INDUKTION AV ENZYMAKTIVITET I NÄRINGSLÖSNING OCH DESS EFFEKT PÅ ÖVERLEVNADEN HOS FUSARIUM OXYSPORUM F.SP. CYCLAMINIS

Examensarbeten inom Hortonomprogrammet. 2003:3 (ISSN 1403-0993) INDUKTION AV ENZYMAKTIVITET I NÄRINGSLÖSNING OCH DESS EFFEKT PÅ ÖVERLEVNADEN HOS FUSARIUM OXYSPORUM F.SP. CYCLAMINIS Induction of enzyme activity in nutrient solution and its effect on the survival of Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis av Tobias Urban Teodor Lindblom Institutionen för Växtvetenskap Kompetensgruppen för Rotbiologi Handledare: T. Brand Bitr. handledare B. Alsanius Examinator: H. Asp

Abstract: In a trial to induce extracellular activity of proteases, chitinases, glucanases and cellulases in nutrient solution and to also create a negative effect on the survival of Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis, killed mycelium of Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis was amended in vitro to nutrient solution from tomato culture in a closed NFT-system with integrated slow-filter. The activity of hydrolytic enzymes was quantified by light-extinction measurements of dyed enzyme substrates during three days. Living conidia of Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis was then inoculated into the induced nutrient solutions. The survival of the conidia where then measured by viable count on Fusarium oxysporum-selective media during seven days. The results showed that extracellular activity of hydrolytic enzymes was induced and the survival of Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis was reduced in solution induced with killed mycelium. No correlation between enzyme activity and effect on the pathogen could be established. Sammanfattning. I ett försök att inducera extracellulär aktivitet av proteaser, kitinaser, glukanaser och cellulaser i näringslösning samt att skapa negativ effekt med avseende på överlevnaden av Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis, tillsattes in vitro avdödat mycel av Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis till näringslösning från tomatodling med slutet NFT-system och integrerat långsamfilter. Genom extinktionsmätning med färgmarkerade enzymsubstrat mättes aktiviteten av hydrolytiska enzymer under tre dygn. Därefter tillsattes levande Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis konidier till behandlade näringslösningar och överlevnaden mättes under sju dygn genom viable count på Fusarium oxysporum-selektivt medium. Resultaten visade att extracellulär aktivitet av hydrolytiska enzymer inducerades och att den inducerade lösningen uppvisade negativ effekt på överlevnaden in vitro hos Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis. Inget samband mellan enzymaktivitet och negativ effekt på patogenen kunde fastställas.

1 INLEDNING 1 2 MATERIAL OCH METODER 3 2.1 Mikrobiologiska medier, mikroorganismer och hantering 3 Selektivt medium för Fusarium oxysporum 3 Yeast medium, flytande (YM) 3 Potatodextrose agar (PDA) 3 Produktion av Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis (FOCY) mycelium 4 Mikrokonidiesuspension av Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis (FOCY) 4 2.2 Inducering av enzymaktivitet 4 Tomatkultur 4 Inducering 6 Effekt av enzyminducerad näringslösning på överlevnaden av FOCY 6 2.3 Analyser 6 Biokemiska analyser 6 Växtpatologiska analyser 7 Statistisk bearbetning. 8 3 RESULTAT 10 3.1 Biokemiska resultat 10 Mätning av enzymaktivitet 10 Mätning av glukoskoncentration 13 3.2 Växtpatologiska resultat 13 Överlevnadstest 13 4 DISKUSSION 16 5 KÄLLFÖRTECKNING 19

1 Inledning Brist på vatten av bra kvalitet och miljöpåverkan av näringsutsläpp från odling har gjort att användningen av slutna odlingssystem där vatten och näringsämnen recirkuleras i odlingen har uppmuntrats från myndighetshåll. Ett av problemen med recirkulerande näringslösning är dock att system utan någon form av rening kan föra med sig risker för smittspridning inom odlingen. Detta bl.a. på grund av patogena svampars förmåga att bilda sporer vilka snabbt kan spridas i den cirkulerande näringslösningen. Om en planta insjuknar kan den på mycket kort tid smitta ned stora delar av odlingen innan skadan är upptäckt och åtgärdad. Förebyggande åtgärder för att förhindra eller mildra sjukdomar och smittspridning är därför av stor vikt vid odling i recirkulerande system. Rening med ozon, ultraviolett ljus och pastörisering är några av de åtgärder som används inom växthusodling idag. Alternativt eller i kombination med detta används även olika typer av filtrering för att minska mängden skadliga organismer och substanser. Forskare har länge förbryllats av det faktum att vissa odlingsjordar har förmågan att undertrycka sjukdomar, s.k. suppressivitet. Orsakerna till suppressiviteten är i många fall inte klarlagda men kan bero på kemiska, fysikaliska eller biologiska faktorer eller en kombination av dessa (Schneider, 1982). Mikrobiell konkurrens och predation är mekanismer av antagonism som är en viktig faktor för att förklara suppressivitet. Det kan röra sig om ren konkurrens om näringsämnen, utsöndrande av toxiska substanser (antibiosis) som bl.a. ger upphov till fungistasis, direkt parasitering av svampkroppar eller predation av andra organismer (Postma, 1996). En hög biologisk buffringsförmåga och/eller närvaro av antagonister kan därmed vara några förklaringar till suppressivitet. Genom att odla samma gröda utan växelbruk kan suppressivitet ibland utvecklas spontant i marken efter ett antal kulturomgångar med angripna grödor och produktionsbortfall. Detta är känt hos bl.a. vete, s.k. take-all decline och melon (Schneider, 1982, Sneh et al., 1987). Denna suppressivitet beror på en biologisk faktor, en antagonist, som inte funnits i större utsträckning tidigare. När patogenen funnits i större mängd har antagonisten kunnat dra nytta av detta och kunnat få en större konkurrenskraft. Antagonisten har därför kunnat öka till en sån mängd att patogenen minskat till en ofarlig nivå. Angreppet/närvaron av patogenen har därmed inducerat antagonisten och därmed suppressiviteten. En möjlighet för sjukdomskontroll öppnar sig här. Kan vi på något sätt snabba på den mikrobiella successionen i odlingen och på så sätt snabbare uppnå en stabilitet och kanske suppressivitet genom att tillsätta goda mikroorganismer eller kemikalier till odlingen? Det finns idag flera olika antagonistpreparat på marknaden, främst för ovanjordiskt bruk men även till betning av frö m.m. Exempel på sådana är Mycostop (Streptomyces sp.) och Binab TF WP (Trichoderma sp.) (Petterson, 2001). Problemet med att utveckla preparat som dessa ligger i att organismer som har bra effekt in vitro ofta inte ger tillräckliga effekter vid odling in situ. Preparaten består dessutom av levande material vilket medför ytterligare problem som begränsad lagringstid m.m. Går det i stället att "föda upp" rätt antagonister i systemet utan att känna till vilka de är? Mitchell & Alexander (1961) visade i fältförsök att detta är möjligt genom att tillsats av polysackariden kitin (poly-β-1,4-n-acetyl-glukosamin) till jord hade en skyddande effekt mot patogenen Fusarium solani f.sp. phaseoli. Det är rimligt att anta att någon organism har kunnat utnyttja polysackariden, och därmed fått ökad konkurrenskraft, och därefter haft en hämmande effekt på patogenen. 1

