GRÅÄRTERS BLOMNING - En studie i hur geografiskt ursprung påverkar den genetiska variationen

PROJEKTARBETESRAPPORT Läsåret 2010/2011 GRÅÄRTERS BLOMNING - En studie i hur geografiskt ursprung påverkar den genetiska variationen Projektgrupp: Louise Dahlin, Sanna Renius och Frida Ulander, NV3E Handledare: Johan Edqvist, Lena Sundström Medbedömare: Christina Ståhl

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT SAMMANFATTNING Projektet utfördes i syfte att kontrollera om det finns några förändringar i genen LF, som är en av generna hos gråärter som påverkar blomning. Vi undersökte ärter med olika geografiskt ursprung för att analysera huruvida de eventuella skillnaderna var geografiskt betingade. För att ta reda på detta odlades ärter från olika delar av Sverige. Därefter mättes tiden det tog för dem att börja blomma. Sedan utvanns DNA ur växterna genom en serie reaktioner, varpå proverna renades och skickades till sekvensering. Resultaten från sekvenseringen analyserades avseende genens påverkan på blomningstiden. Då vi mätte hur lång tid det tog för ärtorna att börja blomma kunde vi se tydliga skillnader mellan de olika växterna, men bara ett fåtal av dessa skillnader visade sig i genen. Den ena av dessa sitter i ett exon och ändrar därmed en aminosyra i proteinet. Den andra sitter i ett intron och kodar inte för proteinet men kan påverka hur mycket mrna som bildas och därmed hur mycket protein som bildas. Detta kan i sin tur påverka blomningstiden. Vi kom även fram till att många gener måste samverka eftersom vi hittade så pass få avvikelser.

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT INNEHÅLLSFÖRTECKNING GRÅÄRTERS BLOMNING... 4 FÖRORD... 4 INLEDNING... 4 Bakgrund... 5 Begrepp... 7 GENOMFÖRANDE... 9 Plantering... 9 DNA-extraktion... 10 PCR... 11 Etanolrening... 12 Gelelektrofores... 13 Rening av DNA... 13 Sekvensering... 14 Utställning... 16 RESULTAT... 17 Plantering... 17 DNA-extraktion... 17 PCR... 18 Etanolrening... 18 Gelelektrofores... 19 Sekvensering... 20 Utställning... 21 DISKUSSION... 22 Resultatanalys... 22 Felkällor... 24 Förbättringar... 25 Vad vi har lärt oss... 25 SLUTSATSER... 26 KÄLLOR... 27 Figurer... 27 BILAGA I... 29 BILAGA II... 32 BILAGA III... 33 BILAGA IV... 34 BILAGA V... 36

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 4 GRÅÄRTERS BLOMNING FÖRORD Projektarbetet påbörjades förra våren när vi såg att det fanns möjlighet att göra sitt projektarbete på Linköpings Universitet. Ett område som det fanns möjlighet att göra projektet om var växternas molekylärbiologi. Det skulle genomföras i samarbete med en forskargrupp på universitetet. Vi blev genast intresserade och kontaktade våra lärare för att anmäla vårt intresse. Till vår stora glädje fick vi några veckor senare veta att vi hade blivit antagna. Arbetet kom att handla om ärtväxters blomning. Ämnet bestämdes i samråd med handledaren på universitetet, lektor Johan Edqvist. Han har varit till mycket stor hjälp och projektet hade omöjligen kunnat genomföras utan hans hjälp. Han har hjälpt oss med planeringen av projektet, tillhandahållit information och laborationsmaterial samt hjälpt till vid analysen. Vi har även fått ovärderlig hjälp av Matti Leino, doktor i genetik och växtförädling vid Nordiska museet och gästforskare vid Linköpings Universitet. INLEDNING Syftet med projektet är att odla ärter från olika delar av Sverige (och en ärta från Polen) och analysera deras DNA. Alla ärter är av gruppen gråärter. För mer information om gråärter, se Bakgrund. Vi ska undersöka om det finns genetiska skillnader som påverkar ärternas blomning samt bestämma den tid det tar för ärterna att börja blomma, räknat från sådd. Slutprodukten av arbetet kommer dels att bestå av denna teoretiska rapport där metoder, resultat och analyser redovisas, dels av en plansch som kommer att ställas ut på Förbundet Unga Forskares regionala utställning i Linköping. För att förenkla arbetet har vi valt att ge ärterna nummer för att minska risken för att blanda ihop dem vid laborationer och för att lättare kunna överblicka arbetet. Vilka ärter som har undersökts framgår i tabell 1, och även vilket nummer de har fått och deras geografiska ursprung. Dessa nummer kommer vi att använda vid flertalet tillfällen i rapporten. Geografiskt ursprung Namn Nummer Jämtland Jämtländsk grå 1 Jämtland Lit 2 Medelpad Boltjärn 3 Dalarna Rättviksärt 4 Gästrikland Hedesunda 5 Värmland Väse 6 Västergötland Tollestorp 7 Bohuslän Brattebräcka 8 Bohuslän Solberga 9 Halland Stäme 10 Skåne Maglaby 11 Polen WBH2814 12 Tabell 1: Ärtsorter och deras ursprung

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 5 Bakgrund Ärtväxten har funnits i Sverige sedan stenåldern och lokalsorter växer i hela landet, vilket gör växten ovanligt passande för studier av regionala skillnader. Gråärter, som studeras i det här projektet, är en väl anpassad ärtväxt som har uppkommit genom naturlig selektion under lång tid. Ärternas anpassning till lokala förhållanden kan påvisas i blomningstiden, där gråärterna blommar sent och länge (1). Tidigare studier har visat att proteinet Late Flowering (LF), fördröjer växtens blomning och variationer i genen LF är en viktig del i den naturliga variationen av blomningstiden hos ärter. Låga transkriptionsnivåer av genen leder till låga halter av proteinet LF vilket ger en tidig blomning medan höga nivåer leder till sen blomning. Man har kommit fram till en modell för blomningen som innehåller både en inhibitor 1 och ett stimuli 2. Syntesen av inhibitorn kontrolleras av en mängd olika gener och påverkas starkt av mängden dagsljus. Sammanställningen av dessa signaler kontrolleras av LF, som bestämmer vid vilken nod ärtan ska blomma. Man känner till fyra alleler av LF som i olika hög grad är känsliga för signalerna. Den dominerande allelen ger sen blomning vid en högre nod medan mutationer av denna har visat sig medföra tidig blomning (2)(3). Under de senaste årtiondena har metoderna för DNA-analys utvecklats mycket och vi har använt några av de vanligaste metoderna. PCR (Polymerase Chain Reaction) är en metod för kopiering av DNA som uppfanns av Kary Mullis år 1985 och åtta år senare belönades med Nobelpriset i kemi. PCR har snabbt blivit populärt: idag är det en mycket vanlig metod som används inom alla genetikområden. Figur 1 visar hur en PCR utförs: man behöver en ursprunglig DNAsekvens (siffran 1 i figuren) att kopiera, primers (2) som visar var på strängen kopieringen ska inledas och avslutas, ett enzym (en aktiv biologisk substans) som kallas Taq-polymerase (3) och kopierar DNA-sekvensen. Dessutom behövs fria nukleotider (4) för att bygga nya DNAsträngar med. Med hjälp av en serie temperaturförändringar (5-8) kopieras DNA-sekvensen så att man får tillräcklig mängd DNA att analysera. Figur 1: PCR 1 Ett hämmande ämne 2 Händelse i omgivningen som påverkar beteende

