Undersökning av jonvätskematrisers detektion på olika typer av MALDI-plattor

Transkript

1 EXAMENSARBETE INOM KEMITEKNIK, GRUNDNIVÅ STOCKHOLM, 06 Undersökning av jonvätskematrisers detektion på olika typer av MALDI-plattor Erik Börjesson KTH Royal institute of technology KTH KEMIVETENSKAP

2 EXAMENSARBETE Högskoleingenjörsexamen Kemiteknik Titel: Engelsk titel: Undersökning av jonvätskematrisers detektion på olika typer av MALDI plattor Detection of ionic liquid matrices on various MALDI plates Sökord: MALDI, Matris, Peptid, ILM, DHB Arbetsplats: Analytisk kemi, KTH Handledare på KTH: Leila Josefsson Student: Erik Börjesson Datum: Examinator: Catharina Silfverbrand Lindh

3 Sammanfattning Examensarbetet gjordes för att undersöka om det istället för,5-dihydroxidbensoesyra fanns en jonvätskematris som hade en lika bra eller bättre detektionsgrad. Examensarbetet undersökte också om det var någon detektions skillnad på stål- och koncentrationsplatta när analysmetoden matrisassisterande laser desorption-jonisation-masspektrometri (MALDI-MS) analysmetod används. Jonvätskematris är en matris som binder till en svag bas och är till för att skydda peptiderna från addukter. Baserna som undersöktes var etylamin, dietylamin, diisopropylamin och N,N-etyldiisopropylamin. Examensarbetet jämförde matrisen med jonvätskematriserna som alla var upplösta i etanol, vatten eller en vätskeblandning (TA 30) (0, % trifluorättiksyra i vatten och acetonitril i 7:3 volym). Det utfördes tester genom att matrisen och jonvätskematriserna blandades med en peptidblandning innehållande åtta stycken peptider. Blandningen deponerades på en stål- och en koncentrationsplatta. Efter att blandningen hade torkat på plattorna och bilde till kristaller eller en vätskefilm placerades plattorna i MALDI-apparaturen. Testerna utvisade att N,N-etyl diisopropylamin blandningen i etanol och vätskeblandningen var bättre än,5-dihydroxybenzene på att detektera antalet peptider på koncentrationsplattan. Det visades att etylamin och dietylamin hade samma detektiongrad som,5-dihydroxidbensoesyra i etanol och vatten vid detektion av antal peptider på koncentrationsplattan. En detektionsskillnad fanns mellan stål- och koncentrationsplatta. plattan var bättre på att detektera tyr-bradykinin. Vid vidare studier på området skulle testerna utföras på stålplatta för att detektera tyr-bradykinin och resterande peptider på koncentrationsplatta. Vid vidare studier skulle TA 30 och etanol som lösningsmedel användas och matriserna ska upplösas i molkoncentration istället för vikt-koncentration, för att få en mer jämförbar detektion. 3

4 Abstract This degree project was made to examine if there was a better ionic liquid matrix instead of the matrix,5-dihydroxybenzene. The aim of the project was also to investigate if there were any detection differences between anchorchip and groundsteel plate when testing matrix assisted laser desorption ionization masspectrometry (MALDI-MS). An ionic liquid matrix is a matrix that binds to a base used to protect the peptides from adducts. In the degree project,5-dihydroxybenzene was compared with the ionic liquid matrices which is,5-dihydroxybenzene combined with a base. The bases were ethylamine, diethylamine, diisopropylamine and N,N- ethyldiisopropylamine. All matrices were dissolved in ethanol, water or a liquid mix (0, % Trifluoroacetic acid in water and acetonitril in 7:3 volume). The tests were performed by mixing the matrix and the ionic liquid matrices with a peptide mix which contained 8 types of peptides. The matrix/ionic liquid matrices and peptide mix was deposited on a ground steel and anchorchip MALDI plate. After the mixture had evaporated and transformed to crystals/film, the plates were put in MADLI equipment. The results showed that N,Nethyldiisopropylamine in ethanol and liquid mix had better detection than,5-dihydroxybenzene. Ethylamine and diethylamine had the same detection as,5-dihydroxybenzene in ethanol on anchorchip plate. There were detection differences between the anchorchip and ground steel plate. In favor of ground steel plate when detecting tyr-bradykinin, but for detecting the rest of the peptides anchorchip is favorable. If further studies would be performed in this area it would be done in the liquid mix and ethanol as solvent. For more comparable detection results the matrices concentration should be in mol/l instead of g/l. 4

5 Förkortningar ACN DHB DHB-EA DHB-DEA DHB-DIPA DHB-DIPEA ILM MALDI S/N TA 30 TFA m/z TOF acetonitril,5-dihydroxidbensoesyra,5-dihydroxidbensoesyra -etylamin,5-dihydroxidbensoesyra -dietylamin,5-dihydroxidbensoesyra - diisopropylamin,5-dihydroxidbensoesyra - N,N-etyl diisopropylamin Jonvätskematris Matris assisterande laser desorption/jonisation Signal-brus förhållande Blandning av 0,% trifluorättiksyra i vatten och acetonitril i 7:3 volym Trifluorättiksyra Kvot mellan massan av analyten och analytens laddning Time of flight 5