Cellväggen hos olika svampar består vanligtvis av 80-90 % polysackarider och till resterande del främst proteiner och lipider (Bartnicki-Garcia, 1968). Tabell 1 visar några svampgruppers sammansättning av olika komponenter. Tabell 1. Polysackarider i cellväggen hos olika svampgrupper (enligt Bartnicki-Garcia, 1968, modifierad). Polysackarider Taxonomiska grupper Cellulosa-Glykogen Acrasiales Cellulosa-Glukan Oomycota Cellulosa-Kitin Hyphochytridiomycota Kitosan-Glukan Zygomycota Kitin-Glukan Chytridiomycota, Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycota Mannan-Glukan Saccharomycetaceae, Cryptococcaceae Mannan-Kitin Sporobolomycetaceae, Rhodoturalaceae Polygalaktosamin-Galaktan Trichomycota Hos Fusarium oxysporum består cellväggen till 50-60 % av glukoprotein. Glukoproteinerna bildar ett lager kring ett inre skikt av kitin och glukankomponenter i form av α-1,3-glukan och β-1,3-glukan (Schoffelmeer et al., 1999). Kitininnehållet i cellväggen skulle kunna förklara den hämmande effekten i försöket av Mitchell & Alexander (1961). Förutsatt att antagonisten är av parasit- eller predationstyp är det rimligt att anta att något som kan leva på Fusarium oxysporum också har smak för kitin, eller omvänt. Om tillsatsen/kompositionen av polysackarider är mer specifik, borde då inte gynnandet av rätt organismer bli bättre? Vad passar bättre än patogenen själv? I mitt försök ville jag in vitro testa vilken effekt tillsats av avdödad Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis (FOCY) har på näringslösning från slutna odlingsystem med avseende på enzymaktivitet och överlevnad hos levande FOCY. Försöket kan på vissa sätt liknas vid en passiv vaccinering. 2

2 Material och Metoder Försöket var uppdelat i två delar. I den första delen, induceringen, tillsattes avdödat mycel till näringslösningen. Som en jämförelse gjordes även motsvarande med levande mycel. Under induceringen mättes aktiviteten av fyra grupper av lytiska enzymer (kitinaser, proteaser, glukanaser och cellulaser). I den andra delen tillsattes FOCY mikrokonidier till den inducerade näringslösningen. Vid olika tidpunkter togs odlingsprov för att undersöka överlevnaden hos FOCY. 2.1 Mikrobiologiska medier, mikroorganismer och hantering Selektivt medium för Fusarium oxysporum enligt Komada (1975) Autoklaverades K 2 HPO 4 1 g KCl 0,5 g MgSO 4 x 7 H 2 O 0,5 g EDTA Fe-Na-salt 10 mg L-Aspargin x H 2 O 2,0 g D(+)Galaktos 20,0 g Bacto agar (Difco) 20,0 g Avjonat vatten 900 ml Tillsatser efter autoklavering (under 50 C) Autoklaverat avjonat vatten 100 ml Na 2 B 4 O 7 x 10 H 2 O (Borax) 1,0 g PCNB (Pentaklornitrobensen,99 %) 0,76 g BILE (bovin oxgalla) 1,0 g Streptomycinsulfat 0,3 g PCNB löstes i ca 10 ml aceton innan tillsättning. Borax, BILE och streptomycinsulfat löstes var för sig i sammanlagt 100 ml autoklaverat avjonat vatten (<50 C) innan tillsättning Därefter justerades ph till 3,8 ± 0,2 med 1 M fosforsyra. Yeast medium, flytande (YM) Yeast extract (Difco) 5 g Proteose pepton (Difco) 5 g Glukos 10 g Avjonat vatten 1000 ml Potatodextrose agar (PDA) Potatodextrose agar (Difco) 39 g Avjonat vatten 1000 ml ph 5,6 ± 0,2 Alla medium autoklaverades vid 121 C. 3

Produktion av Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis (FOCY) mycelium En inokuleringsssupension tillreddes genom att tillsätta ca 20 ml steril 0,85 % koksaltlösning till en till tre veckor gammal FOCY kultur (PDA) och släpa en Drygalskiraka under 20 sekunder för att få ut svampvävnader i lösningen. Petrisskålar (9 cm) fylldes med vardera ca 25 ml YM. Varje skål tillfördes därefter 100 µl inokuleringssuspension. Inkubering skedde vid rumstemperatur i fyra till fem dygn i mörker. Mycelet tvättades på filterpapper i tre omgångar med steril 0,85 % koksaltlösning och läts därefter dränera i ca 20 min. Vatteninehållet efter dränering uppmättes till ungefär 95 %. Avdödad FOCY framställdes genom att homogenisera mycel och avjonat vatten i provrör under nedkylning med isbad. Homogeniseringen gjordes med provrörsmixer i 5 min på högsta effekt. Suspensionen centrifugerades under 30 min (4000 g, 4 C) varefter pelletsen återigen blandades upp med avjonat vatten. Suspensionen utsattes därefter för ultraljud i isvattenbad under 3 x 5 min. Suspensionen tvättades därefter 3 gånger med omväxlande centrifugering och homogenisering av pellets. Kvarvarande pellets autoklaverades och frystorkades. Materialet kylförvarades vid 2 ºC. Mikrokonidiesuspension av Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis (FOCY) En inokuleringssuspension för överlevnadstestet bestående av främst mikrokonidier framställdes genom att tillsätta 15 ml steril 0,85 % kosaltlösning till 1 vecka gammal FOCY-kultur (PDA), och därefter släpa en Drygalskiraka över medieytan i 20 s. Lösningen filtrerades därefter genom fyra lager "ostduk" (Förbandsgas, 23 trådar cm -2, Apoteksbolaget). Den filtrerade lösningen innehöll ungefär 10 7 cfu FOCY ml -1. 2.2 Inducering av enzymaktivitet Tomatkultur Sex NFT-system för tomatodling iordningställdes på våren 2001 i växthus förlagda i Alnarp. Systemen stod i parallella rader där de fyra mittersta var utrustade med långsamfilter. De två yttre raderna användes som blindrader. I de 6 m långa odlingsrännorna med 2 % lutning las plastfolie vilken senare veks över (Figur 1). Efter varje ränna placerades en 100 l bufferttank (CHEMO, Tyskland). I tanken placerades en pump (Rena C40 Turbo) som transporterade näringslösningen vidare till ett långsamfilter som bestod av en 200 l regnvattentunna (Stefanplast, Italien) fylld med granulerad stenull (Grodan A/S Nr 012519, 200 kg m -3 ). Ett breddavlopp ledde överskottsvatten tillbaka till bufferttanken (Figur 2). I botten på varje tunna las ett dräneringsrör vilket ledde vattnet vidare genom en slang till odlingsrännans början. Flödet reglerades manuellt med en ventil (Gardena, Tyskland) till 0,5 l min -1. I varje system planterades i början av februari tomatplantor av sorten Aromata med 14 plantor/ränna. Näringlösningen (Tabell 2) justerades dagligen med svavelsyra till ph 5,9 ± 0,2. Ledningstalet justerades till ca 3,5 ms cm -1 genom spädning (kranvatten) eller bruksfärdig näringslösning (3,0 ms cm -1 ). Temperaturen i växthuset sattes till 19 ºC dag och 18 ºC natt. För att kompensera dåliga ljusförhållanden gavs assimilationsljus fram till slutet av mars. Plantorna sköttes med normala kulturåtgärder och toppbeskars när de nått en höjd av 2 m. 4