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 6 Det finns ett antal olika sätt att utföra en sekvensering, men den som idag är mest använd för sekvensering av kortare DNA-fragment är Kedjetermineringsmetoden. Metoden introducerades av Frederick Sanger år 1977 och kallas därför också Sangermetoden. Den gav honom ett Nobelpris i Kemi år 1980 och användes vid delar av sekvenseringen av det mänskliga genomet. Metoden använder modifierade nukleotider märkta med radioaktivitet eller fluorescens som inte kan binda vidare till nästa nukleotid i kedjan. DNA-kedjan tar därför slut när en sådan nukleotid sätts på plats, och man vet då vilken nukleotid som normalt finns på den platsen i genen. Om kedjan t.ex. tar slut vid en modifierad T-nukleotid vet man att det egentligen ska sitta en vanlig T-nukleotid där. På det sättet kan man ta reda på hela DNA-sekvensen. Figur 2: Schematisk bild över Sanger-sekvensering

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 7 Begrepp I tabell 2 förklaras en del av de mest förekommande begrepp som används i rapporten (4). Begrepp Amplifiera Buffert Eppendorfrör, QIAshredder MiniSpin Column, DNeasy mini spin column Filtrat Pellet Utfällning Membran DNA-polymeras Sekvensering Fluorescera Förklaring Utvidga, utförligare framställa. Här: kopiera DNA Lösning som har till uppgift att hålla ph-värdet på stabil nivå. Många olika buffertar användes men deras funktion är i princip densamma. Olika typer av små rör vilka används vid laborationerna. Vissa har membran som har till uppgift att binda särskilda ämnen. Den vätska som rinner igenom membranet i ett rör. Liten fast klump som bildas längst ner i ett rör vid centrifugering. Fasta föreningar, exempelvis salter En tunn skiljevägg eller hinna som reglerar transport av ämnen. En molekyl som separerar DNA-strängarna. Att bestämma kvävebasernas ordning i ett DNA-fragment. Skicka ut ljus av annan våglängd när provet belyses med en speciell våglängd, ofta UV-ljus. Komplementär Motsvarande. Här: motsvarande kvävebas (A och T, C och G) 3 Intron Exon NCBI Centrifugering Inkubering Supernatant Lysering Del av gen som inte kodar för protein. Del av gen som kodar för protein National Center for Biotechnology Information, databas för bioteknik. Ett prov snurras runt med hög hastighet för att fasta och flytande komponenter ska separeras. Att hålla något vid en viss temperatur. Det övre skiktet av vätska i ett prov efter centrifugering. En cells membran upplöses eller faller samman. 3 Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) och Tymin (T).

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 8 Primer Kvävebaser som fungerar som startpunkt för DNA-replikation. PCR Gelelektrofores dntp Transkriptionsnivå Kodon Allel Ökning av mängden DNA i ett prov genom temperaturförändringar. Förkortningen står för Polymerase Chain Reaction. Metod för att separera molekyler genom att utnyttja att molekyler med olika storlek rör sig olika fort i en gel med ett elektriskt fält. Deoxyribonukleotider, fria nukleotider som används som byggstenar i bl.a. PCR. Hur mycket som mrna som bildas. (Hög transkriptionsnivå ger mycket mrna och vice versa) En kombination av tre nukleotider i mrna. Variant av en gen. Tabell 2: Tabell med förklaringar av begrepp

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 9 GENOMFÖRANDE Den första delen av projektarbetet bestod till största delen av laborationsarbete då vi utvann DNA, masskopierade det genom PCR, undersökte innehållet i våra PCR-produkter med gelelektrofores och slutligen renade produkterna för att skicka iväg dem för sekvensering. Den andra delen bestod i att analysera resultaten och förbereda utställningen. Våren 2010 hade vi det första mötet med vår handledare på universitetet, Johan Edqvist. Vid detta möte grovplanerades arbetet och vi fick en del material av honom som behandlar det ämne projektet gäller. I början av hösten hade vi en introduktionsdag tillsammans med de andra grupperna som gör projektarbete på universitetet och med våra handledare från skolan och från universitetet. Där lyssnade vi på föreläsningar och gick på rundvandring i lokalerna. Vi fick bland annat se laborationssalarna där vi kom att göra de flesta laborationerna. Vi hade senare ett planeringsmöte då även vår handledare på Berzeliusskolan, Lena Sundström, närvarade. På detta möte gjordes en preliminär tidsplanering där vi bestämde datum för plantering av ärterna, den första laborationen och det förberedande arbete då vi läste in oss på ämnet. För att samla in den information i form av DNA-fragment som vi behövde för att kunna analysera genen använde vi oss av de laborationer som kommer att beskrivas utförligt senare i detta kapitel. Plantering Gråärter av tolv olika geografiska varianter (tabell 1) planterades i växthuset på universitetet för att få samma förutsättningar. Vi planterade totalt nio frön av varje variant i tre olika krukor för att säkerställa att vi skulle få tillräckligt många för att kunna göra en bra jämförelse. Fröna planterades i planteringsjord med naturgödsel från Plantagen. Jorden innehöll tillsatser av kväve, fosfor, kalium, kalcium, magnesium, svavel, bor, koppar, järn, mangan, molybden och zink i olika koncentrationer 4. För att alla skulle få samma förutsättningar planterade vi dem på 1 cm djup i likadana krukor som placerades på samma höjd under värmelampor. Dessa värmelampor sattes på och stängdes av automatiskt för att efterlikna naturens dygnsväxlingar. Figur 3: Ärtodling 4 Plantagens planteringsjord med naturgödsel.

