LABORATION MALDI-TOF-MS BIOMÄTTEKNIK HT 2007

Transkript

1 LABORATION MALDI-TOF-MS BIOMÄTTEKNIK HT Voyager Spec #1[BP = , 1486] % Intensity Mass (m/z) Handledare: Cecilia Andresen IFM/Linköpings universitet

2 1. INTRODUKTION LABORATIV DEL... 3 UPPGIFT:... 3 A. Analys av BSA (Bovin Serum Albumin)... 3 B. Analys av trypsinklyvt BSA... 3 TEORETISK DEL... 4 TEORETISK DEL... 5 UPPGIFT:... 5 C. Hämta teoretiskt klyvningsmönster för MTP-wt samt MTP-I128T från Internet... 5 D. Identifiera topparna i utgivna spektrum LABORATIONSRAPPORT... 6

3 1. INTRODUKTION MALDI-TOF-MS är en känslig metod som lämpar sig väl för analyser av biomolekyler. Ex på vad MALDI kan göra: Analysera en teoretiskt obegränsad massa, tyngre än 300,000 daltons (Da). Det som begränsar är provets förmåga att joniseras. Ett helt mass-spectra kan fås från ett enda joniseringstillfälle. Buffrar som används vid den biologiska hanteringen av provet kan oftast användas vilket reducerar behovet av upprening. Analysera blandningar av olika slags molekyler, t ex peptider, oligonucliotider och syntetiska polymerer. Ger hög känslighet samt kräver endast femtomol prov. 1

4 MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION/IONISATION (MALDI) Vid Mass-spectrometri fås massan av en molekyl genom att mäta kvoten massa genom laddning (m/z). För att underlätta jonisering samkristalliseras provet med en lågmolekylär matris som är uv-absorberande. Provet sätts under högt vakuum och energi tillförs med en kvävgaslaser vilket leder till att analyterna går över i gasfas (joniseras). En spänning accelererar sedan de laddade molekylerna mot detektorn. TIME-OF FLIGHT (TOF) TOF fungerar efter principen att joner accelereras med samma potential, från en punkt vid samma initiala tid. Jonerna börjar vandra/flyga i spänningsriktningen och separeras med avseende på dess m/z. Lättare joner flyger snabbare och når detektorn först. Tyngre molekyler vandrar långsammare. 2

5 2. LABORATIV DEL UPPGIFT: A. Analys av BCA (Bovine Carbonic Anhydrase) B. Analys av trypsinklyvt BCA Utförande: Beredning av prov/val av matris: Välj matris Bered matris bered proverna Applicera proverna på en platta Torka proverna 1. Välj matris: Sinapinic acid (3,5-Dimethoxy- 4 hydroxy cinnamic acid) Α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) 2,5-dihydroxybenzoic acid (2,5- DHB) Peptider / proteiner > Da Peptider / proteiner < Da Peptider, neutrala / basiska kolhydrater, polära / icke-polära syntetiska polymerer, små molekyler. 3

6 2. Bered matris: Sinapinic acid: CHCA: 2,5-DHB 10 mg/ml 10 mg/ml 10 mg/ml 700 µl 0,1% TFA 300 µl 0,1% TFA MilliQ-vatten 300 µl acetonitril 700 µl acetonitril Matriserna bereds enligt ovan i eppendorfrör (1.5 ml) och ställs sedan i ultraljudsbad i ca 5 minuter. 3. Förbered proverna: Proverna kan t ex behöva tinas eller avsaltas mha ZipTip. 4. Applicera prov på platta: Det finns flera typer av appliceringsmetoder t ex: Droplet method En droppe, ca 0,8 µl, matris appliceras i en brunn. I den droppen läggs ca 0,8 µl provlösning direkt. Thin layer method Matris appliceras i brunn och får torka. 0,5 µl TFA-lösning läggs sedan på den torkade matrisen varefter analyt tillsätts i droppen. Mixing method Matris och analyt blandas (ca 1:1). 1µl appliceras sedan i brunn. 5. Proverna skall lufttorka på plattan. Analysen sker nu efter manual. 4

7 TEORETISK DEL I denna del av laborationen analyseras proteinet MTP (microsomal Triglyceride transfer protein). En hypotes är att MTP underlättar transport av triglycerider (kroppsfetter) från hjärtat. Detta skulle leda till minskad risk för vissa hjärtsjukdomar. Hos personer där en mutant av MTP har funnits ses en markant ökning av hjärt-kärlsjukdomar. På grund av detta är det intressant att undersöka bl.a. struktur och stabilitet hos vildtyp/mutant samt att jämföra de båda proteinerna. Hos mutanten har aminosyra 128, Isoleucin byts ut mot Threonine. UPPGIFT: C. Hämta teoretiskt klyvningsmönster för MTP-wt samt MTP- I128T från Internet. D. Identifiera topparna i utgivna spektrum. C. Teoretiskt klyvningsmönster 1. gå in på 2. sök efter MTP_HUMAN 3. kopiera aminosyrasekvens: aa klistra in sekvensen i Word. (ta ev bort siffror och blanksteg) 5. Lägg till sex Histidin i N-terminalen (motsvarar en His-tag) 6. Kopiera sekvensen igen. 7. Gå in i nytt Internet-fönster sedan till expasy. 8. Välj Peptide Mass i höger kolumn. (under Proteomics) 9. Klistra in aa-sekvensen 10. Välj GluC (bicarbonate) som enzyme 11. Välj 5 missed cleavages 12. Perform 13. skriv ut 14. Gå tillbaka till punkt 5. Byt ut Isoleucin (I) i position 128 till Threonin (T). (Glöm ej att sekvensen börjar på aa 16 och att sex Histidin har tillsats) 15. Fortsätt med punkt 6-13 D. Identifiering av toppar 1. Skriv i spektrumen vilken aa-sekvens som de olika topparna kan höra till. (obs! gör detta för både wt och mutant) 2. Vilken topp hör till den sekvens där modifieringen sker? 3. Stämmer skillnaden i massa överens med modifieringen? (dvs. de två toppar identifierade i punkt 2). 5

8 3. LABORATIONSRAPPORT i. Skriv en redogörelse för principen med MALDI-TOF-MS. ii. Varför är MALDI en bra metod för identifiering/analysering av proteiner och peptider? iii. Vad är syftet med laborationen? iv. Vad kan metoden användas till? Ge ett par konkreta exempel. v. Bifoga spektrum från laborativa delen. vi. Bifoga spektrum från punkt D i teoretiska delen samt svara på frågorna. vii. Skriv kort skillnader, likheter mellan MALDI-TOF-MS och ESI-MS. Skulle samma experiment kunna göras med hjälp av ESI-MS? 6