Figur 1. Tomatkultur i NFT-odlingsystem. Tomaterna planterades i odlingsrännor vilka var belagda med plastfolie (bilden till höger). Folien veks därefter över rötterna (bilden till vänster). Flödet av näringslösning justerades med ventil till 0,5 l min -1 per rad. Figur 2. Långsamfilter använda i systemet. Från bufferttanken (till vänster) pumpas näringslösningen till filtret (till höger). För att hålla vattennivån i filtret konstant leddes överskottslösning tillbaka till bufferttanken via ett breddavlopp. Långsamfiltren var i botten försedda med dräneringsrör av standardtyp som ledde lösning vidare till ventil och slang. Filtren fylldes med granulerad stenull. 5

Tabell 2. Näringslösning för tomatkultur för EC ~3,0 ms cm -1 (enligt Sonneveld & Straver, 1989, modifierat). Salt mm KNO 3 10,6 NH 4 NO 3 0,6 MgSO 4 2,5 KH 2 PO 4 2,0 Ca(NO 3 ) 2 5,6 FeEDTA 0,025 MnSO 4 0,0167 ZnSO 4 0,0083 H 3 BO 3 0,0417 CuCl 2 0,00125 Na 2 MoO 4 0,0008 Inducering Sex 500 ml flaskor fylldes med vardera 300 ml näringslösning från ett av NFTsystemen. Nyskördat levande mycelium av FOCY tillsattes till tre av flaskorna i koncentrationerna 0 %, 0,01 % och 0,1 % (w torrvikt v -1 ). Avdödat mycel tillsattes till de kvarvarande flaskorna i samma koncentrationer. Näringslösningarna inkuberades i rumstemperatur på skakbord (175 rpm). Mätning av aktiviteten i lösningarna hos fyra grupper av lytiska enzymer (cellulaser, glukanaser, kitinaser och proteaser) skedde efter 0, 1, 2 och 3 dygn. Vid dessa tillfällen mättes även glukoshalten. Effekt av enzyminducerad näringslösning på överlevnaden av FOCY I näringslösningar som inducerats med avdödad FOCY, ej inducerad näringslösning (kontrollen i induceringen) och i ej använd steril näringslösning gjordes ett överlevnadstest. En mikrokonidiesuspension av FOCY tillsattes till den enzyminducerade näringlösningen till ca 10 4 cfu ml -1 näringslösning. Överlevnaden hos dessa räknades genom viable count på Fusarium oxysporum-selektivt medium. 2.3 Analyser Biokemiska analyser Mätning av enzymaktivitet Mätningen av enzymaktiviteten kan delas upp i tre delmoment; enzymatisk reaktion, separering och extinktionsmätning. Prov tillfördes en lösning med färgmärkta enzymsubstrat i provrör enligt Tabell 3 och inkuberades på skakvattenbad (200 rpm) vid 37 ºC i 4 h. Varje behandling mättes med två paralleller. Efter inkubering avbröts reaktionen genom att sänka ph i provet med syra (enligt Tabell 3) till dess att ej spjälkat enzymsubstrat inte längre var löslig i vätskan. Alla enzymmätningar utom den av proteas krävde därefter nedkylning i isbad under 10 min. Provet centrifugerades vid 4000 g och 3 ºC under 10 min varefter supernatanten fördes över till 96-brunnars multititaerplattor (Microtest Plate 96-Well, Sarstedt, Tyskland) 6

med pippett. Varje brunn tillfördes 200 µl supernatant. Varje prov mättes i fyra brunnar. Avläsningen av plattorna skedde med spektrometer avsedd för multititaerplattor (DIGISCAN, AsysHitec, Österrike; DIGIWIN programvara.) Till bakgrundsmätning utfördes samma procedur med 50 mm Natriumacetatbuffert (ph 5,3) i stället för prov. Medelvärdet av två provparalleller gav en observation i försöket. Tabell 3. Använda ensymsubstrat för mätning av aktivitet hos respektive enzymgrupp. Enzym substrat substrat prov syra mätvåglängd Proteaser Hide Powder Azure; CAS 37340-54-8; Sigma 10 mg 2 ml 0,5 ml H 3 PO 4 (2 M) 650 nm Kitinaser Carboxymethyl-Chitin Remazol Brilliant Violet; Loewe biochemica 0,5 ml 1 ml 0,5 ml HCl (2 M) 550 nm Glukanaser Carboxymethyl-Curdlan Remazol Brilliant Blue; Loewe biochemica 0,5 ml 1 ml 0,5 ml HCl (2 M) 590 nm Cellulaser Carboxymethyl-Cellulase Remazol Brilliant Blue; Loewe biochemica 0,5 ml 1 ml 0,5 ml HCl (2 M) 590 nm Mätning av glukoshalt Glukoshalten i näringslösningarna mättes vid samma tillfällen som enzymaktiviteten med teststickor (Reflectoquant Glukose-test, Merck, Tyskland) vilka avlästes i en reflektometer (Rqflex 2, Merck). Detektionsgränsen var enligt tillverkaren 1 mg glukos liter -1. Växtpatologiska analyser I överlevnadstestet gjordes utstryk på selektivt medium enligt Komada (1975) efter 0 h, 4 h, 1 dygn, 2 dygn 4 dygn och 7 dygn för räkning. Varje utstryk omfattade 4-5 petrisskålar per behandling, replikat och spädning. Medelvärdet för de spädningar som räknades, gav en observation. Räkning av överlevnaden hos FOCY gjordes efter 3-5 dagar. Spädningarna som räknades var de som låg närmast intervallet 10-100 kolonier. Räkningen skedde manuellt. De plattor som visade starkt avvikande resultat uteslöts ur beräkningen. Totalt gjordes sex upprepningar av försöket vid tre olika tillfällen med ett par veckors intervall. Detta medförde att försöket till en början statistiskt fick betraktas som ett blockförsök där varje block omfattade två upprepningar. Utstryk av näringslösning från växthuset som gjordes på selektivt medium visade att Fusarium oxysporum inte fanns i NFT-systemet. 7

