Ekologiska risker vid bekämpning av stickmygglarver med BTI i översvämningsområden

Uppdaterad 060628 Ekologiska risker vid bekämpning av stickmygglarver med BTI i översvämningsområden Jan O. Lundström Avdelningen för Populationsbiologi och Naturvårdsbiologi Evolutionsbiologiskt Centrum Uppsala universitet Mail. Jan.Lundstrom@ebc.uu.se Telefon: 070-4250214

Sammanfattning Bakterien Bacillus thuringiensis israelensis (BTI) har en världsomfattande förekomst som även inkluderar våtmarker vid nedre delen av Dalälven. Vid användning som biologiskt bekämpningsmedel mot stickmygglarver är den aktiva beståndsdelen de specifika kristallina pretoxiner som produceras i denna bakterie. Det biologiska bekämpningsmedlet VectoBac G består av torkade malda bakterier (BTI) som klibbats fast på bitar av majskorn med hjälp av majsolja. Kornstorlek, form och densitet är avpassade för att VectoBac G skall kunna tränga igenom vegetation och nå de pölar som innehåller stickmygglarver. Halveringstiden är 3,8 timmar vid exponering för solljus och upp till 4 månader i sediment skyddat från solljus. Vid användning för bekämpning av stickmygglarver har BTI bara effekt upp till 48 timmar. Den korta varaktigheten i miljön gör att bekämpning måste utföras efter varje mer omfattande kläckning av översvämningsmyggornas larver. Pretoxinerna kan ackumuleras i jord och sediment men den relativt korta halveringstiden hindrar ackumulering mellan år. Ackumulering i organismer förekommer inte. Den toxiska effekten av BTI är begränsad till insekter av underordningen Nematocera (Myggor). Larver av familjerna Culicidae (stickmyggor) och Simuliidae (knott) är mycket känsliga för BTI, men Simuliidae berörs inte av planerad bekämpning. Vid minst tiofaldig överdosering av BTI i våtmarker finns möjligen viss risk för mortalitet hos underfamiljen Chironominae inom familjen Chironomidae. Vid mycket omfattande överdosering kan BTI vara toxiskt även för Dixidae, Tipulidae, Psychodidae, Sciaridae och Ceratopogonidae som förekommer i våtmarker. Övriga insekter, samt maskar, mollusker, kräftdjur, groddjur, fiskar, fåglar och däggdjur är inte känsliga för BTI. WHO har godkänt användning av BTI för bekämpning av stickmygglarver i behållare med dricksvatten. Den reducerade mängden stickmygglarver och vuxna stickmyggor efter bekämpning bedöms inte ge några betydande effekter på våtmarkernas fauna, varken för akvatiska predatorer eller för terrestra predatorer. Detta förklaras av larvernas mycket snabba utveckling i temporära vatten där predatorer har svårt att hinna utnyttja födoresursen och de vuxna stickmyggornas beteende i den terrestra miljön som gör dem svårfångade i relation till sitt näringsinnehåll. Endast en begränsad grupp av dykarskalbaggar har möjligen ett något ökat beroende av stickmygglarver, men dessa arter är mer inriktade på skogsmyggor (vars larver varje vår förekommer i smältvattenpölar) än på översvämningsmyggor (vars larver utvecklas under de oförutsägbara sommaröversvämningarna). Enbart översvämningsmyggornas larver är föremål för bekämpningsåtgärder vilket kraftigt minskar risken för indirekta negativa effekter på dykarskalbaggar. Hög geografisk precision vid spridning samt väl avvägd dos används för att minimera risken för oönskade miljöeffekter. Uppföljningsprogram för insekter pågår och har avrapporterats. Dessa program fokuseras nu på de mest relevanta frågeställningarna och avrapporteras årligen enligt de krav som ställs av kemikalieinspektionen. 2

Innehållsförteckning 1. Bedömning av stickmyggbekämpningens miljökonsekvenser... 4 1.1 Direkta toxiska effekter av BTI på icke-mål organismer... 4 1.2 Ackumulering av BTI i organismer och i miljön... 5 1.3 Effekter av komponenter i bekämpningsmedlet... 6 1.4 Indirekta effekter av minskad mängd stickmyggor... 7 1.5 Uppgifter som krävs för att påvisa negativa miljöeffekter... 8 2. Uppföljning av miljöeffekter... 8 2.1 Förebyggande åtgärder... 8 2.2 Rapportering av uppföljningsprogram insekter... 9 2.3. Rapportering av biotest för påvisning av BTI i sediment... 11 3. Fortsatt uppföljning av miljöeffekter... 12 3.1. Fördjupade frågor om påverkan på våtmarkernas insekter... 12 3.2 Direkta negativa effekter på Chironomidae... 12 3.3 Indirekta negativa effekter av minskad mängd stickmygglarver... 12 4. Refererad litteratur.... 13 3

1. Bedömning av stickmyggbekämpningens miljökonsekvenser 1.1 Direkta toxiska effekter av BTI på icke-mål organismer Forskning kring potentiella biologiska bekämpningsmedel mot stickmygglarver i Israel under 1976 resulterade i det första fyndet av Bacillus thuringiensis israelensis (BTI) i en vattenpöl med döda mygglarver (Goldberg & Margalit 1977, Barjac 1978, Margalit 1990). Experiment med den nya bakterievarianten visade att den var mycket toxisk för stickmygglarver. Detta fynd startade en intensiv period av forsknings- och utvecklingsarbete för att undersöka om och hur BTI påverkade olika typer av organismer, för att klarlägga verkningsmekanismer, samt för att utveckla odlings och applikationstekniker. Den aktiva beståndsdelen är ett pretoxin producerat av bakterien BTI och det förekommer i form av svårlösliga proteinkristaller (Boisvert & Boisvert 2000). Den specifika verkningsmekanismen kräver att proteinkristallerna sväljs, att magtarmkanalen har en kraftigt basisk miljö med minst ph 9, att specifika proteinaser förekommer i