6 Innehåll. Inledning/bakgrund.... Syfte....3 Mål....4 Avgränsningar....5 Förväntningar... Teknisk bakgrund.... MALDI.... Time of flight Matris Fördelar Nackdelar Genomförande Instrument Tillvägagångssätt Felkällor Resultat och diskussion Slutsats... 6 Källförteckning... 7 Bilaga Uträkningar... 8 Bilaga Råvärden... 6

7 . Inledning/bakgrund Matris assisterande laser desorption-jonisation-masspektrometri (MALDI-MS) är en masspektrometrimetod som är mest lämplig för organiska och biologiska ämnen för att MALDI:n klarar av analysera ämnena utan att fragmentera. Exempel på ämnen som MALDI metoden analyserar är aminosyror, peptider, proteiner och DNA. MALDI metoden görs genom att analyten som ska undersökas blandas med en matris eller jonisk vätska matris på en MALDI platta. Matrisen/jonisk vätska matris gör att ämnet som analyseras blir laddad antingen med en positiv/negativ laddning. Plattan placeras i en MALDI apparatur där plattan placeras i ett vakuum som strålas av en laser för att transformera vätskan till gasform. [] MALDI:n använder Time of flight (TOF) som en massanalysator. TOF är en massanalysator teknik där analyten separeras med hjälp av tiden, laddningen och massan. En utförligare beskrivning om hur transport tiden fungerar kan läsas i kapitel. under teknisk bakgrund. Examensarbetet gick ut på att undersöka om olika jonvätskematris (ILM) kan ha lika bra eller bättre detektionsgrad än,5-dihydroxidbensoesyra (DHB) vilket skulle kunna leda till att DHB ersätts med en ILM. ILM:en hade i uppgift att skydda analyten från addukter och oxidationer som kan påverka analyten. En uppgift var även undersökt om det finns någon detektions skillnad mellan olika typer av plattor eftersom kristallisationen kan ha olika former på de olika plattorna.. Syfte Syftet med examensarbetet var att undersöka olika ILM och matrisers detektionsgrad av peptider på olika MALDI plattor. Syftet var även att undersöka om det existerar en bättre ILM än DHB. Om ett bättre alternativ kan påvisas kan MALDI analysmetoden förbättras..3 Mål Målet med examensarbetet var att testa ILM med matriser på olika MALDI plattor. Från testerna ska slutsatser dras om någon ILM har bättre detektionsgrad av peptider än DHB som finns på marknaden. Om det kan påvisas att en ILM är bättre än DHB bör vidare forskning ske på ILM:et..4 Avgränsningar I examensarbetet gjordes följande avgränsningar: Plattor som undersökts var stål- (Figur ) och koncentrationsplatta (Figur ). Vid examensarbetet användes matrisen,5-dihydroxidbensoesyra (DHB). Examensarbetet begränsades till baserna Etylamin (EA), Dietylamin (DEA), Diisopropylamin (DIPA) och N,N-etyl Diisopropylamin (DIPEA). När baserna blandades ihop med DHB uppstod följande ILM. ILMen är DHB-EA, DHB-DEA, DHB-DIPA och DHB-DIPEA. Analyten som användes var en peptid blandningen som innehöll: 5 µm av Angiotensin I, Angiotensin II, GLU-fibrinopeptid B, Leucine enkelphalin, Neurotensin, Somatostatin 8 och Tyr-bradykinin samt 7,5 µm Substans P

8 Figur. Bild på stålplattan Figur. Bild på koncentrationsplattan.5 Förväntningar Förväntningarna innan laborationerna genomfördes var att koncentrationsplattan skulle vara bättre än stålplattan eftersom kristallerna på koncentrationsplattan är mer visuellt kompakta än på stålplattan. Eftersom kristallerna är visuell mer kompakta, antas att en bättre detektionsgrad uppnås för koncentrationsplattan än på stålplattan Teknisk bakgrund. MALDI En MALDI-analys görs genom att först hitta en lämplig matris för vilken typ av analyt som ska analyseras, för att analysen ska ha så bra förutsättningar som möjligt och inte fragmentera. Matrisen löses upp i vatten, ett organiskt lösningsmedel eller en blandning av vatten och organiskt lösningsmedel som matchar analytens lösningsmedel. Till lösningsmedlet tillsattes en sur lösning för att ge matrisen en laddning. Analyten antingen blandas med matrisen innan deponering eller blandas på plattan. [] Efter att analyt och matris applicerats på MALDI-platta, avdunstar lösningsmedlet och analyt/matris blandningen bildar kristaller eller en vätskefilm. Plattan placeras i MALDI-apparaturen (Figur 3) i ett vakuum. I MADLI apparaturen beskjuts kristallerna på plattan med en laser. Lasern ger den mängd energi som krävs för att kristallen ska omvandlas till gas. Analytgasen accelereras av ett elektriskt fält mot en detektor. Detektorn skickar information till datorn som skapar ett spektrum.

