UMEÅ UNIVERSITET Klinisk Farmakologi Susanne Westman Kemi Gull-Britt Trogen, Leif Rilfors Labhandledning Naturläkemedel och kosttillskott 6hp Receptarieprogrammet 180hp 2009-03-23 Isolering av eugenol ur kryddnejlika (Caryophylli flos) Utblick Eteriska oljor från växtriket har spelat en stor roll i mänsklighetens historia. De har använts i parfymer, vid matlagning, som antibakteriella substanser eller för andra (verkliga eller förmodade) medicinska egenskaper. Eteriska oljor kan ofta isoleras genom vattenångdestillation av växtmaterialet. Det är främst blommorna eller frukterna/fröna som innehåller de högsta halterna av dessa eteriska oljor och de återfinns vanligen i körtelhår, sekretgångar eller sekretceller. För att oljorna skall kunna utvinnas måste de först extraheras från växtmaterialet. Därför inleds utvinningen oftast med malning av växtmaterialet för att det ska bli mer finfördelat och ge en mer effektiv extraktion, vilket ger ett bättre utbyte. Malningen bör ske omedelbart innan destillationen för att inte förluster genom avdunstning och oxidation av oljorna skall ske. Man har upptäckt att oljornas beståndsdelar ensamma har svårt att diffundera genom växtmaterialets cellväggar men om vatten finns närvarande, löser sig en del av oljan i vattnet och vattenlösningen kan tränga igenom cellväggarna och destilleras av. ljorna kan i närvaro av tillräcklig mängd vatten kontinuerligt utvinnas och det är mer oljornas vattenlöslighet än deras kokpunkter som avgör hur lätt oljorna kan isoleras ur växtmaterialet. m man bestämmer kokpunkten för den olja som först utvinns, finner man att den kan vara högre än kokpunkten för den olja som isoleras senare under destillationen. Industriellt skiljer man mellan tre metoder för vattenångdestillation av eteriska oljor: 1. Destillation med vatten 2. Destillation med vatten och ånga 3. Destillation med enbart ånga Destillation med vatten är den enklaste typen av vattenångdestillation. Växtmaterialet blandas med vatten i destillationskärlet och alltsammans kokas. Förångat vatten ersätts kontinuerligt genom tillförsel av destillerat vatten. Fördelen är metodens enkelhet; utrustningen kan användas direkt i anslutning till odlingen och dyra transportkostnader och avdunstning av de eteriska oljorna undviks. Vattentillgången är mer än tillräcklig för att oljorna skall kunna diffundera ut ur cellerna men samtidigt har hydrolysprocesser maximal möjlighet att äga rum eftersom destillationen är jämförelsevis långsam. För hög värme på destillationskärlet kan bränna växtmaterialet. Denna metod är att föredra för finpulveriserat växtmaterial och blommor. Vid destillation med vatten och ånga packas växtmaterialet jämnt på ett galler ovanför ett lager vatten på destillationskärlets botten (växtmaterialet kommer aldrig i direktkontakt med vattnet). När vattnet kokar, passerar den vattenmättade ångan genom växtmaterialet. Hydrolysen av de eteriska oljorna blir således mindre och metoden är något snabbare än den föregående. Den här 1
metoden lämpar sig bäst för utvinning av eteriska oljor ur örter och blad som är lätta att packa jämnt så att ångan tränger igenom växtmaterialet så likformigt som möjligt. Det kondenserade vattnet leds tillbaka till destillationskärlet efter det att oljorna avskiljts. Eftersom detta vatten är mättat med vattenlösliga oljebeståndsdelar förbättras utbytet av oljorna om samma vatten används hela tiden. Vid destillation med enbart ånga blåses ånga med högre tryck än atmosfärstrycket direkt genom växtmaterialet. Till skillnad från de två tidigare metoderna krävs en mer permanent uppställning av destillationsanläggningen. Fördelen med denna metod är att temperaturen kan varieras. Man kan starta med ånga av atmosfärstryck och på så sätt först isolera de mest lättlösliga/lättflyktiga oljedelarna. När sedan tryck och temperatur höjs kan man relativt snabbt utvinna de mera svårlösliga delarna av de eteriska oljorna. En nackdel med den här metoden är att det finns stor risk för att ångan blir överhettad och torkar ur växtmaterialet, något som leder till ett sämre utbyte. Känsligare oljor kan också brytas ner av den höjda temperaturen. Metoden används för utvinning av eteriska oljor ur de flesta växtdelar men lämpar sig dåligt för finpulveriserat växtmaterial. Kryddnejlikor utgörs av blomknopparna från Syzygium aromaticum L. som är ett 10-15 m högt träd som framförallt odlas på Madagaskar, Indonesien och i Brasilien 1. Blomknopparna skördas när de börjar ändra färg från grönt till rosa och torkas sedan noggrant i solen i 4-5 dagar. Kryddnejlika används som krydda, men mer än hälften av världsproduktionen går till tobaksindustrin där den används för smaksättning av cigaretter. Den eteriska oljan från kryddnejlika har använts bland annat som tillfällig lindring vid tandvärk och som antiseptiskt medel i mun och svalg, men den används inte längre inom tandvården i Sverige eftersom den visat sig vara både allgiframkallande och lokalirriterande 2,3. Den eteriska oljan innehåller en aromatisk substans (i både kemisk bemärkelse och väldoftande) som heter eugenol (84-95%). Eugenol har både svagt analgetiska och antiseptiska effekter. Eugenol används idag inom tandvården i form av komplex med zinkoxid i temporära tandlagningar. Dr. Robert Thomas and Margaret rr California Academy of Sciences 1 Drugs of Natural rigin. 2004. s.166 2 Clove oil. Martindale - The Complete Drug Reference. MICRMEDEX 3 Eugenol. Martindale - The Complete Drug Reference. MICRMEDEX 2