magtarm-kanalen, samt att magtarmkanalens celler har receptorer som binder till de toxiska substanser som frigjorts och aktiverats. Flera toxiner, med något varierande verkningsmekanismer, aktiveras och angriper magtarmkanalens celler så att cellmembranet förstörs och cellen faller sönder. Hålen som bildas i larvens magtarmkanal gör att tarminnehållet kommer ut i kroppshålan och larven avlider. BTI är akut toxiskt endast för en begränsad grupp av insekter inom ordningen Diptera underordningen Nematocera (Boisvert & Boisvert 2000). Den toxiska effekten slår mot larver av ett fåtal familjer inom underordningen Nematocera. Känsligast är larver av familjen Culicidae (stickmyggor) som förekommer i stillastående temporära vatten och larver av familjen Simuliidae (knott) som endast förekommer i rinnande vatten. Bekämpning av stickmygglarver utförs endast i grunda vegetationsrika översvämningsvåtmarker vilket medför att medlet inte kan transporteras till rinnande vatten och påverka knottlarver. Vid kraftigt ökad dos är BTI även toxiskt för akvatiska larver av Chironomidae (fjädermyggor) inom underfamiljen Chironominae (Boisvert & Boisvert 2000). Vid hög dosering kan BTI användas för kontroll av Chironomus spp och andra Chironominae (Ali et al. 1981, Sinegre et al. 1990, Pont et al. 1999). Vid kraftigt ökad dos kan BTI även vara toxiskt för ytterligare fem myggfamiljer Dixidae (u-myggor), Tipulidae (harkrankar), Psychodidae (fjärilmyggor), Sciaridae (sorgmyggor) och Ceratopogonidae (svidknott) som förekommer i våtmarker (WHO 1981, Back et al. 1985, Houston et al. 1989, Smits & Vlug 1990, Keil 1991, Becker & Margalit 1993). VectoBac G, som innehåller BTI, skall enbart spridas över noga kartlagda temporära våtmarker för specifik bekämpning av översvämningsstickmyggor vilket innebär att ytterst lite av medlet kan komma ut i djupare och mer permanenta vatten. Även om enstaka korn av VectoBac G råkar spridas i djupare vattenområden så kan inte en extremt låg dos av BTI orsaka någon mortalitet hos fjädermygglarver i dessa områden. Dock kan BTI användas för kontroll av fjädermygglarver men då krävs 13-75 ggr högre dos än för stickmygglarver (Ali et al. 1981). Det betyder att om 15 kg VectoBac G/ha ger tillfredsställande kontroll av stickmygglarver så behövs 195 1 125 kg VectoBac G/ha för motsvarande reduktion av antalet fjädermygglarver. Därför finns inte något behov av skyddszon mot djupare och mer permanenta vattenområden i anslutning till de översvämningsvåtmarker där VectoBac G skall spridas. BTI är inte toxiskt för övriga evertebrater och vertebrater. Intag av BTI är inte skadligt för övriga familjer av ordningen Diptera (tvåvingar), ej heller för insekter av ordningarna Collembola (hoppstjärtar), Coleoptera (skalbaggar), Odonata (trollsländor), Trichoptera (nattsländor), Heteroptera (skinnbaggar) samt Ephemeroptera (dagsländor) (Boisvert & 4

Boisvert 2000). Toxiska effekter har inte observerats hos mollusker (sniglar, snäckor och musslor), maskar, kräftdjur eller andra evertebrater. Inga direkta toxiska effekter har observerats hos fåglar, däggdjur, groddjur eller fiskar. Det kan noteras att WHO har godkänt att BTI får användas som tillsats i dricksvatten för människor (WHO 1999). Denna användning är främst aktuell i områden där stickmyggor av släktet Anopheles (som sprider malaria) använder dricksvattenbehållare för sina larver larverna kan bekämpas med BTI och dricksvattnet kan fortfarande användas av befolkningen. Det har förts fram att bakterier av släktet Bacillus kan vara farliga för däggdjur, dels för att arten Bacillus anthracius är en högvirulent patogen, dels för att andra arter inklusive Bacillus cereus har isolerats från sår (se (Warren et al. 1984)). Dessa misstankar har motiverat omfattande tester av patogenicitet hos olika stammar av Bacillus thuringiensis (inklusive BTI) för däggdjur. Varken råttor eller volontärer som åt 2x10 12 respektive 3x10 9 bakteriesporer per kg kroppsvikt under fem dygn visade några sjukdomstecken (se (Drobniewski 1993)). Under maximum challenge experiment exponerades möss, råttor och kaniner för sex olika isolat av BTI via ett flertal rutter (oralt, intraperitonealt, subkutant, intra-cerebralt, okulart och via aerosol) (Siegel & Shadduck 1990). Intraperitoneal injicering var den enda administrationen av BTI som orsakade signifikant dödlighet, men enbart vid hög koncentration och det konstaterades att BTI inte var betydelsefullt som patogen för däggdjur. Dessa forskare drar slutsatsen att BTI kan tryggt användas i miljöer där såväl människor som andra däggdjur exponeras (Siegel & Shadduck 1990). Denna slutsats stöds av forskningsresultat från oberoende grupper i andra länder (Ignatiev et al. 1988, Halkova et al. 1993 samt referenser i Glare & O'Callaghan 1998). Slutsats: BTI är varken toxiskt för vertebrater eller för det stora flertalet evertebrater. Den toxiska effekten av BTI är specifikt riktad mot larver av några familjer av underordningen Nematocera. Då den toxiska effekten hos dessa familjer beror av dosering och stickmygglarver uppvisar den högsta känsligheten är det möjligt med en väl avvägd dosering att begränsa effekten till enbart stickmygglarver. Först vid en överdosering i storleksordningen 10-falt eller betydligt mer förväntas risk för negativa effekter på andra familjer inom Nematocera. 