9 Figur 3. Bild på MALDI apparaturen. Time of flight Time of flight (TOF) metoden är en vanlig massanalysator (Figur 4). TOF betyder att analytgasen delas upp i masstorlek med hjälp av tiden det tar för analyt-jonerna att färdas en fast sträcka. Tiden som det tar för jonen att färdas är beroende på massan (m) av jonen samt laddningen (z) av jonen. Jonerna kan ha olika laddningar. Signalen som kommer ut från detektorn är en kvot mellan massan och laddningen (m/z). [3] Analytgasen som bildas transporteras av ett elektromagnetisktfält till en detektor. Det finns två typer av inställningar på apparaturen; första är den linjära inställningen där analyten färdas direkt till en detektor. Den andra inställningen är den reflekterande inställningen där analyten färdas till detektor genom att analyten träffar en elektrostatisk spegel som reflekterar analyten mellan provytan och detektorn. I den reflekterande inställningen existerar en elektrostatisk spegel för att förlänga sträckan som gör att TOF tiden blir längre vilket ger förbättrad upplösning. [] Den linjära inställningen används för att det krävs mindre energi och större joner kan inte färdas den reflekterande inställningens strecka. Laser Detektor och Elektrostatisk spegel Elektriskt fält Peptider på platta Detektor 3

10 Figur 4. Schematisk bild av innanmätet på MALDI-TOF.3 Matris Anledningen till att en viss matris används är matrisens struktur och intermolekylära bestämda fysikaliska egenskaper exempelvis lösligheten i olika lösningsmedel, värmestabilitet och så vidare. En matris som kan användas för MALDI är antingen en oorganisk anjon eller organiska katjon/anjon salt. Matrisens funktion i MALDI processen är att ge analyten en laddning och att absorbera energin från lasern för att omvandla analyten från kristallform till gasform. [3] Vid kristallisationen kan matris och peptidblandningen bilda olika typer av konfigurationer exempelvis stavar, film, ringar o.s.v. En ILM är blandning mellan en matris och en svag bas. Den svaga basen i en ILM tillförs för att hålla bort addukter och förbättra detektionen av analyten. [4] Addukter är joner som binds till analytjonerna. Addukterna som förekommer mest är kalium och natrium. Peptiden kan även oxidera då peptiden binds till ett syre. MALDI plattorna är alltid gjorda av stål och kan ha olika stora testytor. MALDI plattorna kan ha en typ av beläggning. Beläggningen kan bidra till att kristallisationen/filmen ser olika ut jämfört med andra beläggningar, därför testas olika plattor med olika typer av beläggningar. Exempel på en MALDI platta är koncentrationsplattan (Figur ) som har en testyta som varierar i storlek och har en koncentrations punkt för att koncentrera kristallerna/filmen..4 Fördelar Analysmetoden använder små mängder av analyt och matris, vilket innebär att analysprocessen kräver en liten mängd kemikalier. [] MALDI har en hög känslighet, är enkel att använda och tar kort tid per analys vilket gör att testerna i MALDI blir effektiva och snabba. [4] MALDI processen gör en så kallad mjuk laddning som innebär är att ladda kemikalierna utan att orsaka molekyler instabilitet som kan leda till fragmentering. [5].5 Nackdelar Problemet med MALDI-analysmetoden är att det vid kristallisationen kan det bildas olika typer av konfigurationer, exempelvis stavar eller ringar. Konfigurationerna av kristallerna är inte homogena över testytan vilket kan leda till så kallade hot-spots.[] Hot-spots är således positionen på provytan där en större mängd analyt samlas än andra positioner på testytan. Varje gång ett prov beskjuts kan analysprocessen ge olika resultat på samma prov. Ett annat problem är att om laserns intensitet (styrka) är för hög kan analytmolekylerna fragmenteras eller/och provet bränna bort.[6] En annan nackdel är att addukterna som binds till peptiden kan förändra svaren eftersom molekylmassan kommer att ändras. 3 Genomförande 3. Instrument MALDI apparaturen var en Reflex III (Brukers, Bremen, Tyskland). Allt vatten i laborationerna var vatten som producerades från en Synergi 85 (renlighet 8, MΩ) (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland). 3. Tillvägagångssätt En kalibrering behövs när en analys skall köras för att veta vilken peptid som är vilken. En kalibrering gjorde genom att tillsätta en standard som liknade analyten med känd massa. Var analyten inte känd behövs en standard som liknar analyten. Om en känd analyt används kan en inbyggd kalibrering från apparaturen utnyttjass. Vid examensarbetet använder en känd analyt och den inbyggda kalibrering. 4