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 10 När ärterna började gro turades vi om att åka till universitetet för att vattna och observera. När plantorna hade vuxit sig större gallrades två av ärterna bort i varje kruka, så att det återstod totalt tre av varje sort. När de började blomma intensifierades besöken och vi dokumenterade när varje ärta började blomma. Inför utställningen valde vi också att odla några ärter för att visa utseendeskillnaderna. DNA-extraktion Syfte Syftet med DNA-extraktionen är utvinna DNA från ärterna. Därefter ska genen som kontrollerar blomningstiden amplifieras genom PCR (förklaras utförligare senare i rapporten) och sedan sekvenseras och analyseras. Detta görs för att kunna avgöra om det finns några skillnader i den amplifierade genen som kan ha någon påverkan på växternas blomningstid. Teori Buffert API och RNase 5 lyserar cellmembranen i den första inkuberingen. Vid tillsats av buffert AP2 och inkubering på is, bildas utfällningar av proteiner och polysackarider. När blandningen sedan centrifugeras, bildas därför en pellet av dessa komponenter. I nästa centrifugering (av den tidigare centrifugeringens supernatant) används QIAshredder Mini spin column, som innehåller ett membran där utfällningar och cellrester fastnar. DNA fastnar inte i membranet, utan kvarstår i supernatanten. En del av supernatanten blandas med buffert AP3/E. När lösningen sedan placeras i DNeasy mini spin column, gör buffert AP3/E att DNA fastnar i kolonnens membran. När buffert AW tillsätts, tvättas DNA bort från membranet så att det kan centrifugeras ner i röret under membranet. Denna vätska innehåller då det DNA som vi sedan analyserar i spektrofotometer, för att erhålla DNA-koncentrationen. Materiel Till denna laboration användes följande materiel 6 : Buffert AP3/E, 600 µl. Buffert AP1, 400 µl. Buffert AW, 500 µl. Buffert AP2, 130 µl. Buffert AE, 100 µl. RNase A stock solution, 4 µl. Blad från tolv olika gråärter från olika delar av Sverige (tabell 1). 5 Ett enzym som har till uppgift att förstöra eventuella RNA-fragment som skulle störa vid exempelvis PCR. 6 DNeasy Plant Mini Kit (5)

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 11 Metod Blad plockades från de olika ärtplantorna och maldes till ett fint mos i varsitt eppendorfrör. Sedan tillsattes buffert AP1 och RNase (100 mg/ml, följaktligen standardlösningen). Blandningen skakades tills inga klumpar fanns kvar i botten och inkuberades sedan under 10 minuter i 65 o C. Tre gånger under inkuberingen skakades blandningen för att ytterligare effektivisera buffertarna. Därefter tillsattes buffert AP2, blandningen skakades om för att blandas ordentligt och inkuberades sedan under 5 minuter på is. Blandningen centrifugerades slutligen under 5 minuter, 14 000 rpm 7. Figur 4: Mosade blad i eppendorfrör Under centrifugeringen bildades en pellet i botten, bestående av cellulosa och växtrester. Endast supernatanten pipetterades upp och placerades sedan i en QIAshredder Mini spin column. Röret centrifugerades därefter ytterligare 2 minuter, 14 000 rpm. Även i detta steg bildades en pellet av celldelar. Då DNA fanns i filtratet, pipetterades detta upp och placerades i ett nytt eppendorfrör. Volymen av filtratet var ungefär 400 µl. Sedan adderades buffert AP3/E i en mängd motsvarande en och en halv gånger volymen av filtratet (600 µl). 650 µl av den nya blandningen placerades i en DNeasy mini spin column. Denna centrifugerades under 1 minut, 8 000 rpm. Det filtrat som bildades, kasserades. Sedan tillsattes buffert AW och provet centrifugerades sedan på 14 000 rpm. Filtratet kasserades sedan och eppendorfröret under kolonnen byttes ut. Därefter tillsattes buffert AE till kolonnen och blandningen inkuberades under 5 minuter i rumstemperatur (15-25 o C). Proverna centrifugerades slutligen en minut, 8 000 rpm. För mer detaljerad information, se laborationshandledning (bilaga I). PCR Syfte PCR har som syfte att amplifiera DNA till önskad mängd för sekvensering. Teori För att kunna sekvensera en gen behöver man en hög koncentration av DNA i provet. Detta åstadkoms genom PCR. För att göra en PCR behövs först och främst det DNA som man vill kopiera, detta kallas för templat. Man använder även ett speciellt DNA-polymeras som kommer från den värmetåliga bakterien Termus Aqvatikus som naturligt lever i varma källor. Detta kallas Taq-polymeras. Eftersom man inte vill kopiera hela DNA-strängen, använder man sig av olika primers som talar om för polymeraset var den ska börja sin amplifiering. Man behöver även nukleotider, byggstenar till de nya DNA-strängarna som ska skapas, samt en buffert som gör ph stabilt och därmed gör miljön för polymeraset optimal. Amplifieringen av DNA sker genom temperaturförändringar som sköts av en PCR-maskin. 7 Rotations per minute, varv per minut.

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 12 I det första steget värms blandningen av templat, Taq-polymeras, primers, nukleotider och buffert upp till cirka 95 o. I detta steg denatureras DNA, dvs. strängarna delar på sig. Denna temperatur bibehålls i 2 minuter och 30 sekunder. Därefter sänks temperaturen till 56 o C, varpå primrarna binder. Temperaturen ökas sedan till 72 o C. Detta gör att DNA-strängarna byggs på med nya nukleotider. Sedan hettas blandningen upp till 94 o C. De nybildade DNAsträngarna denatureras då igen. Temperaturen sänks sedan till 56 C och höjs till 72 C. Detta upprepas 30 gånger. Då har man fått ett stort antal DNA-strängar som endast innehåller den önskade genen. Avslutningsvis hålls temperaturen konstant på 72 C i 5 minuter för att se till att alla fragment är av samma längd. Materiel Laborationen utfördes totalt fyra gånger och följande materiel användes (II) : Vatten, 18,75 µl. DreamTaq buffer, 2,5 µl. Forward primer LF F1 och LF F3, 1 µl. Reverse primer LF R1 och LF R3, 1 µl. dntp, 0,5 µl. DreamTaq, 0,25 µl. Templat från DNA-utvinningen (i senare laborationer PCR-produkt), 1 µl. Metod Vatten, Dreamtaq buffer, forward primer, reverse primer, dntp, DreamTaq och templat blandades i PCR-rör, ett rör för varje templat. Två extra rör tillreddes, ett med färdig PCRprodukt och ett med vatten istället för templat. Dessa användes som kontroller vid nästa laboration, gelelektroforesen. Rören placerades i en PCR-maskin som i förväg programmerats till de rätta temperaturförändringarna under rätt tidsperioder. När laborationen sedan gjordes om användes PCR-produkten och de sista gångerna användes bara primerparet LF F1/R1. Etanolrening Syfte Det framkom senare att vissa prover innehöll etanol. För att kunna fortsätta med laborationerna behövde etanolen avlägsnas från proverna. Läs mer under Felkällor- DNAextraktion. Materiel NaAc (3 M), 20 µl. Etanol (99 %), 500 µl. Etanol (70 %), 200 µl. Tris- HCl (10 mm), 100 µl. Metod Reningen av proverna från etanol gjordes inte av oss utan av handledaren Johan Edqvist, eftersom det inte var ett ordinarie steg i DNA-utvinningen. NaAc och etanol (99 %) tillsattes till varje prov som sedan inkuberades över natten i -20 C. Dessa centrifugerades med 15 000 rpm under 20 minuter, vätskan avlägsnades med pipett och pelleten tvättades med etanol (70 %). Därefter centrifugerades proverna igen med 15 000 rpm