1.2 Ackumulering av BTI i organismer och i miljön BTI ackumuleras inte i organismer, men kan ackumuleras i mark eller sediment under flera månader då halveringstiden är fyra månader under lämpliga förhållanden (http://extoxnet.orst.edu/pips/bacillus.htm). Vid användning i akvatisk miljö är den toxiska effekten av BTI mot stickmygglarver mycket kortvarig och inte längre än maximalt 48 timmar. Vid exponering för solljus, exempelvis på mark eller vegetation, är halveringstiden endast 3,8 timmar (http://extoxnet.orst.edu/pips/bacillus.htm). Den relativt korta halveringstiden i jord och sediment och den mycket korta halveringstiden vid exponering för solljus beror på att BTI pretoxiner och sporer biodegraderas relativt snabbt och att mycket högt näringsinnehåll krävs för att sporerna skall gro. Enstaka sporer kan dock gro i sediment men då stannar bakterien i vegetativ fas och bildar varken sporer eller kristaller (Eskils 2001). Vid tidigt samråd (2004-01-21) med länsstyrelserna i Dalarna (Maria Elofsson, Stefan Tansby), Gävleborg (Calle Gullberg, Ingemar Lindqvist, Thomas Trotski) samt Västmanland (Henrik Roos) diskuterades om BTI som sprids i vatten kan följa med vattenströmmar och ackumuleras på sedimentationsbottnar. Teoretiskt är detta möjligt, men dock i mycket begränsad omfattning. Spridning av BTI för kontroll av stickmygglarver sker endast över relativt grunda och vegetationsrika våtmarker. Den aktiva beståndsdelen (svårlösliga 5

proteinkristaller med hög densitet) släpper från den flytande bäraren (torra fragment av majskärnor) inom några timmar och alla majsfragment sjunker till botten inom 24 timmar. Det krävs därför kraftig genomströmning för att på kort tid skölja ut några större mängder från vegetationen till djupare vatten. Materialet behöver nå djupare vatten med högre genomströmningshastighet för att kunna transporteras till nedströms liggande sedimentationsbottnar. Risken är därför mycket liten för oavsiktlig vattenburen transport av detta medel i någon större omfattning. För att påverka sedimentationsbottnarnas fauna av Chironomidlarver krävs en anrikning av VectoBac G i storleksordningen 100-tals kg/ha inom relativt korta tidsperioder. Risken för påverkan på sedimentationsbottnarnas fauna bedöms därför som mycket låg, närmast obefintlig. Bakterien BTI har en världsomspännande utbredning och förekommer naturligt i översvämningsvåtmarker vid Dalälven. Experimentell tillsats av levande bakterier av en märkt BTI-stam i Nordmyra nära Tärnsjö visade att naturligt förekommande stammar konkurrerade ut den introducerade stammen (Eskils & Lövgren 1997). Temporärt utgjorde den märkta stammen upp till 5 % av den totala BTI-mängden i jordproverna, men den konkurrerades snart ut av naturligt förekommande BTI. Studien i Nordmyran visade att andelen av den introducerade BTI-stammen reducerades till under bakgrundsnivån av befintliga BTI-stammar inom sju veckor efter introduktion. Spridning av en vital stam av BTI medför därför inte någon dramatisk förändring av det mikrobiologiska samhället i våtmarkerna utan leder endast till en kortvarig ökning av en bakterie som förekommer naturligt i detta område. VectoBac G består av torkade pulvriserade bakterier och bland fragmenten finns de kristallina pretoxiner som är de aktiva beståndsdelarna i detta biologiska bekämpningsmedel. Vid myggbekämpning sprids därför inte vitala bakterier utan torkade bakteriefragment vilket innebär att det inte påverkar det mikrobiologiska samhället i våtmarkerna. Slutsats: BTI har en världsomspännande utbredning och förekommer naturligt även i svenska våtmarker. Ackumulering kan inte ske i organismer men det är möjligt med relativt kortvarig ackumulering av pretoxiner i mark och sediment. Det finns ingen risk för transport till och ackumulering i sedimentationsbottnar av de mängder som krävs för påverkan på chironomidlarver. 1.3 Effekter av komponenter i bekämpningsmedlet VectoBac G består av torkat pulvriserat BTI, torkade majsfragment och majsolja. Den totala mängden majsfragment (huvudbeståndsdelen i VectoBac G) som sprids över våtmarkerna under en sommar kan röra sig om 30 kg/ha i de delar av våtmarkerna som får två översvämningar. Denna mängd kan jämföras med normalt årligt nedfall av förna i skogsmark på 2 000 kg/ha. Periodvis översvämmade våtmarker får även tillskott av näringsämnen som pålagras vid översvämning och denna naturliga gödning utgjorde grunden för den tidigare för bönderna så viktiga älvängsslåttern. Näringsläckage från mänskliga aktiviteter (jordbruk, djurhållning, enskilda och kommunala avloppsanläggningar) är ofta högre i sjöar och våtmarker nära samhällen än i mer perifera områden. Spridning av VectoBac G utförs i översvämningsvåtmarker nära samhällen och det eventuella näringstillskottet i form av 30 kg majsfragment per ha bedöms därför inte innebära någon betydelsefull eller ens urskiljbart ökad näringsbelastning. Den torkade och fragmenterade majs som ingår i VectoBac G har en kornstorlek på 2 3 mm och har en dovt gulbrun färg. Kornstorlek, form och densitet har valts för att ge maximal förmåga att passera den ofta massiva vegetation (grenar och bladverk i träd och buskar, örter 6