11 Matrisen och ILM:en vägdes upp och löstes upp i vatten och etanol i varsin sluten behållare som blev stamlösningar med en koncentration på 40 mg/ml. Stamlösningarna som användes för att tillvärka lösningar med 0 mg/ml. Samma sak gjordes för etanollösningarna. En ytterligare utspädning gjordes med en s.k. TA 30 (0, % trifluorättiksyra (TFA) i vatten och acetonitril (ACN) i 7:3 volym). En blandning av matris 0 mg/ml lösning och peptid blandning med förhållandet : gjordes och blandningen deponerades på 4 punkter på antingen en koncentrations- eller stålplatta. Försöken gjordes med tre olika lösningsmedel TA 30, vatten och etanol. För varje lösningsmedel testades DHB och ILMerna. Matriserna testades på två olika plattor stål och koncentrationsplatta. Alla försök upprepades gång och totalt blev det 60 olika försök. platta och stålplattan placerades i apparaturen och testades med en av punkterna för varje matris, lösningsmedel och typ av platta i kombination med olika laserintensiteter för att få en detektion. När detektion hade hittades användes samma laserintensitet på alla andra punkter för samma matris, lösningsmedel och typ av platta och kombination. På varje testyta sköts 50 skott i tio omgångar med 500 skott totalt av en laser. För varje punkt sammanfogades informationen om detektionsvärdena ihop från alla skott. [7] Värdet från 3 punkter utlästes till ett medelvärde. Den punkten som användes för testerna av laserintensiteten uteslöts för att analyten kunde ha förstörts vid testningen. Två omgångar gjordes för varje kombination av platta, lösningsmedel och matris med två till fyra dagars mellanrum mellan varje test. Detektion gjordes för varje peptid samt addukt och oxidationsprodukternas molekylvikt (Tabellen ) med ±,5 molvikt. Uträkningsexempel för medelvärde och standard avvikelse kan ses i Bilaga. Tabell. Peptidersvikter samt peptidernasvikt med addukter och oxidations vikter.[8] Peptid Molekylvikt Natrium addukt Kalium addukt Oxidation Angiotensin Angiotensin GLU-Fibrinopeptid B Leucine enkelphalin Neurotensin Somatostatin Substans P Tyr-bradykinin Felkällor Under undersökningen uppstod mekaniska fel då MALDI-maskinen kalibrerades om, som ledde till att omkalibrering behövdes göras vid flera tillfällen. MALDI-programmet kunde endast kalibreras efter proteinerna Angiotensinet, Angiotensinet och GLU-Fibrinopeptid B. Det ledde till att resterande proteinerna låg på andra ställen i diagrammet. Vilket ledde till att det inte gick att urskilja om de upphittade peptiderna var rätt eller fel och/eller fragmenteringar. MALDI-programmet sparade ibland inte heller summan av skjutningarna på varje punkt, vilket gjorde att vissa tester behövde göras om. 4 Resultat och diskussion Det visas ett exempel (Figur 5) på ett överskådligt spektrum med alla peptider. Figur 6 visar dessutom hur ett spektrum (Figur 6) på peptiden angiotensin I samt addukter. Vissa peptider hittades bara med 5

12 addukter. Ett exempel var att Leucine enkelphalin oftast hittades med natrium addukt. MALDIapparaturen använde informationen från spektrumen för att kalkylera fram S/N, intensiteten osv. Peptiderna/addukterna hittades om medel S/N-värdet 3. S/N medelvärdena för de peptider och addukter som hade störst intensitet användes samt vilken typ av peptid eller peptid med addukt som var störst (Bilaga Tabell 4). Det utvisade också hur stor den totala intensiteten var och hur många procent av den totala intensiteten var addukter för de olika kombinationerna av omgångar, lösningsmedel, plattor, matriser och peptider (Bilaga Tabell 4). Ett annat sätt att avgöra hur bra ILM:en jämfört med DHB var att korrelera S/N-värden mot varandra. Figur 5. Spektrum för 8 peptider och DHB i TA 30 på koncentrationsplatta. Figur 6. Spektrum inriktat på angiotensinet I med DHB i TA 30 på koncentrationsplatta med addukterna natrium och kalium. 6

13 Färgförändring under genomförandet inträffade i flera fall mellan försök och som kunde ha påverkat detektionen. DHB-EA, DHB-DIPA och DHB-DIPEA i vatten hade en genomskinlig färg som förändrades till en brunröd nyans. För DHB-EA i vatten skedde ingen förändring på detektionen efter färgförändringen på koncentrationsplattan. DHB-DIPA och DHB-DIPEA i vatten hade en bättre detektionsgrad efter färgförändringen endast på stålplattan. DHB-DEA i etanol hade en genomskinlig färg som förändrades till en gul nyans, där skedde ingen förändring av detektionen. DHB-EA etanol hade en genomskinlig färg som förändrades till en rosa nyans, upptäcktes en förbättring av detektionen på stålplattan. Resterande lösningar hade ingen färgändring under genomförandet. Färgförändringen kunde ha indikerat att ILM:erna förändrats eller att ILM:erna hade degenererat i lösningsmedlen. Resultatet utvisade (Figur 7, 8 och 9) hur många av peptiderna och addukter som återfanns i de olika lösningsmedlen. TA 30 DHB-DIPEA DHB-DIPEA DHB-DEA DHB-DEA DHB-DIPA DHB-DIPA DHB-EA DHB-EA DHB DHB Antal Peptid Addukt Figur 7. Antal peptider som hittades i TA 30. Den övre stapeln i tabellen var försök nummer två och den undre var försök nummer ett 7