Statistisk bearbetning. Alla beräkningar utfördes i datorprogram (Matlab, 1999). Beräkning av enzymaktivitet. Enzymaktiviteten milliunit [mu] = 1000* (E 1 - E 2 ) * t -1. Där E 1 är extinktionen för prov (näringslösning + enzymsubstrat), E 2 är extinktionen för bakgrundsmätning och t är inkubationstiden i minuter. Relevanta jämförelser mellan de olika behandlingarna utfördes, med avseende på alla fyra enzymgrupper och vid tiderna 1,2 och 3 dagar (Tabell 4). Tabell 4. Jämförelser mellan behandlingarna Jämförelse a. Ej inducerad Inducerad med 0,01 % avdödad FOCY b. Ej inducerad Inducerad med 0,1 % avdödad FOCY c. Ej inducerad Inducerad med 0,01 % levande FOCY d. Ej inducerad Inducerad med 0,1 % levande FOCY e. Inducerad med 0,01 % levande FOCY Inducerad med 0,01 % avdödad FOCY f. Inducerad med 0,1 % levande FOCY Inducerad med 0,1 % avdödad FOCY Eftersom misstanke förelåg om att variansen hos den ej inducerade behandlingen var betydligt lägre än hos övriga behandlingar, testades detta enligt följande: H 0 : σ 1 = σ 2 mot H 1 : σ 1 < σ 2 (där σ 1 är variansen hos den ej inducerade behandlingen och σ 2 är variansen för jämförd behandling) Teststorheten blir s 2 2 1 /s 2 (där s 1 är standardavvikelsen hos den ej inducerade behandlingen och s 2 är standardavvikelsen för den jämförda behandlingen) H 0 förkastastades vid p-värden mindre än 0,05 från en F- fördelning med (n 1 1, n 2 1) frihetsgrader. Detta testades även för test e & f. Här var testet dock tvåsidigt (H 0 : σ 1 = σ 2 mot H 1 : σ 1 σ 2 ). På grund av misstanken om att olika varians fanns kunde inte jämförelserna göras med ett vanligt t-test (Behrens-Fishers problem). Enligt Welch (1947) kunde testet dock göras på följande sätt: H 0 : µ 1 = µ 2 mot H 1 : µ 1 < µ 2 (test a - d) eller H 1 : µ 1 µ 2 (test e och f) Där H 0 kan förkastas på nivån p. Teststorheten t beräknas enligt: X 1 X 2 t = 1 2 1 2 s1 + s2 n n 1 2 Under H 0 har t ungefär en t-fördelning där antalet frihetsgrader (v) beräknas enligt: v = 2 2 2 ( s1 / n1 + s2 / n2 ) 2 2 2 ( s / n ) ( s / n ) 1 1 1 n 1 + 2 n 2 2 1 2 8

Eftersom detta medförde frihetsgrader som inte var heltal trunkerades frihetsgraderna till närmaste lägre heltal. Av dessa två variabler (t, v) beräknades p enligt: t p = f ( t, v) dt T Där f T är t-distributionens funktion. Vid dubbelsidiga test (e och f) multiplicerades p med 2. Beräkning av överlevnad För varje upprepning beräknades ett överlevnadsindex genom att alla observationer dividerades med observationen vid t = 0 och logaritmerades med basen 10. För att undersöka eventuella skillnader och blockeffekter, gjordes till en början tvåvägs Anova-test. Detta test kräver normalfördelade resultat med lika varianser vilket kan förutsättas eftersom värdena är logaritmerade populationer. Tester för att jämföra behandlingarna sinsemellan gjordes enligt Tabell 5 om Anovatesten visade på skillnader mellan behandlingarna. Tabell 5. Upplägg av jämförande tester mellan olika behandlingar. Jämförelse behandling behandling g. Ej inducerat Inducerat med 0,01 % FOCY h. Ej inducerat Inducerat med 0,1 % FOCY i. Ej inducerat Steril näringslösning För att jämföra skillnader mellan de olika blocken gjordes jämförelser enligt Tabell 6 i de fall Anova-testen visade på skillnader mellan blocken. Tabell 6. Upplägg av jämförande tester mellan de olika blocken. Jämförelse block block j. 1 2 k. 1 3 l. 2 3 9

3 Resultat 3.1 Biokemiska resultat Mätning av enzymaktivitet 1,2 1,0 0,8 Proteaser 1,5 Kitinaser 1,0 Enzymaktivitet (mu) 0,6 0,4 0,2 0,0 0,6 0,4 0 d 1 d 2 d 3 d Cellulaser 0,5 0,0 4 3 0 d 1 d 2 d 3 d Glukanaser 0,2 2 0,0-0,2 0 d 1 d 2 d 3 d 0 d 1 d 2 d 3 d Dygn efter start Figur 3. Aktivitet hos olika enzymgrupper i ej inducerad näringslösning ( ), näringslösning inducerad med 0.01 % avdödad FOCY ( ) och näringslösning inducerad med 0,1 % avdödad FOCY ( ). Staplar anger standardavvikelser. Proteasaktiviteten blev signifikant högre i lösningar behandlade med avdödad FOCY jämfört med kontrollen redan efter ett dygn (se Figur 3). Detta gällde för båda koncentrationerna av FOCY. Efter två dygn hade aktiviteten avtagit något och efter tre dygn hade aktiviteten minskat ytterligare. Minskningen i proteasaktivet mellan dag 1-3 är ej statistiskt påvisad men visar på en tendens. Hos de övriga mätta enzymerna påvisades en signifikant ökning av aktivitet jämfört med kontrollen efter två dagar i lösningar behandlade med den högre koncentrationen av FOCY. Kitinasaktiviteten i behandling med den lägre FOCY-koncentrationen hade vid mätningen efter två dygn ökat något jämfört med kontrollen. Efter 3 dagar kunde ingen skillnad i aktivitet av kitinaser, cellulaser och glukanaser påvisas mellan inducerad näringslösning och kontroll. 1 0 10