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 13 i 5 minuter, vätskan togs bort och pelleten torkades i 20 minuter. Därefter löstes pelleten i Tris-HCl (10 mm) och de nya DNA-koncentrationerna mättes med hjälp av en spektrofotometer. Gelelektrofores Syfte Syftet med gelelektrofores är att ta reda på om PCR har lyckats så att proverna kan sekvenseras. Det är först i gelelektroforesen som man kan se resultatet från PCR. Teori Fosfatgrupperna i DNA-fragmenten är negativt laddade vilket medför att de kommer att vandra mot den positiva polen om de befinner sig i ett elektriskt fält. Detta utnyttjar man i gelelektrofores. DNA blandas med loading dye (ett färgämne) som är ett negativt laddat preparat som tynger ner DNA. Små bitar av DNA möter inte lika mycket motstånd i gelen och vandrar därför snabbare. Följaktligen separeras DNA-fragment av olika storlek. Loading dye innehåller socker och vandrar snabbare än DNA så att Figur 5: Exempel på gelelektrofores man kan se när man ska avbryta gelelektroforesen. PCR-produkterna märks med fluorescerande ämnen. Efter en viss tid fotograferas gelen med en UV-kamera och de separerade fragmenten fluorescerar (figur 5). Eftersom man på förhand vet ungefär hur många baspar genen består av kan man jämföra detta med en känd storleksmarkör och på så sätt veta att man har fått rätt gen. Metod Först gjöts en gel av agaros (1%) och en TE- buffert. En kam placerades i den innan den stelnade så att det bildades så kallade brunnar, dvs. små fördjupningar i gelen där templat kan placeras. Gelen placerades i en elektroforesapparat och en buffertlösning hälldes på så att den täckte hela gelen. Därefter avlägsnades kammen och brunnarna kunde fyllas med templat (III). PCR-produkterna blandades med en sockerlösning och loading dye. Därefter placerades cirka 5 µl försiktigt i varje brunn. Två av brunnarna fylldes med storleksmarkörer, dvs. en blandning av olika DNA-fragment av kända längder. Därefter anslöts elektroforesapparaten till en strömkälla och efter 30 minuter avlästes resultaten. Rening av DNA Syfte Syftet är att rena PCR-produkter från eventuella proteiner och rester av buffertar som använts i tidigare laborationer innan DNA skickas till företaget Eurofins MWG Operon för sekvensering.

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 14 Teori I det första steget binder Binding buffer till DNA så att det inte rinner genom membranet som filtrat. Wash buffer renar provet från biprodukter och Elution buffer löser upp DNA i membranet så att det kan passera genom membranet som filtrat och insamlas. Materiel Följande materiel användes (6): Binding buffer, 25 µl. Wash buffer, 700 µl. Elution buffer, 30 µl. Purification column. PCR-produkt, 25 µl. Metod Först tillsattes PCR-produkt och Binding buffer till ett reningsrör, som sedan centrifugerades med 13 000 rpm i en minut. Filtratet kasserades, Wash buffer tillsattes till röret som sedan centrifugerades i en minut, varefter filtratet återigen kasserades och röret centrifugerades tomt i 1 minut. Den övre delen av röret (med membran) placerades i ett nytt rör och Elution buffer tillsattes innan röret centrifugeras ytterligare en minut. De renade DNA-fragmenten fanns i filtratet, så dessa samlades in och primers tillsattes för att rätt del av genen skulle sekvenseras. Därefter skickades proverna iväg för sekvensering. Sekvensering Teori När sekvensen i ett visst templat ska bestämmas behövs dels templatet, DNA-polymeras och fria nukleotider (datp, dctp, dttp och dgtp) men också modifierade nukleotider (ddatp, ddgtp, ddctp och ddttp) (7). Dessa modifierade nukleotider saknar OH-grupp vilket innebär att de inte kan binda till nästa nukleotid. Hydroxigruppen på kolatom 3 har bytts ut mot väte. Detta förhindrar att kedjan blir längre. Man behöver också primers som binder komplementärt till den DNA-sträng som skall sekvenseras. De modifierade nukleotiderna märks med fluorescerande ämnen som är specifika för varje kvävebas. Man utgår från enkelsträngat DNA. Komplementära kedjor bildas då nukleotider byggs ihop till nya kedjor. Eftersom det både finns vanliga och modifierade nukleotider i provet så beror det på slumpen vilka som sammanfogas. Man får alltså olika långa fragment beroende på var en modifierad nukleotid hamnar. Sekvenserna separeras sedan efter storlek med samma metod som i gelelektrofores, alltså i en gel där de kortaste fragmenten färdas längst. Eftersom de är fluorescerande kan man med hjälp av en fluorescentdetektor se i vilken ordning fragmenten ligger och därmed avgöra sekvensen. Då får man den komplementära sekvensen till DNA-strängen och man måste alltså översätta sekvenserna då ett A blir ett T och C blir G och vice versa. Då får man den verkliga sekvensen som kan åskådliggöras i ett diagram (figur 4). De grå partierna i diagrammet visar var kvaliteten är för dålig för att man ska kunna lita på resultaten. Det ser man även på att topparna är ojämna och att det i flera fall finns mer än en topp.

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 15 Figur 6: Resultat från sekvensering i form av diagram där de olika kvävebaserna motsvaras av olika färger. Metod Proverna skickades till ett tyskt företag som heter Eurofins MWG Operon. De sekvenserade proverna åt oss med metoden som beskrivs på föregående sida. Vi fick tillbaka resultaten dels som ett dokument med alla baserna och dels som diagram (som exemplet i figur 6) där det även framgick vilken kvalitet proverna hade och därmed med vilken säkerhet man kan dra slutsatser. Sekvenseringen utfördes till att börja med två gånger då kvaliteten på den första sekvenseringen inte var perfekt. Andra gången fick vi betydligt bättre och mer tillförlitliga resultat förutom för proverna 3 och 4 (Boltjärn och Rättviksärt). Första steget var att kontrollera om vi verkligen hade amplifierat rätt gen. Detta gjordes genom att jämföra våra sekvenser med genens motsvarighet på databasen NCBI (8). Vid undersökningen kom vi fram till att det var rätt gen eftersom den överensstämde med databasens gen till 98-99%. Som tidigare nämnt fick vi resultaten i form av ett dokument med kvävebassekvensen och ett diagram för varje ärta. Utifrån diagrammen kunde vi avläsa hur kvaliteten var för olika delar av genen. De delar som var gråmarkerade hade dålig kvalitet och var väldigt osäkra medan de delar som var grönmarkerade hade bra kvalitet. I nästa steg tog vi inte hänsyn till de gråmarkerade zonerna eftersom vi inte kunde vara säkra på deras tillförlitlighet. Vi använde sedan datorprogramvaran ClustalX för att jämföra sekvenserna från de olika ärterna (figur 7). Med en funktion i programmet passades sekvenserna in mot varandra så att man tydligt kunde se var det fanns skillnader i DNA-sekvenserna (figur 8).

