kontaminerade? Era celler är nu redo för att användas i ett experiment. Detta experiment får ni dock inte utföra själva, utan det är redan gjort på viruslaboratoriet. Följande kursiva text (och illustrationen på sidan 17) beskriver hur experimentet har gått till: Samma mängd herpesvirus sätts till brunnarna på en 6- hålsplatta med konfluenta GMK- celler och inkuberas. Efter en timme skördas cellerna i första brunnen, efter sex timmar i nästa och så vidare, vid tidpunkterna 12, 24 och 48 timmar. Vart och ett av dessa prov innehåller en okänd mängd virus. Proverna med okänd mängd herpesvirus späds i spädningsserier om tiopotenser, beroende på vid vilken tidpunkt i odlingen de skördades. Generellt kan sägas att tidiga prover, när viruset i de infekterade cellerna inte har hunnit föröka sig så mycket, späds mindre än sena prover. Exempelvis kan spädningen 10-1, 10-2 och 10-3 användas på prov som odlats i en timme, medan prov som odlats i 48 timmar snarare späds 10-4, 10-5 och Beteckningen 10-6 anger att provet har spätts 10 6 gånger, dvs. är gånger svagare än ursprungsprovet. Efter spädning sätts 0,5 ml per brunn av proverna på nya 6- hålsplattor med GMK- celler. Efter ca en timme, då virus har bundit till cellerna, tillsätts metylcellulosa, som gör att viruset inte kan spridas vidare fritt i mediet, utan bara sprider sig från cell till cell. Slutligen inkuberas plattan i tre dygn i CO 2 - termostat och färgas därefter med kristallviolett för att man tydligt ska kunna urskilja de virusplack * som har bildats. 15

16 16

17 Räkning av plack Anteckna er egen spädningsserie i bilden på föregående sida. 1. Räkna antalet virusplack i den 6- hålsplatta som är färgad med kristallviolett. Använd 4 - objektivet och tag hjälp av de horisontella stödlinjerna. Välj en lämplig koncentration virus; plackantalet bör vara minst 50. Räkna båda brunnarna och beräkna ett medelvärde. Antal plack:... st. 2. Beräkna också virustitern i provet och ange den i Plaque Forming Units (PFU)/mL. PFU/mL är ett mått på hur många infektiösa viruspartiklar per volymsenhet, som provet innehåller. Ett värde på 1 PFU/mL anger således att den mängd infektiösa viruspartiklar finns i provet, som behövs för att bilda ett plack; infektera en cell, reproducera i den och slutligen döda värdcellen. Virustiter:... PFU/mL Övriga celler/virus att studera Använd gärna olika förstoringar och rör på plattan/flaskan så att ni ser på celler i olika delar av odlingskärlet. Att tänka på när ni tittar på cellerna: Hur ser de ut? Hur växer de? Vad är skillnaden mellan epitelliknande och fibroblastliknande? Plattor märkta med KOS respektive MP innehåller två olika herpes simplex typ 1- virus: ett som ger vanliga plack och ett som ger syncytieplack *. Beskriv skillnaden! Titta också på SP2/0- och Hum- cellerna. Lite information om dessa celler är samlad i tabellen på sidan 12. SP2/0- celler växer i suspension men kan binda in löst till flaskan. Skaka därför på flaskan några gånger innan ni tittar på cellerna. Hum- celler växer (liksom GMK- celler) fastsittandes på flaskans botten. Redovisa och skriv upp dig på listan! 17

18 Plack Syncytium Oinfekterad cellmosaik Falsk kontaminering; celler i fokus respektive kontaminering i fokus. 18