och gräs) som finns ovanför de myggproducerande vattensamlingarna. Direkt efter spridning av ett korn/dm 2 är det därför sällan man hittar några korn utom de som flyter på vattenytor. Korn av VectoBac G som ligger på vatten sjunker inom några timmar och efter 24 timmar har alla korn sjunkit. Spridning av VectoBac G sker endast i samband med översvämningar som riskerar producera stora mängder översvämningsmyggor vilket innebär att förekomsten av denna potentiella födoresurs för gnagare, fåglar, fiskar och insekter är oförutsägbar och därför inte nämnvärt kan påverka populationer av dessa djur. Den jämna fördelningen av materialet efter spridning och kornens förmåga att tränga ner till markplanet gör att det krävs en rätt stor arbetsinsats för dessa djur att hitta några större mängder. Risken för att VectoBac G skulle fungera som betydelsefull extra föda och därmed påverka populationer av gnagare, fåglar, fiskar eller insekter bedöms som minimal. Slutsats: Spridning av VectoBac G i översvämningsvåtmarker medför ingen betydande näringsämnesbelastning i relation till övrig naturlig och antropogen tillförsel. De fragment av majskorn som tillförs har ingen betydande inverkan på djurpopulationer. 1.4 Indirekta effekter av minskad mängd stickmyggor Det har visat sig svårt att hitta predatorer som är direkt beroende av stickmygglarver som födoresurs. Detta beror på att stickmyggornas larver lever i temporära vattensamlingar där predatorerna anländer efter larverna kläckts, samt att de snabbt utvecklas till vuxna stickmyggor. Denna framgångsrika livsstrategi medför att flertalet predatorer inte hinner nyttja denna potentiellt stora födoresurs. Dock tar dykarbaggar, ryggsimmare, trollsländelarver samt tofsmygglarver en del stickmygglarver, och skräddare kan ta stickmyggornas puppor när de ligger stilla i vattenytan för att kläckas (Onyeka 1983, Deding 1988, Blaustein 1998). Dessa rovlevande insekter tar dock även många andra typer av byten och är inte direkt beroende av stickmyggornas larver. Främst dykarbaggar och ryggsimmare har potential att ta ett relativt stort antal stickmygglarver (Lee 1967, Iversen 1971, Toth & Chew 1972, Service 1977, Chesson 1984). I ett vidare perspektiv kan man fundera på hur pass beroende dykarna är av översvämningsmyggens larver. Mygglarver finns bara i större mängder en kort tid i samband med översvämningar. Därför måste dykarna kunna anpassa sin livscykel till när de oregelbundna översvämningarna inträffar. Då är det säkrare och mer tillförlitligt att anpassa sig efter skogsmyggen, som dykarna i artiklarna av Nilsson (1986) och Nilsson & Svensson (1994), vars larver hittas i början av våren i små skogspölar efter snösmältningen men också delvis i de våtmarker som vi har som bekämpningsområden. Den största faran för dykarna med BTIbekämpning skulle med det resonemanget vara om det inträffar en tidig, april-maj, översvämning följt av en stor produktion av översvämningsmygg. Då kan det samtidigt finnas både översvämningsmygg och skogsmygg och därmed skulle de mygglarvs-anpassade dykarna förlora merparten av sin föda. Dock kan det antas att merparten av dessa dykare främst håller till i de habitat som är favoriserade av skogsmyggen och där utförs det inga bekämpningar. De vuxna stickmyggorna kläcker i mycket stort antal under den första delen av sommaren, samtidigt med ett enormt antal andra insektsarter av flertalet ordningar. Därmed är bordet dukat för de många insektätande fåglar, däggdjur, groddjur, spindeldjur och rovlevande insekter som reproducerar sig vid denna hektiska tid. De vuxna stickmyggorna ingår i dieten för samtliga dessa grupper av predatorer, men utgör bara en marginell del av födan (Bibby 1981, Onyeka 1983, Blum et al. 1997, Arnold et al. 2000, Ashley et al. 2000, Chernetsov & Manukyan 2000). Detta kan synas märkligt mot bakgrund av de mycket stora populationerna 7

av stickmyggor, men kan förklaras av att det finns så många andra insekter som är lättare att fånga i relation till sitt näringsinnehåll. Stickmyggor flyger snabbt och är främst aktiva i skymningen eller dagtid i skuggiga miljöer, vilket gör dem svåra att observera och besvärliga att fånga i flykten. Under dagen gömmer de sig lågt i vegetationen eller andra mörka och fuktiga miljöer och flyger snabbt iväg vid störning. Vi noterar därför att vuxna stickmyggor främst riskerar att bli byten för spindlar (Dabrowski-Prot & Luczak 1968) samt eventuellt de tättingar som under dygnets ljusa timmar söker efter smådjur i busk- och örtvegetation samt kring basen av stora träd. Slutsats: Generellt är varken akvatiska eller terrestra predatorer specialiserade på eller helt beroende av stickmyggor. Dock kan det inte uteslutas att larver av främst skogsmyggor utgör en betydande andel av föda för enstaka arter av dykarskalbaggar. 