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 16 Figur 7: Bild från programmet ClustalX före anpassning Figur 8: Bild från ClustalX efter anpassning Vi undersökte var det fanns skillnader och kontrollerade vilka skillnader som var placerade i exoner. Var dessa fanns kunde vi utläsa i NCBI:s databas (8). När detta var gjort undersöktes aminosyrorna för skillnaderna i exonerna med hjälp av den genetiska koden. Detta gjordes genom att undersöka vilken ändring som har skett och hur det sedan påverkar det mrna som transkriberas från DNA-strängen. De skillnader som fanns i introner noterade vi endast och kontrollerade om de fanns i båda sekvenseringarna. För att kontrollera att de skillnader som hittats i genen verkligen existerar försökte vi säkerställa resultaten genom ytterligare en sekvensering. Utställning I enlighet med projektplanen ställdes projektet ut på Utställningen Unga Forskare i Linköping, 9 mars 2011. Utställningen var även en tävling där de bästa projekten hade möjlighet att gå vidare till en nationell final i Stockholm. Inför utställningen tillverkades en plansch där vi presenterade projektet och de viktigaste resultaten. Jurymedlemmar och besökare fick komma och lyssna på vår presentation.

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 17 RESULTAT Plantering Ärterna observerades medan de växte och när de började blomma noterade vi datumet. Resultatet redovisas i tabell 3. Noteringen ogiltig innebär att datumet är osäkert på grund av att ärtan växte in i värmelampan och därför räknas de inte med i genomsnittet (Se även Felkällor- Plantering). Sort Blomningstid planta 1 (dagar) Blomningstid planta 2 (dagar) Blomningstid planta 3 (dagar) Genomsnitt Noteringar Jämtländsk grå(1) 48 46 59 47 Planta 3 ogiltig Lit (2) 50 47 53 50 Boltjärn (3) 41 42 50 42 Planta 3 ogiltig Rättviksärt (4) 59 59 62 60 Hedesunda (5) 49 64 59 57 Väse (6) 41 42 41 41 Tollestorp (7) 44 44 42 43 Brattebräcka 88 83 78 83 (8) Solberga (9) - 81 67 74 Stäme (10) 43 44 44 44 Maglaby (11) - - - Planta 3 ogiltig Polen (12) 81 83 81 82 Planta 1 ogiltig Tabell 3: Ärtornas blomningstid DNA-extraktion För att kunna avgöra om denna laboration hade lyckats, analyserades proverna i en spektrofotometer. Denna mätte koncentrationen av DNA i våra prover. DNA absorberar ljus vid 260 nm, och grafen som visas bör därför ha en topp vid denna våglängd. Vid 280 nm absorberar proteiner ljus, renheten från protein mäts därför genom att jämföra proteinkoncentrationen och DNA-koncentrationen. Samma sak gäller med koncentrationen av mindre molekyler, till exempel rester från buffertar vilka absorberar ljus vid våglängden 230 nm. I senare laborationer visade det sig att proverna innehöll etanol, vilket bör vara en rest från buffertar i denna laboration. Tabell 4 anger dels koncentrationen av DNA och dels renheten från protein och mindre molekyler som en kvot mellan absorbtionen av 260 nm och 280 respektive 230 nm. Figur 9: Ärtblommor

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 18 Prov Koncentration DNA, ng/µl Renhet från protein (260/280 nm) 1.Jämtländsk grå 361 1.72 1.84 2. Lit 32 1.88 1.59 3. Boltjärn 39 1.77 2.25 4. Rättviksärt 74 1.80 0.67 5. Hedesunda 20 1.72 0.74 6. Väse 28 2.01 1.19 7. Västergötland 62 1.83 1.55 8. Brattebräcka 31 1.96 1.32 9. Solberga 56 1.84 1.41 10. Stäme 55 1.53 1.18 11. Maglaby 28 1.93 1.18 12. Polen 33 1.81 1.35 Renhet från mindre molekyler (260/230 nm) Tabell 4: Provernas koncentrationer av DNA och renhet från protein respektive mindre molekyler efter DNA-extraktion PCR Resultaten från en PCR får man genom att göra en gelelektrofores (se nästa avsnitt), och där visade det sig att reaktionen inte hade lyckats första gången. För att få så stora mängder DNA som möjligt gjordes laborationen om tre gånger, alltså fyra gånger totalt. Primerparet LF F3/R3 gav genomgående dåliga resultat och användes därför inte de sista gångerna. Etanolrening Som tidigare nämnts var detta inte ett ordinarie steg i processen, men syftet var att rena proverna från etanol. För att kontrollera att det fortfarande fanns DNA i proverna mättes koncentrationen som visade sig vara ungefär samma som efter DNA-extraktionen i vissa fall medan det i vissa fall skiljde väldigt mycket. Även renheten från protein mättes. Jämför med tabell 4. Prov Koncentration DNA, (ng/µl) Renhet från protein (260/280 nm) 1. Jämtländsk grå 23 2,01 2. Lit 41 1.82 3. Boltjärn 40 1,87 4. Rättviksärt 24 1,94 5. Hedesunda 42 1,93 6. Väse 38 1,97 7. Västergötland 44 1,89 8. Brattebräcka 55 1,91 9. Solberga 56 1,84 10. Stäme 20 1,96 11. Maglaby 30 1,86 12. Polen 32 1,89 Tabell 5: DNA-koncentrationer och renhet från protein efter etanolrening

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 19 Gelelektrofores Första försöket Som figur 10 visar blev resultatet från det första försöket inte speciellt bra. Endast ett av proverna (vit pil), i figur 10 har vandrat mot pluspolen. De andra som har vandrat är markörer och färdig PCR-produkt. Detta betyder att vi, av någon anledning, inte hade lyckats framställa tillräckligt mycket DNA i proverna. Även det prov som uppenbarligen innehöll DNA är suddigt och inte speciellt markerat. Eftersom markörerna visar tydliga resultat så är det inte själva gelelektroforesen som har gått fel. Det var bara prov 9 som gav utslag och det var även det enda prov som hade frusit under förvaring i frys. För vidare information se Diskussion. Figur 10: Resultat av den första gelelektroforesen, utförd 21/10. Andra försöket Vid den andra gelelektroforesen som utfördes efter etanolreningen, blev resultatet bättre men fortfarande inte tillräckligt bra. Man ser att den övre raden, serien med primerparet LF F3/R3, nästan inte har gett något utslag alls, vilket är ett tecken på att primerparet inte fungerar som det borde. Därför använde vi inte detta primerpar i senare försök. I serien med primerparet LF F1/R1, dvs. den undre raden i figur 4 har vi fått mer eller mindre tydliga resultat för alla tolv ärterna. Bilden är dock lite mörk och därför kan det vara svårt att se alla tolv. På grund av oförsiktighet Figur 11: Resultat av den andra kontaminerades en av brunnarna när templaten gelelektroforesen, utförd 11/11. skulle pipetteras i, därav det tomma mellanrummet (Vit pil i figur 11). Tredje försöket Vid nästa gelelektrofores blev inte resultaten särskilt bra, som figur 12 visar. Möjliga anledningar till detta listas under rubriken Felkällor i kapitlet Diskussion. Vid detta försök användes dels de gamla PCR-produkterna och dels templat från DNA-utvinningen som utgångspunkt för PCR. Efter detta försök skickades prover in för en första sekvensering och då valdes de bästa ut, en del från serien med PCRprodukter och en del från serien med DNAtemplat. Dessa kommer senare att betecknas med A respektive B. Figur 12: Resultat av den tredje gelelektroforesen, utförd 24/11.