Levande FOCY inducerade en liknande ökning av proteasaktivitet som avdödad FOCY (Figur 4). Dock fanns ingen statistisk skillnad mellan inducerad lösning och kontroll kvar efter tre dygn. För övriga enzymers aktivitet kunde inte någon behandlingseffekt påvisas statistiskt annat än för cellulas efter tre dygn i lösning med den lägre FOCYkoncentrationen, samt för glukanas efter ett dygn i den högre koncentrationen. Aktiviteten är dock låg i båda dessa fall. Signifikanta skillnader mellan inducering med avdödad och levande FOCY (jämförelse e & f) förelåg för proteasaktiviteten vid lägre koncentration av FOCY efter två dygn. Aktiviteten hos kitinas och cellulas efter två dygn i den högre koncentrationen av FOCY skiljer sig mellan levande och avdödad material. Hos glukanas finns en liknande tendens som dock ej är statistiskt säkerställd. En liten skillnad i induktionseffekt mellan levande och avdödad kunde påvisas för glukans efter ett dygn i den högre koncentrationen av FOCY. Aktiviteten av glukanas var dock mycket låg. 1,2 Proteaser 1,0 0,8 0,6 Kitinaser Enzymaktivitet (mu) 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,10 0,05 0,00-0,05-0,10 0,4 0,2 0,0-0,2 0 d 1 d 2 d 3 d 0 d 1 d 2 d 3 d 0,5 Cellulaser Glukanaser 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0-0,2-0,2-0,3 0 d 1 d 2 d 3 d 0 d 1 d 2 d 3 d Dygn efter start Figur 4. Aktivitet hos olika enzymgrupper i ej inducerad näringslösning ( ), näringslösning inducerad med 0.01 % levande FOCY ( ) och näringslösning inducerad med 0,1 % levande FOCY ( ). Staplar anger standardavvikelser. 11

Test av H0: σ 1 = σ 2 visade att varianserna hos de olika behandlingarna i många fall var olika vilket stöder att vi inte kan göra ett vanligt t-test (Tabell 7). Test av H0: µ 1 = µ 2 visade på skillnader enligt Tabell 8. Tabell 7. P-värden för test av varianserna σ 1 = σ 2, med avseende på enzymaktiviett, mellan; Ej inducerad (0 % FOCY) mot lösning inducerad med 0,01 % avdödad FOCY (a), 0 % FOCY mot 0,1 % avdödad FOCY (b), 0 % FOCY mot 0,01 % levande FOCY (c), 0 % FOCY mot 0,1 % levande FOCY (d), 0,01 % levande FOCY mot 0,01 % avdödad FOCY (e) och 0,1 % levande FOCY mot 0,1 % avdödad FOCY (f). Enzym dag a. b. c. d. e. f. Proteaser 1 0,0002 1. 0,0365 0,0005 0,0152 0,2876 0,4119 2 0,6948 0,0041 0,0020 0,0009 0,0052 0,3416 3 0,0028 0,0009 0,0229 0,0023 0,1428 0,2943 Kitinaser 1 0,8051 0,6561 0,5770 0,2333 0,2377 0,1673 2 0,0363 0,0005 0,0731 0,0004 0,3096 0,5325 3 0,0742 0,1878 0,2570 0,8595 0,1909 0,0340 Cellulaser 1 0,0733 0,0241 0,0060 0,0059 0,1860 0,3415 2 0,0855 0,5990 0,6210 0,0014 0,0515 0,0065 3 0,9777 0,6433 0,4199 0,0122 0,0170 0,0211 Glukanaser 1 0,0712 0,0220 0,5246 0,5873 0,0643 0,0143 2 0,3620 0,0000 0,4805 0,0000 0,3781 0,0113 3 0,4235 0,4770 0,4971 0,0354 0,4259 0,0815 1. Fet stil anger P α, α = 0,05 Tabell 8. P-värden för test av väntevärden µ 1 = µ 2 enligt Welch, med avseende på enzymaktiviett, mellan; Ej inducerad (0 % FOCY) mot lösning inducerad med 0,01 % avdödad FOCY (a), 0 % FOCY mot 0,1 % avdödad FOCY (b), 0 % FOCY mot 0,01 % levande FOCY (c), 0 % FOCY mot 0,1 % levande FOCY (d), 0,01 % levande FOCY mot 0,01 % avdödad FOCY (e) och 0,1 % levande FOCY mot 0,1 % avdödad FOCY (f). Enzym dag a. b. c. d. e. f. Proteaser 1 0,0008 1. 0,0000 0,0142 0,0001 0,9026 0,5162 2 0,0014 0,0016 0,0091 0,0060 0,0062 0,8148 3 0,0500 0,0316 0,1406 0,1865 0,7820 0,7058 Kitinaser 1 0,1845 0,0683 0,2695 0,1272 0,6820 0,5162 2 0,0156 0,0011 0,2460 0,1179 0,3802 0,0476 3 0,0780 0,2164 0,2120 0,1071 0,9552 0,3536 Cellulaser 1 0,2002 0,1522 0,3511 0,2440 0,3356 0,7642 2 0,2956 0,0064 0,2053 0,1205 0,5526 0,0188 3 0,3386 0,4111 0,0171 0,1064 0,1006 0,4538 Glukanaser 1 0,3118 0,2727 0,4841 0,0221 0,8418 0,0370 2 0,4318 0,0215 0,1022 0,2021 0,1698 0,0570 3 0,3033 0,0816 0,2614 0,1700 0,8354 0,3820 1. Fet stil anger P α, α = 0,05 12