1.5 Uppgifter som krävs för att påvisa negativa miljöeffekter De möjliga negativa miljöeffekterna av att översvämningsmyggor bekämpas med VectoBac G som sprids från helikopter är mycket små vilket medför problem att påvisa och kvantifiera dessa eventuella effekter. De möjliga bieffekterna kan delas upp på direkt BTI-förgiftning av organismer, indirekta effekter av att BTI slår ut viktiga byten för predatorer. Endast insekter av några familjer inom Diptera är känsliga för direkt förgiftning av BTI. För att påvisa och kvantifiera negativa effekter hos dessa insekter krävs uppgifter om förekomst i bekämpningsområden, uppgifter om populationsfluktuationer inom och mellan år, samt jämförande studier mellan områden med och utan bekämpning. För organismer som uppvisar känslighet behövs också en tydlig koppling till hur detta relaterar till effekter på populationsnivå. Risken för indirekta effekter på predatorer bestäms av till vilken grad de är beroende av översvämningsmyggor som födoresurs samt varierar också mellan akvatiska predatorer (tar stickmygglarver) och terrestra predatorer (tar vuxna stickmyggor). För att påvisa och kvantifiera negativa effekter hos akvatiska predatorer krävs uppgifter om förekomst i bekämpningsområden, uppgifter om populationsfluktuationer inom och mellan år, jämförande studier mellan områden med och utan bekämpning, samt studier av födoval och hur detta varierar i relation till vilka byten som finns tillgängliga. Det behövs också en tydlig koppling mellan de effekter som kan observeras och den betydelse de kan ha på populationsnivå. Även för att påvisa och kvantifiera negativa effekter hos terrestra predatorer krävs dessa uppgifter. Slutsats: Det krävs omfattande personella och ekonomiska resurser för att påvisa och kvantifiera de mycket små negativa miljöeffekter som spridning av VectoBac G kan förväntas medföra för de temporärt översvämmade våtmarkernas fauna. 2. Uppföljning av miljöeffekter 2.1 Förebyggande åtgärder För att undvika eventuella skadliga verkningar av BTI på fjädermygglarver så använder vi så låg dosering som möjligt med bibehållen effekt på stickmygglarver och arbetar med mycket hög precision vid spridning. Den spridarutrustning som skall användas kalibrerats noga med avseende på flöde och spridningsprofil. Vi har utprovat lämplig dosering för tillfredsställande reduktion av antalet Ochlerotatus sticticus larver under de förhållanden som råder i svenska översvämningsvåtmarker. Det kan noteras att larver av stickmyggor och fjädermyggor 8

förekommer i delvis olika vattenmiljöer; stickmyggor främst i temporära våtmarker och fjädermyggor främst i permanenta vatten (Becker & Ludwig 1983, Lacey & Mulla 1990). Slutsats: De förebyggande åtgärderna är att säkerställa lämplig dosering och hög geografisk precision vid spridning av VectoBac G. 2.2 Rapportering av uppföljningsprogram insekter Dispens från rådande lagrum beviljades under 2002, 2003, 2004 och 2005 för bekämpning av stickmygglarver i översvämningsvåtmarker. Dispensen kopplades till ett uppföljningsprogram för studier av bekämpningens negativa effekter på insekter i översvämningsvåtmarker. Uppföljningsprogrammet utformades för att ge generell information om bekämpningens risker och startades maj 2002 efter godkännande av Länsstyrelserna i Västmanlands och Gävleborgs Län. Arbetshypoteserna var; 1) att BTI ger direkt toxiska effekter på insekter av underordningen Nematocera inom ordningen Diptera, 2) att BTI även ger direkt toxiska effekter på andra taxa av insekter som förekommer i översvämningsvåtmarker, 3) att den kraftigt reducerade mängden stickmygglarver efter BTI-behandling ger indirekta negativa effekter på alla taxa av rovlevande vatteninsekter. Studien omfattade sex översvämningsvåtmarker (tre experimentområden och tre kontrollområden) med fångst av insekter med tre metoder under tre år (Forsberg et al. 2006, Lundström et al. 2006). En kläckningsfälla för kontinuerlig fångst av samtliga insekter som utvecklas under fällan (ligger på marken vid torka och flyter på vatten vid översvämning, fångar såväl Nematocera som andra taxa), en dykarmjärde för fångst av simmande och krypande insekter under två veckor per månad (fungerar endast i vatten, fångar dykarskalbaggar och andra aktiva predatorer), samt håvning av vatteninsekter under två veckor per månad (enbart i vatten, fångar såväl predatorer som flertalet övriga insekter). Bekämpning av stickmygglarver i experimentområden utfördes vid tre tillfällen (vecka 28 och vecka 31 2002, vecka 20 2003) under dessa tre år. Direkta toxiska effekter på våtmarksinsekter: De totalt 60 089 insekter som fångats och som identifierades till taxonomisk ordning och familj fördelade sig på 12 taxonomiska ordningar. Vanligt förekommande var insekter av ordningarna Diptera (kontrollområden 72,2 %, experimentområden 80,0 %), Hymenoptera (kontrollområden 18,5 %, experimentområden 13,8 %), Coleoptera (kontrollområden 5,9 %, experimentområden 3,6 %) och Homoptera (kontrollområden 2,8 %, experimentområden 2,2 %). Insektmaterialet innehöll totalt 119 familjer och tre överfamiljer (identifiering till familj var inte genomförbar). Ordningen Diptera med 53 familjer utgjorde den i särklass största delen av materialet. Analyserna visar att stickmygglarvbekämpning med det biologiska bekämpningsmedlet VectoBac G inte orsakade några signifikant negativa effekter på våtmarkernas insektfauna. Multivariat analys genomfördes i flera nivåer från hela materialet med totalt 119 familjer och tre överfamiljer, över enbart de 16 familjerna inom underundningen Nematocera till slutligen en fokusering på sju familjer inom Nematocera som i någon grad är känsliga för den aktiva beståndsdelen BTI i VectoBac G. Insektsamhällenas variationen mellan år och mellan tidsperioder inom år var större än den variation som kunde observeras mellan experimentområden (där bekämpning genomfördes) och kontrollområden (utan bekämpning). Mer djupgående analyser av enbart familjen Chironomidae, den förrutom Culicidae känsligaste familjen i våtmarksområden, visade på signifikanta effekter under 2002 och 2003. 9