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 20 Fjärde försöket Figur 13 visar resultatet från den fjärde omgången av PCR och gelelektrofores. Alla prover utom nummer 3 och 4 var här tillräckligt bra för sekvensering. Därför kompletterades serien med prov 3 och 4 från den tredje gelelektroforesen. (Prov nummer 2 är väldigt otydligt och syns därför knappt på bilden. Sekvensering Två sekvenseringar utfördes först för att jämföra resultaten. I databasen på NCBI (6) kan man utläsa att exonerna i den del av genen som undersöks finns i kvävebas nummer 1 till 378 och 538 till 599. De skillnader som hittades i exonerna i DNA-sekvensen redovisas i tabell 6. Rubriken ärta visar i vilken ärta som skillnaden fanns, kvävebas visar vilken kvävebas som faktiskt fanns i den aktuella ärtan och rubriken originalkvävebas visar vilken kvävebas som fanns hos den riktiga genen som fanns i databasen på NCBI. Rubriken nukleotid visar var i genen som skillnaden fanns jämfört med genen i databasen. Nukleotid 1 är alltså den första nukleotiden som kodar för protein, förutom startsekvensen. Serierna märkta med A och B kommer från den första sekvenseringen som hade sämre kvalitet än den andra (märkt med enbart siffror). Resultat från serie A och B måste därför bekräftas med resultat från den andra sekvenseringen. De skillnader som hittades i båda sekvenseringarna markeras med blått i tabell 6. I tabell 7 redovisas resultaten av undersökningen av aminosyrorna. Varför vi endast valt att analysera några skillnader framgår under rubriken Diskussion. I tabell 7 visar rubriken position i kodon om den aktuella Figur 13: Resultat av den fjärde gelelektroforesen, utförd 13/1 Ärta Kvävebakvävebas Original- Nukleotid 12, A12 T G 175 12, A12 G T 176 12, A12 T A 177 12, A12 A T 180 7, 11 G A 174 B11 C T 183, 184 B11 T A 184 6 G T 191 6 A T 192 6 G T 195 6 A C 196 2 G T 192 B8 T A 198 B11 T A 210 6, B6 G A 212 B6 G A 221 B8 G T 219 B11 C T 226 B11 T A 249 B11 T A 262, 266 B6 G C 275 B8 C A 280, 294 B8 C G 335 B11 A G 377 Tabell 6: Skillnader i sekvensen skillnaden sitter i början (1), i mitten (2) eller i slutet (3) av ett kodon. Triplett anger vilken mrna sekvens som framkommer av den aktuella skillnaden. Vid beräkning av denna har även de andra kvävebaserna i kodonet redovisats. Rubriken originaltriplett anger vilket

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 21 kodon de övriga ärterna har, aminosyra anger vilken aminosyra som bildas av kodonet i den specifika ärtan medan originalaminosyra visar vilken aminosyra som bildas i övriga ärter. Ärta Nukleotid Position i kodon Triplett (mrna) Originaltriplett (mrna) Aminosyra Originalaminosyra 12, 175, 176, 1, 2, 3 ACA CAU Thr His A12 177 12, 180 3 CAU CAA His Glu A12 6, B6 212 2 ACA AUA Thr Ile Tabell 7: Aminosyraförändringar Efter de här två sekvenseringarna hittade vi dessa intressanta skillnader, men för att säkra resultaten utfördes en tredje sekvensering. Då visade det sig att ingen av de ovan nämnda skillnaderna kunde observeras. Mer om detta under Diskussion. Även intronerna undersöktes men den enda skillnaden av intresse som hittades i mer än en sekvensering var i position 462 för ärterna A1, 1, A2 och 2. Där hade C bytts ut mot T. En annan observation som gjordes vid jämförelsen med genen på NCBI var att den undersökta genen faktiskt överensstämde med upp till 98 % med ett mänskligt protein som har betydelse för immunförsvaret. Detta var förvånande eftersom vi trots allt arbetar med ärter. Samtidigt visar detta på att det är små förändringar som gör stora skillnader när det kommer till ett proteins funktion. Utställning Utställningen gick väldigt bra och många var intresserade av projektet. Vi belönades med första pris och gick alltså vidare till finalen. Som pris fick vi förutom finalplatsen 1500 kr att dela på samt varsitt diplom.

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 22 DISKUSSION Resultatanalys När vi jämförde de olika ärternas datum för första blomning kunde vi konstatera att de ärter som har sitt geografiska ursprung i de nordligare delarna av Sverige generellt sett började blomma tidigare. Detta stämde väl överens med resultaten av Matti Leinos och Lena Nygårds försök (1). Att de nordligare ärterna blommar tidigare kan bero på att växtsäsongen i de delarna av Sverige är kortare och att det då krävs en tidigare blomning för att det ska finnas tid för ärten att reproducera sig. 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Genomsnittlig blomningsstart (efter antal dagar) Figur 14: Ärtornas blomningstid I Leino och Nygårds försök var det de bohuslänska ärterna som började blomma sist och detta överensstämde med våra resultat. I figur 14 motsvaras de bohuslänska ärterna av Brattebräcka och Solberga som var de svenska ärter som började blomma sist. Att den polska ärtan började blomma ännu senare beror sannolikt på att den har ursprung längre söderut. När vi sedan skulle analysera resultaten från våra laborationer, valde vi att endast undersöka aminosyrorna för de skillnader som fanns i resultaten från båda sekvenseringarna. Vi har även analyserat graferna som vi har fått från sekvenseringen. De grafer som visade en tydlig topp för kvävebaserna har tagits med medan de kvävebaser där toppen var otydlig eller hade flera toppar ej har tagits med i resultaten eftersom vi inte kan vara säkra på att det är ett pålitligt resultat. Figur 15 är ett exempel på detta, det finns Figur 15: Exempel på graf med otydliga toppar två toppar bland annat i position 80. Skillnaderna som hittades hos ärta 12 och A12 (tabell 6) är ett också exempel på detta. De aktuella kvävebaserna hade otydliga toppar och är därmed inte tillförlitliga.