Mätning av glukoskoncentration Ingen glukos kunde konstateras i lösningarna för någon behandling. Detektionsgränsen var enligt tillverkaren 1 mg glukos liter -1. 3.2 Växtpatologiska resultat Överlevnadstest Tabell 9. Tvåvägs Anova-test på överlevnaden av FOCY i enzyminducerade lösningar 0,1 och 0,01 % avdödad FOCY, ej inducerad näringslösning (kontroll i enzyminduceringen) och steril ej använd näringslösning. Upprepningar inom samma block är utförda vid samma tillfälle. P Block är sannolikheten för att det ingen blockeffekt finns. P Behandling är sannolikheten för att inga skillnader mellan behandlingarna finns. MSe är skattningen av variansen och har enligt testmodellen 18 frihetsgrader. Faktor 4 h 1 dygn 2 dygn 4 dygn 7 dygn P Block 0,0142 1. 0,0054 0,0249 0,0005 0,0260 P Behandling 0,0023 0,0015 0,0035 0,0012 0,0001 MSe, d.f. 18 0,2354 0,3655 0,7256 0,4208 0,4372 1. Fet stil anger P α, α = 0,05 Resultaten från tvåvägs Anova-test visade att det fanns signifikanta skillnader i överlevnad mellan de olika behandlingarna men även skillnader mellan blocken konstaterades (Tabell 9). 13

100 % Överlevnadsindex 10 % 1 % 0,1 % 0,01 % 0 4 h 1 d 2 d 4 d 7 d Tid efter inokulering Figur 5. Överlevnaden av FOCY i steril näringslösning ( ), ej inducerad näringslösning ( ), näringslösning inducerad med 0,01 % avdödad FOCY ( ) och näringslösning inducerad med 0,1 % avdödad FOCY ( ). Överlevnadsindex visar % av cfu ml -1 vid t = 0. Staplar anger standardavvikelse. Signifikanta skillnader (Tabell 10) fanns efter 1 dygn då FOCY i steril näringslösning hade sämre överlevnad än i ej inducerad näringslösning. Omvänt förhållande rådde efter 7 dagar. FOCY hade signifikant sämre överlevnad i näringslösning inducerad med 0,01 % FOCY än i ej inducerad lösning vid alla mättillfällen (jämförelse h.). Mellan näringslösning inducerad med 0,1 % FOCY och ej inducerad näringslösning kunde inga signifikanta skillnader konstateras (jämförelse i.) (Figur 5). Tabell 10. Konfidensintervall för jämförelser av överlevnad hos FOCY mellan olika behandlingar inducerade med avdödad FOCY på totalnivån α=0,05 där kompensering för fel av typ I skett med Bonferronis metod. Jämförelser mellan behandlingar; ej inducerad näringslösning mot steril näringslösning (g), ej inducerad näringslösning mot näringslösning inducerad med 0,01 % FOCY (h) och ej inducerad näringslösning mot näringslösning inducerad med 0,1 % FOCY (i). Jämförelse 4 h 1 dygn 2 dygn 4 dygn 7 dygn g. -0,72 0,76 0,09 1,93 1. -1,60 0,99-1,55 0,42-2,39-0,37 h. 0,38 1,86 0,52 2,37 0,38 2,98 0,20 2,18 0,01 2,03 i. -0,53 0,95-0,77 1,07-1,18 1,42-0,41 1,57-1,21 0,80 LSD Bonferroni 0,7394 0,9212 1,2980 0,9884 1,0075 1. Fet stil anger intervall som inte täcker noll d.v.s. signifikanta skillnader mellan behandlingarna. 14

100 % Överlevnadsindex 10 % 1 % 0,1 % 0,01 % 0 4 h 1 d 2 d 4 d 7 d Tid efter inokulering Figur 6. Överlevnaden av FOCY i block 1( ), block 2 ( ) och block 3 ( ). Försöksblocken skiljer sig i tidpunkt för induktion. Överlevnadsindex visar % av cfu ml -1 vid t = 0. Staplar anger standardavvikelse. Även om Anova-testet visade på skillnader mellan blocken vid alla mättillfällen fanns signifikanta skillnader (Tabell 11) bara i tre fall; block 1 skilde sig från block 2 och 3 efter 4 dygn (jämförelse j. & k.). Block 2 och 3 skilde sig vid mätningen efter 1 dygn (jämförelse l.). Vid övriga tider fanns inga signifikanta skillnader, dock flera gränsfall (Figur 6) Tabell 11. Konfidensintervall för jämförelser av överlevnad hos FOCY mellan olika block, vilka skiljer sig i försökstillfälle, på totalnivån α=0,05 där kompensering för fel av typ I skett med Bonferronis metod. Jämförelser mellan block; block 1 jämfört med block 2 (j), block 1 jämfört med block 3 (k) och block 2 jämfört med block 3 (l). Jämförelse 4 h 1 dygn 2 dygn 4 dygn 7 dygn j. -0,64 0,84-0,40 1,45-1,96 0,63-2,12-0,13 1. -1.96 0,05 2. k. -1,38 0,10-1,53 0,31-2,58 0,01-2,51-0,53-1,72 0,29 l. -1,48 0,00-2,06-0,21-1,92 0,68-1,38 0,60-0,77 1,24 1. Fet stil anger intervall som inte täcker noll d.v.s. signifikanta skillnader mellan behandlingarna. 2. Fet kursiv stil anger att intervall täcker noll men ligger på gränsen. 15