Närmare undersökningar av orsaken till dessa skilnader visade att 2002 inträffade differensen före den första bekämpningen och 2003 inträffade den tre veckor efter bekämpning. Men den ackumulerade produktionen av Chironomidae var högre i experimentområden än i kontrollområden 2003. Det betyder att studien inte ger något signifikant belägg för att VectoBac G ger oönskade effekter på insektfaunan i temporärt översvämmade svenska våtmarker. En studie utförd under fem år (de tre sista åren med BTI-behandling 6 ggr/säsong) i Minnesota visade inga negativa effekter under det första året med behandling men väl under det andra och tredje året (Hershey et al. 1998). I denna studie syntes en kraftigt negativ effekt på flera grupper av insekter under andra året och ännu större effekter under det tredje året av intensiv bekämpning med BTI. Den intensiva behandlingen med BTI fortsatte under ytterligare fem år och effekterna på faunan studerades även under det sjunde och åttonde året av bekämpning (Read et al. 1999). I detta nya material som insamlats efter 7 och 8 års intensiv behandling med BTI hade samtliga tidigare observerade negativa effekter försvunnit utom en mindre förändring inom familjen Chironomidae. Två grupper inom underfamiljen Chironominae hade minskat efter den intensiva BTI behandlingen, underfamiljen Orthocladinae hade ökat och underfamiljen Tanypodinae var oförändrad. Det är därför möjligt att mycket intensiv användning av BTI kan ge en förskjutning av artkompositionen hos Chrironomidae, men utan att reducera antalet för familjen som helhet. Indirekta effekter på dykarskalbaggar: En mycket liten och icke signifikant del av variationen hos dykarskalbaggar fångade i områden med och utan bekämpning kunde förklaras av faktorn BTI (Carlander 2003). Dykarskalbaggsfaunan för 2002 visade endast svaga icke signifikanta tecken på att BTI kan ha påverkat. Förekomst och diversitet hos dykarskalbaggar styrs av många faktorer och det finns en viss naturlig variation även under en säsong. Den absolut viktigaste är förstås tillgången på vatten, dykarskalbaggar är beroende av vatten men är också mycket mobila och flyger iväg om vattnet eller födan försvinner. Under 2002 fanns det relativt god tillgång på vatten och fångsten av dykare blev bra, vilket ger tyngd åt analyserna. Dock skall det sägas att dessa analyser av dykarskalbagge faunan utfördes under en enda säsong men dessa skalbaggar är långlivade och det är möjligt att för vissa arter krävs längre studietider för att kunna observera eventuella effekter. Den mer omfattande studien över tre år visade en områdeseffekt (behandlade kontra obehandlade) med fler dykare i de obehandlade områdena under 2002, men inte under 2003 (Forsberg et al. 2006). Differensen under 2002 berodde på en signifikant ökning av antalet dykare i obehandlade områdena men ett mer konstant antal dykare i bekämpade områden. Upp och nedgående trender, oavsett art, följs åt väl mellan behandlade och obehandlade områden men efter bekämpningstillfället 2002 var det fler individer i obehandlade än i behandlade områden. Möjligen kan dykarskalbaggar bedöma mängden potentiella byten i en vattensamling och lämna en improduktiv miljö för att söka en som är bättre. En genomgång av publicerade studier gav dock ingen indikation på att BTI påverkade dykarskalbaggar (Boisvert & Boisvert 2000). En studie utförd under fem år (de tre sista åren med BTIbehandling 6 ggr/säsong) i Minnesota visade inga negativa effekter under det första året med behandling men väl under det andra och tredje året (Hershey et al. 1998). I denna studie syntes en kraftigt negativ effekt på dykarskalbaggarnas larver under det tredje året av intensiv bekämpning med BTI, men inga signifikanta effekter på de vuxna dykarskalbaggarna. Den intensiva behandlingen med BTI fortsatte under ytterligare fem år och effekterna på faunan studerades även under det sjunde och åttonde året av bekämpning (Read et al. 1999). De vuxna dykarskalbaggarna visade ingen signifikant negativ reaktion på intensiv BTIanvändning under flera år. Det finns dock en möjlighet att dykarskalbaggar av några arter kan vara mer specialiserade på stickmygglarver, men då främst larver av skogsmyggor vars förekomst är årligt återkommande i skogsmiljöer under vår och försommar. 10

En dykarskalbagge som speciellt måste nämnas är Graphoderus bilineatus som är en Natura 2000-art och är därmed fridlyst i hela landet. Arten förekommer främst i djupare (> 1 m) dammar och sjöar med tät vegetation (Nilsson & Holmen 1995). Den är ganska vanlig i södra Sverige men blir mer sällsynt längre norrut med de nordligaste fynden i Hälsingland. Vi fångade två exemplar i kanten av Nordmyrasjön, den enda av de sex försökslokalerna som motsvarar artens krav på livsmiljö. Stickmyggornas larver föredrar grunt vatten (Renshaw et al. 1995) och är därför inte någon viktig del av dieten för G. bilineatus som främst förekommer i djupare vatten. Slutsats: Resultaten från dessa omfattande studier visar att flera faktorer påverkar variationen i populationsstorlek hos insekter i temporärt översvämmade våtmarker och att BTI inte har någon påvisbar direkt toxisk effekt på våtmarkernas insektsamhällen, men eventuellt en mycket låg grad av indirekt påverkan på de dykarskalbaggar som är predatorer på stickmygglarver. 