Slutrapport angående projektet Effekt av cirkulerande näringslösning med reningsutrustning på näringsfällning och hormoninnehåll i bioreaktorbaserad in vitro produktion av växtråvara med (projekt nr 715/13/FoG) Projekt ansvarig: Sammar Khalil Institution för Biosystem och Teknologi, SLU, Box 103, 230 53 Alnarp, E-mail: sammar.khalil@slu.se Partner: Anna Holefors In vitro Plant-tech AB holefors@invitroplanttech.se 1
Projektets syfte och mål Att utveckla ytterligare förbättra hållbarhet i storskalig bioreaktorbaserad in vitro produktion av växtcellråvara genom användning av cirkulerande odlingssystem med rening. Advanced Oxidation Technologies (AOT) användes som reningsteknik Frågeställningar i projektet 1- Kan cirkulerande odlingssystem med rening användas för bioreaktorbaserad in vitro produktion av växtcellråvara? 2- Vilken effekt har dessa system på näringsfällning och hormoninnehåll? 3- Hur många gånger ska näringslösning cirkuleras för att rena kulturerna? Slutsatser De uppnådda resultaten visar på att - AOT system hade en negative effekt på tillväxt av cellkulturer - Tillväxt av mikroorganismer förekom, vilket påverkade cirkulering processen - Det behövs undersökning av andra näringsåtgärder - Ingen ackumulering av näringsämne visades vid analys av näringslösning innan och efter AOT behandling vilket indikerar en positive effekt på näringsfällning Resultatförmedling och publikationer Resultaten från projektet kommer att presenteras i 1- Nationella publikationer på näringsfällning och hormoninnehåll i bioreaktorbaserad in vitro produktion av växtråvara. Kommer att skickas in till Viola, en affärstidning för trädgårdsföretagare Bakgrund Marknaden för örter/medicinalväxter är en stor marknad, uppskattad till 544 miljarder SEK. För vissa medicinalväxter är efterfrågan betydligt större än tillgången vilket lett till utarmning av de naturliga bestånden. Då efterfrågan av dessa växter förväntas fortsätta att öka kommer problematiken med växtråvarubrist och fortsatt utarmning att vara bestående. In vitro Planttech har utvecklat en växtcellodlingsplattform som kommer att användas för storskalig kommersiell produktion av växtråvara från svåråtkomliga medicinalväxter. Genom följande ansökan ville vi undersöka om det går att införa recirkulering av näringslösning i vår växtcellodlingsplattform, liknande den som används i hydroponiska odlingssystem. Recirkulering av näringslösning med rening skulle medföra ytterligare förstärkning av hållbarhetsaspekten genom minskat vatten och näringsförbrukning. Hydroponisk odling erbjuder optimerade odlingsbetingelser för växten med hänsyn till tillförsel av vatten och växtnäring vilket leder till en positiv effekt på båda avkastning och produktkvalitet. Dessa system kan vara näringslösningsbaserade odlingssystem såsom Nutrient Film teknik (NFT) och ebb and flow system eller substratsbaserade odlingssystem där bla torv, pimpsten och stenull används som inert substrat. Vatten- och näringscykeln i dessa system kan vara öppna eller slutna system (med cirkulerande näringslösning). Den sistnämnda varianten förespråkas för att minska utsläpp av näringsberikat vatten från växthus och övergödning. Slutna system förutsätter behovsanpassad tillförsel av växtnäring för optimering av kulturens tillväxt och utveckling, samt skördeplanering och produktkvalitet. Vid in vitro odling odlas växterna på definierat näringsmedium innehållande näringssalter, vitaminer, socker och hormoner. Under odlingsperioden förbrukas vissa näringsämnen, socker 2
och hormoner. Växterna kan också utsöndra ämnen som påverkar fortsatt tillväxt negativt. Ibland bildas det också fällningar i näringslösningen. Vid utveckling av recirkulerande näringssystem med rening är det därför viktigt att avlägsna inhiberande substanser, eventuellt bildande fällningar samt ersätta förbrukade näringsämnen och socker. Behandling med ozon och aktivt kol har visat sig vara de mest aktiva metoderna för rening av vatten från bla hormoner. Dessa metoder är relativt dyra och energikrävande. I det förslagna projektet kommer vi att testa effektiviteten av Advanced Oxidation Technologies (AOT) på nedbrytning av hormoner. Teknologin används idag inom ett flertal kommersiella tillämpningar som ballastvattenhantering inom global sjöfart, badvattenrening i badhus och spa, samt tappvattenrening i större fastigheter som hotell, äldreboenden och kontor. Den tillämpas också i kommersiella odlingssystem med grönsaker som reningsåtgärd mot växtpatogener. AOT baseras på mycket snabba fysikaliska-kemiska processer där ljus av energier i den ultravioletta delen av spektrumet omvandlas till kemisk energi. Detta sker över halvledande fotokatalytiska