4 Diskussion Resultaten från mätningen av enzymaktivitet visade på en tydlig ökning av proteaser, kitinaser, glukanaser och cellulaser för lösning inducerad med 0,1 % avdödad FOCY (Figur 3). För övriga behandlingar var den induktiva effekten mindre tydlig. Enzymerna i lösningen kan ha två teoretiska källor. Den ena är att enzymerna härstammar från lyserade celler som fördes med från näringslösningen från tomatkulturen. Detta borde dock ha påverkat även den obehandlade lösningen. Den andra möjliga källan blir att enzymerna exsuderats från befintliga och/eller tillväxande mikroorganismer (Mitchell & Alexander, 1962). Eftersom inga analyser beträffande näringslösningens mikrobiologiska sammansättning gjordes efter enzyminduktionen kan ingen slutsats dras om vilka organismer som är orsak till den ökade enzymaktiviteten. Det är dock känt att bland annat Trichoderma harzianum, Pythium nunn, Pseudomonas cepacia och Enterobacter cloacae kan exsudera olika typer av lytiska enzymer (Sivan & Chet, 1989, Elad et al., 1985, Friedlender et al., 1985, Lorito el al., 1993). Enzymaktiviteten var lägre i lösning inducerad med levande mycel än i lösning inducerad med avdödad mycel. Den avdödade svampen var, till skillnad från den levande, sönderdelad i små partiklar. Detta medförde en mycket större yta gentemot den omgivande lösningen jämfört med den levande svampen. Detta i kombination med att den levande svampen konkurrerar med sin biologiska omgivning kan ses som en förklaring till skillnaderna i induktiv förmåga. Orsaken till nedgången av enzymaktivitet efter tre dygn är mer oklar. Polysackariderna kan som energikälla vara en begränsande faktor. Detta borde dock inte ha påverkat alla enzymgrupper samtidigt varvid detta ter sig mindre troligt. Det är även möjligt att mängden enzymproducerande organismer i lösningen minskade. Detta skulle i sin tur kunna bero på predation av antagonister eller att bildade ämnen i lösningen har toxisk eller inhiberande effekt på de enzymproducerande organismerna. Enzymer är proteiner vilka kan brytas ned av proteaser. En ökning av enzymnedbrytande proteaser skulle därmed kunna medföra en minskning av alla mätta enzymer, även proteaser, eftersom det inte är säkert att de enzymnedbrytande proteaserna ingår som en större del av mätresultatet för proteasaktiviteten eftersom de kanske inte bröt ned det färgade substratet (Hide Powder Azure). Proteasaktiviteten sjönk dessutom inte lika snabbt som för övriga enzymer. Aktiviteten kan även ha minskat för att enzymernas funktion har störts av olika enzyminhiberade substanser. Bland annat polyfenoliska syror är kända för att ha sådan effekt (Wetzel, 1991). Flera komplikationer kan ha tillstött under mätförfarandet, vilka kan ha påverkat analysens noggrannhet. Innan de färgade enzymsubstraten tillsattes centrifugerades proven. Detta kan ha medfört att enzymer bunda till större partiklar inte mättes utan försvann ur provet. Eftersom partikelstorleken skiljer sig hos tillsatsen med levande mycel jämfört med avdödat skulle detta kunna vara en av orsakerna till skillnaderna i enzymaktivitet. Detta skulle kunna förklara minskningen i enzymaktivitet efter 3 dygn om små partiklar, som tidigare inte centrifugerats bort, aggregerats till större partiklar under induceringen och då försvunnit ur provet. Det är också möjligt att enzymer bundits till partiklar efter en viss tid då förändringar i partiklarnas struktur och ytkemi skapat sådana förutsättningar. Vid vissa mätningar där mycket hög aktivitet förväntades blev resultatet för några mätparalleller i stället det omvända med låg eller obefintlig aktivitet. Detta kunde ses som en gulfärgning i stället för den normala blåfärgningen. Orsaken till detta är inte känd. 16

Glukos kunde inte konstateras vid något tillfälle i någon lösning. Det kan helt enkelt vara så att ingen glukos bildades som följd av spjälkning av polysackarider med glukoskomponenter. Detta är dock mindre troligt eftersom både enzymsubstrat och aktivt enzym fanns närvarande i lösningen. Eftersom vi inte vet om de enzymer som finns i lösningen i första hand spjälkar upp polysackarider i mindre strängar som di- och korta oligosackarider eller om polysackariderna spjälkas hela vägen till glukos kan inte teorin helt uteslutas. En mer trolig förklaring är att glukos fanns i lösningen men låg av olika anledningar under detektionsgränsen. Enligt Schoffelmeer et al. (1999) består cellväggen hos flera olika Fusarium oxysporum former till 20-30 % av glukos, främst i olika polymeriserade former. I näringslösning inducerad med 0,1 % FOCY blir därför det totala glukosinnehållet uppskattningsvis 200-300 mg liter -1. Det är rimligt att anta att glukos som bildats tas upp av mikroorganismer så mängden fri glukos i lösningen understiger detektionsgränsen på 1 mg liter -1. Kontrollmätning i näringslösning med känd glukoshalt konstaterade att använd mätmetod med teststickor och visade 50-80 % för låg glukoshalt. Detta medför en faktisk detektionsgräns på 2-5 mg liter -1. Slutsatsen blir att använd kvantifieringsmetod av fri glukos i lösningen inte var lämplig. FOCY uppvisade sämre överlevnad i steril näringslösning än i ej inducerad näringslösning efter ett dygn. Varför är inte känt men eftersom den sterila näringslösningen ej varit använd i odlingssystemet, skiljer den sig från ej inducerad näringslösning på mer än ett sätt. Förutom att den sterila näringslösningen inte innehöll några mikroorganismer var förmodligen innehåll av salter och organiska föreningar olika. Slutsatsen blir att ej använd steril näringslösning inte är en bra jämförelse gentemot använd näringslösning. I stället borde sterilfiltrerad använd näringslösning använts. FOCY hade signifikant sämre överlevnad i näringslösning inducerad med 0,01 % avdödad FOCY jämfört med ej inducerad (Figur 5). Effekten var snabb och kunde konstateras redan efter 4 h. Exsuderade enzymer från antagonister till FOCY kan ha spelat en roll genom att de spjälkat patogenens cellväggar (Santamaria et al., 1995). Eftersom ingen aktivitet av kitinas, glukanas och cellulas kunde konstateras efter tre dygns inducering med avdödad FOCY kan dock ingen direkt koppling mellan hög enzymaktivet och låg överlevnad av FOCY göras med dessa resultat som grund. Det hade varit intressant att undersöka enzymaktiviteten i lösningarna även efter det att inokuleringen av levande FOCY gjordes. Att någonting av det som tillsattes i lösningarna, eller bildats som en följd hydrolytiska processer, t.ex. polysackarider, fått patogenen att dö, förhindra sporgroning eller försättas i fungistasis (Bell et al., 1998) är också en möjlighet. Spjälkande enzymer i kombination med toxiska/inhiberande substanser kan dessutom ha skapat synergieffekter som varit orsak till minskningen av FOCY (Lorito et al., 1994). Den negativa effekten på FOCY kan också berott på direkt predation av mikroorganismer t.ex. infusorier vars tillväxt inducerats av närvaron av avdödade svampkroppar. Lösning inducerad med större mängd avdödad FOCY uppvisade inga skillnader gentemot näringslösning utan tillsats. Varför är inte känt men liknande resultat med mindre effekt vid större tillsats har bl.a. förekommit när kitin tillsatts till jord (Mitchell, 1963). Om den negativa effekten på FOCY berodde på inhiberande eller toxiska substanser t.ex. polysackarider som härstammade från det tillsatta myceliet borde inte resultatet ha varit detta. En möjlig teori till fenomenet är att antagonister till patogenen 17