14 Vatten DHB-DIPEA DHB-DIPEA DHB-DEA DHB-DEA DHB-DIPA DHB-DIPA DHB-EA DHB-EA DHB DHB Antal Peptid Addukt Figur 8. Antal peptider som hittades i vatten. Den övre stapeln i tabellen var försök nummer två och den undre var försök nummer ett. Etanol DHB-DIPEA DHB-DIPEA DHB-DEA DHB-DEA DHB-DIPA DHB-DIPA DHB-EA DHB-EA DHB DHB Antal Peptid Addukt Figur 9. Antal peptider som hittades i Etanol. Den övre stapeln i tabellen var försök nummer två och den undre var försök nummer ett. Peptiderna och addukterna återfanns om S/N medelvärdet var 3. I lösningsmedlet TA 30 hade DHB- DIPEA bättre detektion än DHB på koncentrationsplatta, dock hade DHB-EA, DHB-DEA och DHB- DIPA inte lika bra detektion (Figur 7) som DHB. Resultaten utvisade (Figur 8) att varken DHB-EA, DHB-DEA, DHB-DIPA och DHB-DIPEA i vatten hade samma detektion som DHB. DHB-DIPA och DHB-DIPEA i etanol (Figur 9), hade bättre detektion än DHB samt att DHB-EA och DHB-DEA hade lika bra detektion som DHB. Resultatet utvisade att för DHB-EA, DHB-DEA, DHB-DIPA och DHB- 8

15 DIPEA kunde en lägre laserintensitet (Tabell ) uppnås när TA 30 används som lösningsmedel jämfört med vatten och etanol. Tabell. Procentenheter av den totala laserintensiteten som MALDIn kan göra för alla försök TA 30 Laserintesitet på stålplatta Laserintesitet på koncentration DHB DHB DHB-EA DHB-EA DHB-DIPA DHB-DIPA DHB-DEA DHB-DEA DHB-DIPEA DHB-DIPEA Vatten Laserintesitet på stålplatta Laserintesitet på koncentration DHB DHB DHB-EA DHB-EA DHB-DIPA DHB-DIPA DHB-DEA DHB-DEA DHB-DIPEA DHB-DIPEA Etanol Laserintesitet på stålplatta Laserintesitet på koncentration DHB DHB DHB-EA DHB-EA DHB-DIPA DHB-DIPA DHB-DEA DHB-DEA DHB-DIPEA DHB-DIPEA DHB Tyr-bradykinin upphittades med ett högt S/N värde på stålplattan med DHB när TA 30 användes som lösningsmedel jämfört med alla andra tester. (Tabell 3). Det kunde bero på att laserintensiteten var för hög så att Tyr-bradykinin fragmenterades. Därför visade resterande tester ett lågt eller inget S/N-värde. 9

16 Tabell 3. Tyr-bradykinins S/N värdet för alla kombinationer och försök Lösnings medel Matris Platta Försök Tyr-bradykinin S/N värde DHB 56, DHB-EA TA 30 DHB-DIPA DHB-DEA DHB-DIPEA - - 3,5 - DHB Vatten DHB-EA DHB-DIPA

17 DHB-DEA - 3,7-3,4 DHB-DIPEA DHB - 4,7 - - DHB-EA Etanol DHB-DIPA - - 3,8 - DHB-DEA DHB-DIPEA En detektionsskillnad mellan koncentrations- och stålplattan kunde påvisas för tyr-bradykinin i lösningsmedlet TA 30. Detektionen var tydligare på stålplattan med DHB i TA 30 vid detektionen av tyr-bradykinin (Tabell 3). Det kunde bero på att en högre laserintensitet behövdes på koncentrationsplattan för att ge tillräckligt med energi för att transformera kristallerna till gasform. Vid en visuell undersökning var kristallerna mer kompakta på koncentrationsplattan än på stålplattan. Minskande av laserintensiteten kan vara avgörande om tyr-bradykinin ska kunna hittas med högre detektionsvärde. Detektionen skulle kunna vara mer rättvisande om matriserna var upplöst i molkoncentration istället för mass-koncentration under testerna.

18 5 Slutsats Matriserna DHB-EA, DHB-DIPA och DHB-DEA hade lika bra detektionsgrad som DHB i etanol dock hade DHB-EA, DHB-DIPA och DHB-DEA sämre eller lika bra detektion än DHB i TA 30 och vatten. DHB-DIPEA hade bättre detektionsgrad än DHB när etanol och TA 30 användes som lösningsmedel och sämre detektion än DHB i vatten. Vid vidare forskning med DHB-EA, DHB-DEA, DHB-DIPA och DHB-DIPEA bör etanol användas för att erhålla bättre detektion och TA 30 användas för att få lägre laserintensitet. Vid vidare studier bör matriserna upplösta i mol-koncentration istället för vikt-koncentration för att möjliggöra en rättvisande jämförbar detektion.