Laborationens syfte Det här försöket, när eugenol skall utvinnas från kryddnejlika, ger exempel på isolering av eteriska oljor genom vattenångdestillation av växtdelar enligt samma princip som industriellt tillämpas i stor skala. Den utvunna oljan i nedanstående försök karakteriseras genom IR. Tidsåtgång för laborationens genomförande: ½ dag Genomförande: Väg upp 10 g kryddnejlikor, finfördela dem genom malning och överför dem till en 500 ml trehalsad rundkolv. Tillsätt 150 ml vatten. Sätt en dropptratt i den vänstra öppningen och ett destillationshuvud i den mittersta. Stäng igen den högra öppningen med en glaspropp. Koppla på termometer, kylare, snabelrör och förlag. Värm därefter kolvinnehållet med ett oljebad och destillera snabbt. Se till att du har god kontakt mellan värmeplattan och oljebadet, och håll oljans temperatur vid 135-140 C. Vattennivån i trehalskolven hålls konstant genom att vatten tillförs från dropptratten. Destillera tills destillatet är genomskinligt (vilket visar att det inte följer med mer eugenol med vattenångan. m man är osäker kan man byta förlag för att lättare se.) Extrahera destillatet två gånger med eter (ca 15 ml varje gång). För att få bättre separation mellan eterfasen och vattenfasen, tillsätt 5 ml mättad NaCl-lösning innan separertratten skakas. Torka de sammanslagna eterfaserna med vattenfritt natriumsulfat. När lösningen är torr filtreras torkmedlet av med hjälp av ett veckfilter och tvättas i filtrerpapperet med några ml eter. Den filtrerade eterfasen samlas upp i en torr, invägd rundkolv. Anteckna kolvens massa. Etern evaporeras bort. Återstoden består till största delen av eugenol. Väg rundkolven med sitt innehåll och beräkna innehållets massa. Databehandling: Bestäm den procentuella andelen eterisk olja i kryddnejlika. Redovisning: Redovisning sker genom muntlig genomgång / diskussion i samband med laborationen. 1. Malning: Varför finfördelar man kryddnejlikorna innan destillationen? 2. Destillation: Varför gör man detta? Vad är det som sker? 3. Extraktion: Varför gör man detta? Vad är det som sker? 4. Torkning: Varför gör man detta? Vad är det som sker? 5. Evaporering: Varför gör man detta? Vad är det som sker? 6. Reslutat: Hur mycket eterisk olja har ni utvunnit? Hur många procent eterisk olja innehåller kryddnejlika? Se även diskussionsfrågor på nästa sida 3
Diskussionsfrågor: 1. Ge ett förslag till varför eugenol under destillationen följer med vattenångan och sedan under extraktionen fördelar sig huvudsakligen i eterfasen. Eugenol H H o-eugenol Kp = 253,2 o C Kp = 119-121 o C 2. Fenoler kan enkelt isoleras från en blandning av olika oljor genom behandling med alkali (t. ex. NaH). Beskriv vad som händer när du gör detta! 3. Den eteriska olja som man kan isolera från kryddnejlika består till c:a 85 % av eugenol. Resten utgörs av bl. a. acetyleugenol, caryofyllen och metylsalicylat. Kan behandling av den utvunna oljan med alkali erbjuda ett enkelt sätt att få en ren slutprodukt? Motivera! H H H Caryofyllen Acetyleugenol Metylsalicylat 4
LITE LABRATRIETEKNIK Extraktion Extraktion innebär att man isolerar, drar ut, en önskad förening ur en fast eller flytande fas. Flyktiga föreningar ur fast material isoleras ofta genom vattenångdestillation. (Se ovan!) Extraktion av en vätskefas med en annan vätska är en vanlig procedur. De båda vätskorna måste naturligtvis vara olösliga (svårlösliga) i varandra. Normalt är det fråga om en vattenfas och ett organiskt lösningsmedel (t. ex. eter). Häng upp en separertratt av lämplig storlek i en stativring eller fäst den med en hållare om halsen. Smörj en propp och kran sparsamt med fett. Stäng kranen. Töm i vätskan som skall extraheras = destillatet från kryddnejlikkoket. Fyll på med eter. (Fyll separertratten till högst hälften.) Sätt i proppen, håll fast propp och kran och vänd tratten upp och ner. (Se bild.) Öppna kranen försiktigt (i dragskåpet) och släpp ut ev. övertryck. Stäng kranen, skaka försiktigt, vänd tratten upp och ner och öppna kranen försiktigt. Fortsätt på det här viset tills det inte byggs upp något övertryck. Skaka sedan tratten ordentligt 10 50 gånger. Häng upp separertratten, ta bort proppen och låt faserna separera, vilket kan ta sin tid. Släpp ut den nedre fasen. 5
Vattenångdestillation Apparatuppställning för vattenångdestillation: Evaporering Evaporering används för att avlägsna lösningsmedel i vakuum (och följaktligen vid en relativt låg temperatur) från en fast fas eller en högkokande vätska. Produktens kokpunkt bör vara minst 150º högre än lösningsmedlets, annars gör man stora förluster. En bild på en typ av evaporator (rotationsindustare) visas i nedanstående figur. Destillationskolven roterar hela tiden vilket ger större vätskeyta och därmed snabbare avdunstning. Kokpunkterna för dietyleter och eugenol är 34,5 C 4 respektive 253,2 C 5. 4 Eter. Nationalencyklopedin. www.ne.se 5 Handbook of Chemistry and Physics 55:th ed. 6
7