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 23 De skillnader som finns representerade i båda sekvenseringarna och har tydliga toppar i diagrammet är givetvis betydligt säkrare. Därför kan vi vara säkrare på att den förändring som syns hos ärta 6 och B6, på position 212 i genen, verkligen ändrar aminosyrasekvensen i proteinet om man jämför med postion 221 som bara hittades i B6 (figur 16). Övriga skillnader kan bero på fel vid sekvenseringen, men de skulle kunna vara korrekta. Vi kan tyvärr inte veta detta. När vi jämförde resultaten med den tredje sekvenseringen, hittades dock inte denna skillnad. Detta försämrar givetvis säkerheten, men den är ändå värd att notera då den hittades i två av tre fall. Figur 16: Skillnader som hittades i position 212 och 221. I figur 16 kan man tydligt se skillnaden som återfinns hos både prov 6 och B6. Detta markeras med en lång vit pil i figuren. Den korta pilen visar en skillnad som endast finns hos prov B6 och den är alltså inte lika tillförlitlig. Prov 6 (och B6) motsvaras av gråärten Väse från Värmland. I tabell 3 kan man se att den var den första ärten att blomma och även att tre plantorna började blomma med endast en dags mellanrum. Väse var den ärt som hade jämnast blomningstid av de ärter som har undersökts. I tabell 7 kan man se att denna skillnad orsakar en förändring i aminosyran, treonin bildas istället för isoleucin. Denna ändring låg som tidigare nämnt i ett exon. En ändring i DNAsekvensen innebär att mrna blir annorlunda vid transkriptionen om ändringen ligger i ett exon. En ändring i mrna innebär i sin tur att ett visst kodon ändras vilket kan leda till att en annan aminosyra bildas. Detta kan påverka proteinets veckning och även proteinets funktion eftersom aminosyrorna binder olika till varandra. Om man jämför strukturen för treonin, som bildas istället för isoleucin (figur 17) kan man se att isoleucin är opolär medan treonin är polär. Detta innebär att proteinet veckar sig annorlunda på grund av den nya aminosyran. Eftersom både proteinveckning och aminosyrasekvens har Figur 17: Strukturformler stor betydelse för det färdiga proteinets funktion så är det sannolikt att för treonin och isoleucin den här förändringen faktiskt har betydelse för blomningen. Det skulle i det här fallet kunna medföra att proteinets funktion försämras och att ärten blommar tidigare. De skillnader som finns i introner har ingen betydelse för proteinets struktur eller veckning. De kan däremot ha betydelse för splitsning, därför är skillnaden som vi hittade i två ärter i alla

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 24 sekvenseringarna både relativt säker och intressant, eftersom de ärterna båda har sitt ursprung i Jämtland (Jämtländsk grå och Lit). Denna skillnad ligger i det första intronet. En mutation i ett intron, särskilt i det första, kan påverka genens uttryck, dvs. hur mycket mrna som bildas. Eftersom den här genen fungerar som en repressor 8 av blomning så skulle en minskning av mrna kunna medföra en minskning av det bildade proteinet och därmed orsaka tidig blomning. För att få reda på detta skulle man kunna mäta hur mycket mrna som bildas. Även om vi har fått ett resultat kan vi inte bortse från att det är många gener som samverkar i en växt och därför kan påverka blomningen indirekt. Eftersom det här är ny forskning så har vi bara våra egna resultat att gå på. Vi kan inte jämföra med något facit. Felkällor Den mänskliga faktorn är alltid en felkälla i alla sorters laborationer. Dessa kan involvera till exempel felaktiga volymer, inkubationstider eller temperaturer. Vår egen ovana med laborationsutrustningen kan också ha inverkat på resultaten. Plantering Gällande blomningstiden måste man ta hänsyn till det faktum att vissa ärter inte blommade, eller har fått ett annorlunda blomningsdatum, på grund av att de växte in i värmelampan och torkade ut. De som ej började blomma markeras med ett streck i tabell 3 och de som växte in i värmelampan har fått noteringen ogiltig. DNA-extraktion Proverna innehöll tillräckligt höga koncentrationer av DNA, vilket innebär att laborationen lyckades. Spektrofotometern har dock en viss felmarginal och om man tittar i tabell 4 så ser man att Jämtländsk grå hade koncentrationen 360 ng/µl. Detta är ganska orimligt. Det visade sig också i senare laborationer att proverna fortfarande visade tecken på innehåll av etanol. Detta innebär att något gick fel i det steg där vi använde AW-buffert, vars syfte är att ta bort kvarvarande etanol. I vår laborationshandledning kunde man läsa att man skulle ta bort DNeasy mini spin column från provröret försiktigt så att den inte kom i kontakt med etanolen i filtratet, eftersom etanolen då skulle överföras till provet. Troligen är detta vad som hände med våra prover. Gelelektrofores Gelen kan ha varit felaktigt tillredd, t ex med för mycket agaros vilket skulle ha gjort gelen för hård. Dock kunde storleksmarkörerna vandra utan problem, vilket borde innebära att gelen fungerade som den skulle. Sekvensering Risken finns att kvaliteten på de prover som skickades in inte var så bra och att detta gjorde det svårare att få en korrekt sekvensering. Samtidigt gjorde vi en gelelektrofores innan vi skickade in dem just för att säkerställa en bra kvalitet. Gelelektroforesen innan den andra sekvenseringen visade att alla prover förutom 3 och 4 innehöll DNA. Detta visade sig även i sekvenseringen då stora delar av resultaten hade dålig kvalitet för just de proverna medan de övriga var av god kvalitet. Innan de skickades in gjordes även en mätning av koncentrationen med en spektrofotometer. Koncentrationen var acceptabel i samtliga prover. 8 förhindrare