19 6 Källförteckning [] K. Strupat, M. Karas, F. Hillenkamp, 99-,.5-Dihydroxybenzoic acid: a new matrix for laser desorption ionization mass spectrometry, 99-, International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, vol., pp. 89-0, Doi: ( 0.06/ ( 9 ) v ) [] Martin Kussmann, Martin RLarsen, Johan Gobom, et.al., , Matrix-assisted Laser Desorption/Ioniztion Mass Spectrometry Sample Preparation Techniques Designed for Various Peptide and Protien Analytes, Journal of Mass Spectrometry, vol 3, Issue 6, pp Doi: 0.00/(SICI) (99706)3:6<593::AID-JMS5>3.0.CO;-D [3] Jing-Jing Xu, Rui Yang, Li-Hong Ye, et.al., , Application of ionic liquids for elution of bioactive flavonoid glycosides from lime fruit by miniaturized matrix solid-phase dispersion, Food chemistry, vol. 04, pp doi:0.06/j.foodchem [4] Andreas Tholey and Elmar Heinzle, , Ionic (liquid) matrices for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-application and perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry, Volume 386, Issue, pp 4 37, Doi: 0.007/s [5] Neelja Singhal, Manish Kumar, Pawan K. Kanaujia, Jugsharan S. Virdi, publicerad , Frontiers in microbiology, MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis, elektronisk artikel, använd , senaste besökt Doi: /fmicb Url. [6] Jeffrey A. Crank and Daniel W. Armstrong, 009-0, Towards a Second generation of ionic liquid matrices (ILMs) for MALDI-MS of Peptides, Proteins and Carbohydrates, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, vol. 0, Issue 0, pp , Doi:0.06/j.jasms [7] Kanjana Wiagnon and Rainer Cramer, 05, Sample Preparation: A Crucial Factor for the Analytical Performance of Rationally designed MALDI Matrices, Analytical chemistry, vol. 87, issue 3, pp , Doi: 0.0/ac5044p [8] Sigma-aldrich, Peptidernas molekylvikt, alla var hämtade Angiotensin Angiotensin 3&interface=CAS%0No.&N=0+&mode=partialmax&lang=en&region=SE&focus=product GLU-Fibrinopeptid B 3

20 Leucine enkelphalin Neurotensin Somatostatin 8 Substans P Tyr-bradykinin [9] Daniel C. Harris, 00, Quantitative chemical analysis 8 th ed. Houndmills, Basingstoke RG 6XS, England 4

21 7 Bilaga Uträkningar Standardavvikelse[9] S = (x i x ) n Tar exempel från TA 30 DHB Angiotensin I försök : 3 Punkter Tog bort punkter som inte gav något värde Medelvärdet var x, n var antal punkter och x i var enstaka punkter x = Standard avvikelsen = 33, S= (((38-33,) +(30-33,) +(5-33,) +(85-33,) +(6-33,) +(7-33,) +(84-33,) +(89-33,) +(4-33,) +(50-33,) +(5-33,) )/(-))= 57 5

22 Tyr-bradykinin Substans P Somatostatin 8 neurotensin Leucine enkelphalin GLU- Fibrinopeptid B Angiotensin II Angiotensin I Försök Platta Matris Lösningsmedel DHB TA 30 DHB-EA 8 Bilaga Råvärden Tabell 4. Medelvärde, standardavvikelse, typ, total intensitet och koncentration av addukter för all kombinationer. Förkortningar P = peptid, NA = Natrium addukt, K = Kalium addukt, O = oxidation. Medelvärde = mean, Standardavvikelse = SD, Total intensitet = Tot, av addukternas intensitet genom den totala intensiteten (%) = Ratio Mean 33, 7,3 6,5 73,9 73,9 44,9 7,7 56,5 SD 57 33,6,5 50,9 50,9 30, 4,4 53,3 Typ P P P NA NA P P P Tot , ,9 36 Ratio 9,5 0 7,8 70, 49,6 34, 0,4 Mean 75,9 5,6 4,3 4,3 3,5 5,6 8,5 3 SD 9, ,8, 0,8,8,6 0 Typ P P P NA NA P NA P Tot ,3, , 67 Ratio , ,6 40,5 9,7 0 Mean 93,6 63,6 6, 3, 4,3 4 4,8 - SD 63,7 45,3 44,8 0,4,3 0 0,9 Typ P P P K P P O Tot , 56, , Ratio 3,7 4, 3,7 89,7, Mean 84,8 54,8 56, 5 4 8,3 4,6 - SD 90,4 70,4 7,4,9 0,8 30,9,7 Typ P P P NA P P NA Tot ,5 375, 66,7 87, Ratio 0,7 4, 3, 00 33, 7,8 00 Mean 76,5 3,, ,3 3,7 - SD 4,8 35,3 8, 6,4 0,5 Typ P P P P NA Tot ,8 39 Ratio,4 7,4 48, 00 Mean 93,4 7, 77, - 8 5, 3,7 - SD 38,5 40,4 4,9,3 0,7 Typ P P P O O NA Tot ,4 3 Ratio 39,3 36,5 46,8 57, Mean 37,4 47, 54,4 4, 4, 5 3,7 4 SD ,4, 0,5 0 0,5 Typ P P P K O P O P Tot 5, ,5 4 5,3 50,5 Ratio 3,5 36,5 4, Mean 43,4 53,8 70,8 4,9 4,9 3 4, - SD 8, 30,6 39,, 0 Typ P P P K P P K Tot ,4 548, 7 83,4 9 Ratio 37,9 37, 43,4 65, 33,