material av nanokristaller som belagts på renarens väggar. Med titandioxid som katalysator bildas fria radikaler i vätskemediet som oxiderar både biologiskt och annat organiskt material. Genomförande Försöksodlingen utfördes under perioden april 2013- januari 2014 i In vitro Plant-techs laboratorium i Malmö. Cellkulturer (kallus) av rosenrot används. Cellkulturerna odlades i flytande småskaliga 10 liters bioreaktorsystem av typen SUB (single use bioreactor) med luftning och omrörning enligt SOP RCO10. Två system ingick i undersökningarna: 1- System 1: Kontroll; cirkulerande hydroponiskt system utan reningsåtgärder 2- System 2: cirkulerande hydroponiskt system med filter och AOT system som reningsåtgärder (Figur 1) 1. Analyser av näringslösning 2. Justering av näring och ph 3. Sterilisering och återföring i odlingssystemet Näringsbatch A Näringsbatch B AOT system Växtbädd Filter för näring Figur 1. Schematisk bild av ett cirkulerande system i bioreaktorbaserad in vitro produktion av växtråvara med båda filter och AOT system 3
Näringssammansättning: Odlingsmedium RC01 bestående av näringssalter, vitaminer och hormoner som ger god tillväxt av rosenrotscellmassan. Tre replikat av varje system användes i försöket. I båda system justeras näringslösningen med avseende på näringssalter, socker, hormoner och ph innan den återupptogs av plantorna. För att ha rätt näringsjustering, analyserades näringslösningen från varje system innan återförsel till växtbädden. Tre subkulturer används. Odlingsperioden för dessa kulturer var tre månader. Försöken upprepas över tid. AOT system Cellkultur Bioreaktor system Figur 2. Odlingssystemet som användes i försöken Analyser Följande analyser utfördes: Tillväxtanalyser Tillväxten av växtcellmassan registrerades genom färsk- och torrviktsanalyser, samt densitetsmätning av växtcellmassa. Densitetsmätning utfördes en gång per vecka, färskviktsanalyser utfördes vid försökets start, vid byte av näringslösning, samt vid avslutad tillväxtperiod. Torrviktsanalyser utfördes efter avslutad tillväxtperiod. Näringsanalyser Näringsanalyser utfördes vid byte av näringslösning innan och efter rening. Analyserna utfördes av LMI i Helsingborg. Provtagning utfördes varannan vecka under försöksperioden. Mikrobiella analyser 4
ML CELLER Under försökets lopp tillväxt av svamp respektive bakterier indikerades i systemet efter recirkulering. Analyser på maltextrakt agar (MA) för svamp tillväxt och på Tryptic Soya Agar (TSA) för bakterie tillväxt utfördes. Analyserna var fokuserade på studera förekomsten och inte halten. Resultat och diskussion Tillväxtanalyser Cellerna visade bra tillväxt i våra 10 liters bioreaktorsystem. Vi jämförde också hur AOTbehandlingen (rening genom UV-behandling) påverkade celltillväxten. Rening av näringslösning genom UV-behandling gav sämre tillväxt av cellkulturerna jämfört med näringslösning som ej renats med UV-ljus (Figur 3). 170 Effekt av UV-behandking 150 152 148 130 110 90 70 50 50 0 80 60 0 8 utan UV 50 148 utan UV 50 152 med UV 50 60 med UV 50 80 Figur 3. Effekt av UV-behandling på tillväxt av celler. VECKA Näringsanalyser Näringslösningsanalyser visade inga signifikanta skillnader när det gäller halten av makrorespektive mikronäringsämnen under försökets lopp. Undantag för detta är halten av järn och ammoniumkväve som ökade i slutet av försöket och halten av kisel som minskades (Tabell 1). Detta innebär att AOT systemet och cirkulering har en positiv effekt på ackumulering av näringsämnen. 5
Tabell 1: Halten av mikro-respektive mikronäringsämne vid försök strat respektive slut förre och efter rening av cirkulerande näringslösning med Advanced Oxidation Technologies (AOT). Start SLUT Förre AOT Efter AOT Förre AOT Efter AOT ph 5,9 4 5,3 4,6 Ledningstal 5,27 5,67 5,8 5,83 (ms/cm Halt näringsämne i mg/l Nitratkväve 564 a 556 a 490 a 536 a Fosfor 27,4 a 28,7 a 37,3 a 40,8 a Kalium 692 a 681 a 717 a 716 a Magnesium 23,6 a 21,7 a 22,6 a 23,3 a Svavel 30,5 a 27,6 a 31,2 a 31,9 a Kalcium 128 a 125 a 109 a 115 a Natrium 8,24 a 8,20 a 7,22 a 7,43 a Klorid 211 a 208 a 237 a 237 a Mangan 5,2 a 5,5 a 5,1 a 5,55 a Bor 1,02 a 1,03 a 0,94 a 0,94 a Koppar 0,013 a 0,056 a 0,005 a 0,041 a Järn 0,611 a 0,606 a 4,04 b 4,43 b Zink 1,88 a 1,92 a 1,68 a 2,08 a Molybden 0,047 a 0,047 a 0,081 a 0,076 a Aluminium 0,016 a 0,005 a 0,009 a 0,015 a Kisel 0,492 a 0,491 a 0,11 b 0,113 b Ammoniumkväve 196 a 193 a 274 b 287 b Framtiden Resultaten från detta projekt visar att AOT var effektive på att hämma fällning av de flesta näringsämnen men förekomsten av mikroorganismer är ett problem som behövs undersökning i framtid. Andra reningsutrustning ska testas för att uppnå en effektivare rening. 6