2.3. Rapportering av biotest för påvisning av BTI i sediment Länsstyrelsen i Gävleborgs län har fört fram frågan om BTI kan ackumuleras i mark och sediment. En sådan ackumulering av pretoxiner över längre tidsperioder skulle teoretiskt kunna påverka främst stickmygglarver (som är extremt känsliga) men även larver av Chironomidae. Därför har vi genomfört en biotest av eventuellt ackumulerat BTI pretoxin i sedimentprover från områden med och utan avsiktlig spridning av BTI för bekämpning. Sedimentprover togs 050702 dels från ett område vid Norrån där bekämpning genomförts flera gånger (två gånger 2002, en gång 2003 samt 16 juni 2005), dels från ett område vid Fängsjön där bekämpning genomförts en gång 2002, dels från ett område i Koversta där bekämpning aldrig genomförts. Sedimentproverna slammades upp i destillerat vatten och överfördes till fem odlingsburkar vardera. Som en positiv kontroll tillsattes två korn VectoBac G till vardera av fem ytterligare odlingsburkar med uppslammat sediment från Koversta. Förstastadielarver av översvämningsmyggor (troligen Ochlerotatus sticticus) fångades i Domta, Enköpings kommun, morgonen den 2 juli 2005. Senare samma dag placerades 20 av dessa larver till var och en av de totalt 20 odlingsburkarna med uppslammade sedimentprover. Larverna i varje odlingsburk matades med en väl avvägd mängd Tetramin fiskfoder och räknades dagligen under fem dagar. Resultaten visade att samtliga stickmygglarver avled inom ett dygn i de fem burkar som behandlats med VectoBac G och att alla stickmygglarver i de återstående 15 burkarna överlevde fem dygn. Detta visar att det varken fanns någon kvarvarande toxisk effekt två år efter en enstaka bekämpning eller efter upprepade bekämpningar under flera år där den sista bekämpningen genomfördes endast ett par veckor före provtagning för sediment. Resultaten baseras på biotest med unga larver av stickmyggor, de organismer som bevisligen är mest känsliga för BTI, vilket indikerar att om BTI ackumulerats i miljön så handlar det om mängder som ligger under den nivå som krävs för påverkan på de mest känsliga organismerna. Detta resultat rimmar väl med den korta varaktighet som rapporterats för BTI i miljön (http://extoxnet.orst.edu/pips/bacillus.htm). Ser därför inget behov av fortsatta biotester för vidare utredning av denna fråga. Slutsats: Biotest av sedimentprover från områden där VectoBac G spridits för att bekämpa stickmyggor visade inte på någon kvarvarande toxisk effekt mot unga stickmygglarver. Risken för ackumulering i miljön anses därför som mycket låg. 11

3. Fortsatt uppföljning av miljöeffekter 3.1. Fördjupade frågor om påverkan på våtmarkernas insekter Uppföljningsstudierna föreslås få en tydligare fokusering på de ekologiska problem som rimligen kan inträffa enligt befintlig kunskap. Direkta toxiska effekter av BTI är enbart att förvänta hos familjen Chironomidae. Indirekta effekter av minskad mängd stickmygglarver kan enbart drabba de organismer som förekommer samtidigt med stickmygglarver i temporära vattensamlingar och främst några arter av dykarskalbaggar kan eventuellt vara mer beroende av stickmygglarver. Förekommer någon: 1. direkt toxisk effekt av BTI på Chironomidae i översvämningsvåtmarker? 2. indirekt effekt av kraftigt minskad mängd stickmygglarver på faunan i temporära vattenmiljöer? 3.2 Direkta negativa effekter på Chironomidae Den generella delen av uppföljningsstudien utfördes inom sex översvämningsvåtmarker matchade i tre par. Den fortsatta mer detaljerade studien förutsätts fortsätta inom samma våtmarker och skall fokuseras på insamling av familjen Chironomidae. För var och en av de sex våtmarkerna har vi markerat fyra fällpositioner fördelade på definierade våtmarkshabitat som återfinns hos båda våtmarkerna inom varje par. Tidigare nyttjades 10 fällpositioner per våtmark, men detta resulterade i ohanterliga mängder insekter för identifiering. Därför ändras nu designen för att ge tillräcklig information men med ett mindre antal fällpositioner och dessa positioner är detsamma som under den tidigare studien vilket ger möjlighet till fångst i samma områden och positioner under totalt sex år (2002 2007). De fyra fällpositionerna har valts för att representera de hydrologiska miljöer som innefattades av de tidigare 10 positionerna. Vid varje fällposition fångas insekter kontinuerligt med hjälp av en kläckningsfälla under vecka 19 till vecka 37 varje år. Fällorna vittjas normalt en gång per vecka under denna tid. Fångsten utförs i tre våtmarker utan myggbekämpning (3x4=12 kläckningsfällor) och i tre våtmarker där myggbekämpning utförs vid översvämning (3x4=12 kläckningsfällor). Chironomidae plockas ut för identifiering till släkte eller längre (beroende på vilken upplösning som är möjligt med en rimlig arbetsinsats) medan övriga insekter sparas utan vidare identifiering. Resultaten kommer att presenteras dels som analyser av eventuella skillnader på släktnivå mellan områden med och utan bekämpning, dels som listor över de arter vi identifierat. 3.3 Indirekta negativa effekter av minskad mängd stickmygglarver Med utgångspunkt från publicerade studier känner vi till 54 insektfamiljer inom 9 ordningar som kan förekomma i temporära pölar och våtmarker. Våra preliminära studier av faunan i de vattensamlingar som innehåller stickmygglarver visat dock på en betydligt lägre komplexitet. Kunskapen om vilka familjer och arter som använder stickmygglarver som födoresurs är mycket begränsad och det går inte att avgöra betydelsen av denna näringsresurs i nuläget. Näringsvävsbiologisk teori pekar dock på att potentiella bytesdjur som förekommer i stor mängd också är viktiga komponenter i näringsväven. Av de potentiella bytesdjuren för vattenlevande rovinsekter i kortvariga temporära vatten utgör stickmygglarver och hoppkräftor de största populationerna, vilket indikerar att dessa taxa har central roll i dessa näringsvävar. 12