23 DHB-DIPA DHB-DEA DHB-DIPEA Koncentratio n Mean,7 9,3 5,3 5, SD 4, 8,8 5,8 Typ P P P NA Tot Ratio 6, 5, Mean 66,3 0,7 35, ,7 - SD 6,7 30,7 39,4-0,9 Typ P P P NA K Tot , 7 Ratio 6, 5,8 3, Mean 46,8 59,8 58, SD 35 38,3 40,4 0,8 Typ P P P P P Tot Ratio 39,6 4 5,9,5 0 Mean 5 7,4 84,9 4, SD 30,6 50, 63,6, 0,8, Typ P P P NA P O Tot ,3 Ratio 3,9 33,5 40,5 88,9 66,7 00 Mean 4,5 5,7 0,8 6, SD 7 7, 9,8,9 Typ P P P NA Tot , Ratio 5,3 4,8 6,9 00 Mean 35,8 39,5 4, 3,7 4,6 4 4,8 - SD 3,6 5, 7,7 0,5,4,,9 Typ P P P NA P P O Tot , 6 Ratio 35,8 3, 37, , 0 00 Mean 49,3 64, 64,5 5,4 5,5 3,5 4,4 3 SD 3,3 35, 5,5 0,5,7 0,5 0,5 0 Typ P P P NA O K NA P Tot ,4 398, 35 4,4 64 Ratio 40 37,6 46, , Mean 3, 4,8 38,3 4, SD 5,4 8 3,3 0,5,7 0 0 Typ P P P NA P P P Tot ,8 3, Ratio 38,8 3,4 4,8 60 5, Mean 8 0,5 6, SD,3,7,5,3 Typ P P P O Tot 58, 865,8 496,9 93 Ratio 4, 38,4 4,4 00 Mean 53, 77,8 65,4 7,3, SD 6, 39, 40,9, 0,6 Typ P P P NA O K Tot ,3 495, 44, 5 Ratio 34,9 34,5 37, ,7 00 Mean 48,5 76,8 47,6 5, 5, ,5 SD 7,6 90,5 74 5,5,4 0,8 0,5 Typ P P P P P P O P Tot , 7 9,7 407,

24 DHB Vatten DHB-EA DHB-DIPA Ratio 7,3 7,7 33,6 68,8 58,8 6, Mean 07,8 3,9 9,8 4,7 5, SD 75,4 9, 66 0,7,8 0 0,9 Typ P P P P P P O Tot ,5 704, , 6 4 Ratio 30,9 30,8 36,9 50 4, Mean 96,7 7,8 75,4 5 4,4-6 - SD 83, ,,5 4,7 Typ P P P P NA NA Tot , 8, 33,4 Ratio 3,7 3, 33,4 5,8 5,3 59,9 Mean 6, 40,7 95, 46,5 4,3 57,6 4,8 - SD 67 8,4 33,7, 5,9,3 Typ P P P P O P P Tot ,5 05, 46 Ratio 6 5,9 8,3 49, Mean 60,8 98,5 7, 4,6 9,3 33 5, - SD 58, 6,7 63,5,4 3,6 4,, Typ P P P NA O P O Tot Ratio 35, 38, 38,7 96,3 60, 7, 00 Mean 53,3 84,8 03,6 3,9 6, 3,8 4,4 - SD 45,4 49,3 9,9,6, 0,9,4 Typ P P P NA O P NA Tot , , 8 Ratio 8,4 30, ,7 8,5 00 Mean 3,7 5 -, SD 0, 0,7 Typ P P NA Tot ,8 Ratio 36, 0 73,4 Mean 5 3,4 37,8 3, SD 4,9 7,7 3,9 0,7 0 Typ P P P P O Tot , 78 Ratio 3 4, 44,9 39,6 00 Mean 4,3 8,3 6, SD 0,4 7, 4,7 0 Typ P P P NA P Tot 388,8 477,8 856,8 09,5 94 Ratio 8,3 3,3 47, 00 0 Mean 35, 64, 63, 4 3,8-4 - SD,9, 6,7 0 0,4 0 Typ P P P K P O Tot Ratio 34,8 33,4 44, , 00 Mean 8 6-7, SD 0,7 0 0,8 Typ P P NA Tot 444, ,8 Ratio 7,6 0 35,4 Mean 4,4 8,6 38, SD 8,7 5,8 5,4 0 0 Typ P P P K P P Tot 44,6 5,9, Ratio 0,3 5,3 0,5 68,

25 DHB-DEA DHB-DIPEA DHB Etanol Mean 35,5 37,7 5,3 8, SD,,4 7,3 0,7 0 Typ P P P K O Tot ,6 67 Ratio 5,3 5,3 60, 50 Mean 0,6 9,4 05,8 4, SD, 39,8 5,7,5 0 Typ P P P K K Tot , 6 Ratio 3,8 9,8 63,8 00 Mean 0,5 6,6 3 6,8 3, SD 5,5 3,5 0 9,9 0,5 Typ P P P NA P Tot 765, Ratio 4,6,6 0 77,8, Mean 9,9 5,5 4, ,3 3,7 SD 4,9 8,3,,4 0,5 0,9 Typ P P P K P NA P Tot 495, 388, 344, ,3 59,3 Ratio 3 3 9,7 78, ,3 Mean 35,5 35, 33,3 4, SD, 3, 9, 0,9 0,9 Typ P P P NA NA Tot ,4 76,6 Ratio, ,5 80 Mean 0,6 45,4 40, 4, ,4 SD, 34, 3 0, ,8 Typ P P P K P K NA Tot 634, ,4 Ratio 8,3,3 8, ,7 60 Mean 7,8 4,5 -, SD 3, 0,5 9,8 Typ P P NA Tot 308, ,4 Ratio 3,7 9,7 88,9 Mean 5,7,4 7,4,8 3,5-3,7 5 SD 4 4,8 9,8 0,5 0,5 0 Typ P P P NA P NA P Tot 74,5 67,6 377, 3,3 54,5 7 6 Ratio 8,4 8,, ,7 0 Mean 8,3 3,4 7, SD 7,9 8, 9, Typ P P P K O NA Tot , Ratio , Mean 6 05,8 67, SD 8,4 5,8 43,5 0 0 Typ P P P K K Tot Ratio 4,7 3, 4, Mean 36,9 0,3 8, 3,5 3 4, 6,6 - SD 7,8 6,6 64, 0,5 0,8 4,3 Typ P P P NA NA P P Tot , ,3 7, Ratio 8,9 4, , ,7 Mean 60, ,5 5,4-93,3 6,8 4,7 SD,8 04,6 34, 5,6 73,6,4 0,5 9