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 25 En annan högst relevant felkälla är att samtliga prover hade dålig kvalitet i början och slutet av sekvensen. Vad detta beror på vet vi inte men det gjorde det omöjligt för oss att analysera början och slutet av sekvenserna. Därför kan det finnas skillnader i de områden som vi inte kunnat undersöka. Ett problem som vi stötte på när vi förberedde proverna för den tredje sekvenseringen var att det fanns för lite templat kvar. Vi var då tvungna att späda proverna med vatten för att få den önskade volymen, 15 µl, som det anlitade företaget Eurofins MWG Operon efterfrågade (IV). Följaktligen blev koncentrationen av DNA betydligt lägre och detta kan ha påverkat kvaliteten på resultaten. Därför användes dessa resultat mest för att bekräfta de tidigare. Förbättringar För att inte projektet skulle bli så tidskrävande som det faktiskt blev så hade vi kunnat effektivisera arbetet genom att dela upp laborationsarbetet så att inte alla hade behövt laborera varje gång. Vi gjorde trots allt fyra omgångar av PCR och gelelektrofores. Alla hade inte behövt närvara varje gång. Om vi hade gjort det mer tidseffektivt hade vi kanske hunnit med att analysera även den andra halvan av genen och kanske upptäckt fler skillnader eftersom två av de totalt fyra exonerna finns i den andra halvan. Detta fick vi tyvärr avstå från nu eftersom tiden inte räckte till. Då två av gruppmedlemmarna inte hade arbetat med liknande laborationsutrustning förut gick laborationerna långsamt i början. Vi hade möjligen kunnat använda skolans laborationsutrustning för att kunna öva innan med exempelvis mikropipetter och på så sätt även minskat risken för fel vid de riktiga laborationerna. Vid en eventuell fortsättning av projektet skulle den andra halvan av genen kunna analyseras för att upptäcka fler skillnader, men man skulle också kunna mäta hur mycket mrna som bildas i de olika ärterna. På så sätt skulle man kunna ta reda på om förändringen i intronet har någon betydelse för produktionen av mrna och därmed proteinet. Vad vi har lärt oss Eftersom stora delar av vårt projekt har bestått av laborationsarbete så har vi fått större laborationsvana. Om man jämför de olika gelelektroforeserna kan man se att resultatet har förbättrats markant varje gång vi upprepat försöket. Vi har även blivit mer självständiga vid laborationstillfällena då vi har fått arbeta mycket självständigt på universitetet, något som vi inte var vana vid från skolan där det alltid finns en lärare närvarande som vet exakt vad som ska ske. Vi har även fått djupare förståelse för biologiska processer i växter och för de reaktioner som sker i de laborationer som vi har utfört under projektet. Vi har i tidigare kurser i biologi och kemi kommit i kontakt med dessa metoder men det är först nu vi verkligen har förstått vad som sker, hur det sker och varför det sker. Vi har lärt oss att värdera resultaten och ta ställning till om de är pålitliga eller om skillnader i sekvenserna mer troligt beror på felaktigheter från sekvenseringen. Under analysen använde vi olika datorprogram för att analysera våra sekvenser. Vi testade några olika men fastnade för det mest överskådliga programmet som ordnade kvävebaserna

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 26 enligt färg och som passade ihop dem så att man enkelt kunde se skillnaderna. Programmet som vi använde heter ClustalX 2.1. Vi testade även onlineversionen av berörd mjukvara men den var betydligt sämre. Vi har under projektet blivit bättre på att samarbeta och planera arbetet. Vi har följt projektplanen så långt det har varit möjligt. När projektplanen skrevs var det svårt att exakt tidsplanera arbetet eftersom vi var beroende av universitetet. I efterhand visade det sig dock att vår uppskattning av tidsåtgång stämde väldigt bra, det enda vi fick skjuta upp var tillverkningen av planschen. Detta berodde på att vi inte hade tillgång till alla resultat i februari. Skrivandet av loggbok var också en ny erfarenhet som underlättade rapportskrivandet avsevärt. Den viktigaste erfarenheten som vi har anförskaffat under projektets gång är att vi har lärt oss att forska. Vi har lärt oss hur ett forskningsprojekt går till och att det ofta till stor del bygger på upprepning. Vi trodde exempelvis inte att vi skulle behöva göra PCR fyra gånger för att få ett bra resultat. Vi är nöjda med våra ansträngningar och tror att vi kommer att ha stor nytta av våra nyvunna kunskaper i framtiden. Vi anser att syftet med projektet uppnåddes, då vi fick svar på våra frågeställningar. Vi fick även relevanta resultat då vi hittade skillnader i genen på samma ställen i flera sekvenseringar. SLUTSATSER Under projektet har vi kommit fram till att skillnader i geografiskt ursprung hos gråärter har lett till att ärterna har anpassat sig till miljön och att de därför börjar de blomma olika snabbt. Ärterna från norra Sverige började blomma tidigt pga. deras korta växtsäsong medan de bohuslänska ärterna började blomma senare. Dessa skillnader beror delvis på skillnader som ändrar aminosyrasekvensen i proteinet LF. Vi hittade en skillnad i ett exon hos ärten Väse, som ändrar en aminosyra i proteinet. Eftersom den dock inte hittades i alla sekvenseringar är den inte helt tillförlitlig. Om den är korrekt ändrar den en aminosyra i proteinet. Aminosyran isoleucin byts ut mot treonin vilket ändrar proteinets veckning eftersom de har olika polaritet. Detta kan ändra proteinets funktion. En avvikelse som hittades i alla sekvenseringar fanns hos ärterna Lit och Jämtländsk grå. Den fanns i det första intronet och kan därmed ha betydelse för hur mycket mrna som bildas och därmed mängden bildat LF-protein.

BERZELIUSSKOLAN PROJEKTARBETESRAPPORT 27 KÄLLOR 1. Leino, Matti; Nygårds, Lena. Puggor och pollusker- svenska lokalsorter av ärt. Svensk botanisk tidskrift. 2008: 102. p. 153-162. 2. Foucher, Fabrice; Morin, Julie; Courtiade, Juliette; et al. DETERMINATE and LATE FLOWERING Are two TERMINAL FLOWER1/CENTRORADIALIS Homologs That Control Two Distinct Phases of Flowering Initiation and Development in Pea. The Plant Cell. [2011-02-10]; URL: http://www.plantcell.org/cgi/reprint/15/11/2742 3. Jung, Christian; Müller, Andreas E. Flowering time control and applications in plant breeding. Trends in plant science. 2009; 14 (10): 563-571. 4. Nationalencyklopedin. URL: [2011-02-27] http://www.ne.se/ 5. DNEasy Plant Mini Kit [2011-02-10]; URL: http://www.qiagen.com/products/genomicdnastabilizationpurification/dneasyplants ystem/dneasyplantminikit.aspx#tabs=t1 6. GeneJET PCR Purification Kit [2011-02-10]; URL: http://www.fermentas.com/en/products/all/nucleic-acid-purification/kits/k070-genejetpcr-purification?print 7. Hartwell, Leland H.; Hood, Leroy; Goldberg, Michael L.; Reynolds, Ann E.; Silver, Lee M. Genetics From Genes to Genomes. Fjärde upplagan. New York: McGraw-Hill; 2011. p. 314-317. 8. National Center for Biotechnology Information: Blast. [2011-1-27]; URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi?program=blastn&blast_programs=m egablast&page_type=blastsearch&show_defaults=on&link_loc=blasth ome Övriga källor som har använts men som ej hänvisas till i texten: The Sequence Manipulation Suite: Reverse Complement [2011-02-16]; URL: http://www.bioinformatics.org/sms/index.html Figurer Figur 1 : PCR. [2011-03-02] ; URL : http://universe-review.ca/r11-16-dnasequencing.htm Figur 2 : Hartwell, Leland H.; Hood, Leroy; Goldberg, Michael L.; Reynolds, Ann E.; Silver, Lee M. Genetics From Genes to Genomes. Fjärde upplagan. New York: McGraw-Hill; 2011. p. 315. Figur 17: Isoleucin. [2011-02-27]; URL: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/4/46/l-isoleucin_-_l- Isoleucine.svg/200px-L-Isoleucin_-_L-Isoleucine.svg.png