hämmats i den högre koncentrationen till följd av populationsfluktuationer. En datasimulering skulle kunna utröna huruvida detta är en möjlighet. Om induceringen går att upprepa in situ är osäkert men detta skulle i så fall kunna ha stor betydelse för profylaktisk behandling av slutna odlingssystem för att förhindra utbrott av svampsjukdomar och därigenom minska fungicidanvändning och kostsam sterilisering av näringslösning. En möjlig appliceringsteknik är tillsats av avdödad FOCY i substratet i långsamfilter vid hydroponisk odling. I den statistiska modellen som användes vid variansanalysen fanns ett element av blockeffekt. Detta för att kompensera för de eventuella skillnader mellan upprepningarna som berodde att systemen som testades befann sig i olika kulturstadier. Eftersom det fanns blockskillnader kan slutsatsen dras att den mikrobiologiska sammansättningen och därmed dynamiken i de olika näringslösningarna inte bara varierat över tiden utan också varierat på likartat sätt i de olika testade odlingssystemen. Stort biologiskt utbyte mellan odlingssystemen kan ha varit orsaken men denna skulle i så fall skett via luft eller human vektor. Mer troligt är att de mikrobiologiska populationsfluktuationerna i odlingssystemen bestämdes av att yttre faktorerna såsom odlingens ålder, temperatur, ljus, växtexsudat och att invandrande mikroorganismer var de samma för de olika systemen. För att ytterligare visa på en blockeffekt bör fler system testas samtidigt än vad som gjordes här, d.v.s fler upprepningar inom varje block. I jämförelserna är intervallen på gränsen till att inte täcka 0 och det är möjligt att signifikans finns om någon annan metod än Bonferroni använts för att kompensera för fel av typ I. LSD ligger ungefär runt 1 vid alla tider. Eftersom värdena är logaritmerade kan detta översättas till att en skillnad i väntevärden räknat i cfu mellan två behandlingar skiljer sig om den ena behandlingens medelvärde är mer än tio gånger större (eller mindre) än den andra vilket kan användas vid snabb tolkning av data i liknande framtida tester. Tack till Jag vill rikta ett stort tack till min handledare Thomas Brand som haft stort tålamod med mig och mitt examensarbete. Jag vill också tacka min biträdande handledare Beatrix Alsanius för att hon, på gott och ont, gett mig en inblick i forskarvärlden. Tackas skall även Jan-Eric Englund för att han hjälpt mig med statistiska spörsmål. Tobias Urban Teodor Lindblom, Alnarp 2003-02-28. 18

5 Källförteckning Bartnicki-Garcia, S., 1968. Cell wall chemistry, morphogenesis, and taxonomy of fungi. Annual Reviews of Microbiology 22, 87-108. Bell A. A., Hubbard J. C., Liu L., Davis R. M., Subbarao K. V., 1998. Effects of chitin and chitosan on the incidence and severity of Fusarium yellows in celery. Plant Disease 82, 322-328. Elad E., Lifshitz R., Baker R., 1985. Enzymatic activity of the mycoparasite Pythium nunn during interaction with host and non-host fungi. Physiological Plant Pathology 27, 131-148. Fridlender M., Inbar J., Chet I., 1993. Biological control of soilborne plant pathogens by a β-1,3 glucanase-producing Pseudomonas cepacia. Soil Biology & Biochemistry 25(9), 1211-1221. Komada H., 1975. Development of a selective medium for quantitative isolation of Fusarium oxysporum from natural soil. Review of Plant Protection Research 8, 114-124. Lorito M., Di Pietro A., Hayes C. K., Woo S. L., Harman G. E. 1993. Antifungal, synergistic interaction between chitinolytic enzymes from Trichoderma harzianum and Enterobacter cloacae. Phytopathology 83, 721-728. Lorito M., Peterbauer C., Hayes C. K., Harman G. E., 1994. Synergistic interaction between fungal cell wall degrading enzymes and different antifungal compounds enhances inhibation of spore germination. Microbiology 140, 623-629. Matlab, 1999. Matlab version 5.3.1.29215a. The MathWorks inc., Natick (MA), USA. Mitchell R., 1963. Addition of fungal cell-wall components to soil for biological disease control. Phytopathology 53, 1068-1071. Mitchell R., Alexander M., 1961. Chitin and the biological control of Fusarium diseases. Plant Disease Reporter 45(7), 487-490. Mitchell R., Alexander M., 1962. Lysis of soil fungi by bacteria. Canadian Journal of Microbiology 9, 169-176. Petterson M-L., 2001. Skadegörare i växthuskulturer. Faktablad om växtskydd trädgård, red. Pettersson M-L., SLU Publikationstjänst, Ulltuna, Sverige ISSN 0281-8566. Postma J., 1996. Mechanisms of Disease suppression in soilless cultures. IOBC/WPRS Bulletin. 19(6), 85-94. 19

Santamaria F., Neuro O. M., Alfonso C., Prieto A., Leal J. A., Reyes F., 1995. Cell wall degradation of Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici race 2 by lytic enzymes from different Fusarium species for its biocontrol. Letters in Applied Microbiology 20, 385-390. Schneider R. W. (ed.), 1982. Suppressive Soils and Plant Disease. The American Phytopatological Society, St. Paul, USA. Schoffelmeer, E. A. M., Klis F. M., Sietsma J. H., Cornelissen B. J. C., 1999. The cell wall of Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology 27, 275-282. Sivan A., Chet I., 1989. Degradation of fungal cell walls by lytic enzymes of Trichoderma harzianum. Journal of General Microbiology 135, 675-682. Sneh, B., Pozniak, D., Salomon D., 1987. Soil suppressiveness to Fusarium wilt of melon, induced by repeated croppings of resistant varietiesof melons. Journal of Phytopathology 120, 347-354 Sonneveld C., Straver N., 1989. Voedingsoplossingen voor groenten en bloemen geteelt in water of substraten - Nutrient solutions for vegetables and flowers grown in water or substrates. Voedingsoplossningen glastuinbouw 8, 8th edition, Proefstationen voor Tuinbouw onder Glas, Naaldwijk, Nedeländerna. Welch B. L., 1947. The generalization of `student's' problem when several different populations are involved. Biometrika 34, 28-35. Wetzel, Robert G., 1991. Microbial enzymes in aquatic enviroments. Springer, New York, USA. 20

Innehåll: Indexfil (index.html) Examensarbete i portable document format (.pdf). Examensarbete i postscript format (.ps). Examensarbete i M$ word 2002 format (.doc). Figurer (grafer) i enhanced metafile format (.emf). Figurer (fotografier) i olika format (.jpeg,.bmp) Matlabfiler innehållande rådata och beräkningar (.m). Foto på författaren (.jpg). 21