26 DHB-EA DHB-DIPA Typ P P P NA P O K Tot , Ratio 8,7 5, 9,3 00 4, Mean 76,3 54,6 7, 9,3 4,7 64,3 5, - SD 53 44,5 53,9 5,3,7 36,,7 Typ P P P NA P P O Tot , , 3 Ratio 5,8 4, , 00 Mean 4, 07 83, 5,8 3,4 0,3,6 - SD 70 47,4 45,6,7 0,5 4,4,4 Typ P P P NA O P O Tot ,8 08, 667, Ratio 3,6,7 7,5 96,3 80 5, 00 Mean 36,,5 5, 5, SD 34 6,5 3,5 Typ P P P NA Tot Ratio 39,6 3 45,6 00 Mean 47,4 38,4 45,7 4, - 3, 4,5 4 SD 6,5,3 4,8,5 6,8 0,9 Typ P P P NA P O K Tot ,7 9, 08, 8,5 3 Ratio 7,9 3,4 30,5 66, Mean 4, 07,6 94,5 4 3,5 3, 4,4 - SD 44 38,9 4,5 0,8 0,5,, Typ P P P NA P O K Tot ,9 93,3 580,6 93, 6 Ratio 33,3 33, 70, 84,5 0 73, 00 Mean 69,7 6, 6, 3,5 4,3 4,6 4 - SD 37,9 3,7 35 0,5,,7 0,6 Typ P P P K P P O Tot ,7 45,4 9,5 Ratio 3 3,3 40,9 00 0,9 77,3 00 Mean 0, 0,8, SD,6 7,5 8, 0 Typ P P P P P Tot 669,5 33, 386 3,4 5 Ratio 33,4 8,4 3,9 67,4 50 Mean 6,4 48,9 59,7 7,8 3 0,8,7 - SD 3,5, 3,8,6 0 7,8, Typ P P P P O P O Tot , ,6 74,6 Ratio 3,,,3 334, 5, 8,5 80 Mean 7,5 07, 46,,6 3 5,9 6,4 3,8 SD 80,6 9,9 8,9 9,8 0 7,, 0,4 Typ P P P P P P O K Tot ,7 35,5 59, Ratio 6,3 6,6 9,5 3,9 0 8, ,3 Mean 8,7 8, 0,8 6, - 5,9 - - SD 4,4 44,6 4,5 7,6 8, Typ P P P P P Tot ,9 0

27 DHB-DEA DHB-DIPEA s Ratio,6 4, 33,3 63 5,4 Mean 3 7,5 4,5 4, SD 4,9 4,,4, 0 Typ P P P K P Tot 656, 44,8 435,6 38, 8 Ratio 34,5 7,8 4,6 8,8 0 Mean 45,8 30,5 8,4 5, 3,5 8,8 4,8 - SD 59,9 9, 9, 0,5 4,9 Typ P P P NA P P O Tot , 5 457, 48 Ratio 37, 6,3 36,8 80, 0 43, 00 Mean 4 6,8 79,5 4,8 4,3 7,6 5, 3 SD 73, ,8,8 3,8,5 0 Typ P P P K P P O NA Tot ,5 8, 56 87, Ratio 3,9 30, 37,8 80,7 6,9 5, Mean 64,8 76,4 73,3 7,8 4, SD 9,3 8, 9,9 4,6, 9 0 Typ P P P NA P P O Tot , 57,9 7 Ratio 35 33,9 40,3 89,9 5,9 6,9 00 Mean 3,9 3,,4 5, ,5 - SD 9.6 0,8 0,5,5 Typ P P P NA K Tot 63,3 343,3 33,4 46,9 9,5 Ratio 38,8 7 49,6 89,7 00 Mean 63, 35, 09,3 6,3 3,4 8,5 7,5 - SD 67, 54,7 50,4 4,5 0,5 0,6,6 Typ P P P K P P O Tot ,3 357, Ratio 3,5 30,4 36, , 00 Mean 35,6 3 58,8 4,6 4 9,3 3,9 3 SD 65,5 6,5 30,4 9,5,7 3,5 0,8 0 Typ P P P P P P O P Tot , 3 7,4 75, 70 Ratio 7, 9,3 37, 46,3 75 6, Mean 53, 7,5 4, SD 5 7,3 7,9 4,4 0,9 Typ P P P NA P P Tot ,6 Ratio 30,6 3,3 4,8 85,6 0 0