Insamling av insekter och kräftdjur i temporära vattensamlingar och våtmarker genomförs både under våren/försommaren och under den varmare delen av sommaren. Resultaten kommer att visa vilka rovlevande insekter och vilka alternativa bytesdjur som verkligen förekommer parallellt med stickmygglarver i dessa kortvariga vattenmiljöer samt hur faunan varierar mellan vår/föresommar och sommar. Identifiering till art utförs för de organismer för vilka detta är möjligt med en rimlig arbetsinsats. Det är viktigt att visa vilka arter av rovinsekter som äter stickmygglarver för att kunna definiera samband i en enkel form av näringsväv. Dock är det svårt att genom direkta observationer eller enkla experiment få fram tillförlitlig information. DNA från bytesrester i rovinsekter kan amplifieras med PCR och sedan påvisas och karakteriseras vilket gör det möjligt att identifiera bytesrester både i rovinsekter som suger ur sina byten och i insekter som tuggar sina byten. Detta är speciellt värdefullt då många rovdjur i temporära vatten (dykarbaggelarver, skinnbaggar, rovlevande larver av tvåvingar, sländelarver, etc) suger ur sina byten, men några tuggar sina byten (vuxna dykarbaggar). Små mängder DNA från bytesrester kan troligen påvisas upp till ca 20 timmar efter förtäring. Vi har ett relativt stort material av insamlade rovinsekter konserverade i sprit som kan användas för undersökning av bytesrester med hjälp av PCR teknik. Tekniken används regelbundet och i stor omfattning vid vår avdelning inom Uppsala universitet och generella primers finns att tillgå för amplifiering av DNA från insekter och andra leddjur. Denna metodik ger tillförlitlig information om vem som äter vem, men kan inte besvara frågan om hur stor mängd av de olika bytesdjuren som konsumeras av en predator. Här behövs ytterligare information som genereras genom experiment. Sammantaget skall dessa två nivåer av information användas i en näringsvävsmodell för att utvärdera betydelsen av stickmygglarver som bytesdjur för rovinsekter. Det är möjligt att resultaten av dessa studier kommer att ge information som leder till en omvärdering av stickmygglarvernas betydelse i översvämningsvåtmarker. Med utgångspunkt från denna nya information kan det öppnas möjligheter att genomföra mer strukturerad uppföljning av bekämpningens eventuella indirekta effekter på rovlevande vatteninsekter och på bytesdjur andra än stickmygglarver. 4. Refererad litteratur Ali, A., Baggs, R. D. and Stewart, J. P. 1981. Suceptibility of some Florida chironomids and mosquitoes to various formulations of Bacillus thuringiensis serovar. israelensis. Journal of Economical Entomology 74:672-677. Arnold, A., Braun, M., Becker, N. and Storch, V. 2000. Zur Nahrungsökologie von Wasserund Rauhhautfledermaus in den nordbadischen Rheinauen. Carolinea 58:257-263. Ashley, M. C., Robinson, J. A., Oring, L. W. and Vinyard, G. A. 2000. Dipteran standing stock biomass and effects of aquatic bird predation at a constructed wetland. Wetlands 20:84-90. Back, C., Boisvert, J., Lacoursière, J. O. and Charpentier, G. 1985. High-dosage treatment of a Quebec stream with Bacillus thuringiensis serovar. israelensis: Efficacy against black fly larvae (Diptera: Simuliidae) and impact on non-target insects. Canadian Entomologist 117:1523-1534. Barjac, H. A. d. 1978. A new subspecies of Bacillus thuringiensis very toxic to mosquitoes. Bacillus thuringiensis var. israelensis serotype 14. C. R. Acad. Sci. (Paris) 286D:797-800. Becker, N. and Ludwig, H. W. 1983. Mosquito Control in West Germany. Bulletin of the Society for Vector Ecology 8:85-93. 13

Becker, N. and Margalit, J. 1993. Use of Bacillus thuringiensis israelensis against mosquitoes and blackflies. In P. F. Entwistle et al. (ed.) Bacillus thuringiensis, An Environmental Biopesticide: Theory and Practice. John Wiley & Sons Ltd. Bibby, C. J. 1981. Food supply and the diet of the bearded tit (Panurus biarmicus). Bird Study 28:201-210. Blaustein, L. 1998. Influence of the predatory backswimmer, Notonecta maculata, on invertebrate community structure. Ecological Entomology 23:246-252. Blum, S., Basedow, T. and Becker, N. 1997. Culicidae (Diptera) in the diet of predatory stages of anurans (Amphibia) in humid biotopes of the Rhine valley in Germany. Journal of Vector Ecology 22:23-29. Boisvert, M. and Boisvert, J. 2000. Effects of Bacillus thuringiensis var. israelensis on target and nontarget organisms: a review of laboratory and field experiments. Biocontrol Science and Technology 10:517-561. Carlander, G. 2003. Effekter av Bti (Bacillus thuringiensis var. israelensis) på dykarfaunor (Dytiscidae) jämförda med våtmarkstypens betydelse för faunorna. Examensarbete, Institutionen för fysik och mätteknik, Linköpings universitet. Chernetsov, N. and Manukyan, A. 2000. Foraging strategy of the Sedge Warbler (Acrocephalus schoenobaetus) on migration. Vogelwarte 40:189-197. Chesson, J. 1984. Effect of Notonectids (Hemiptera: Notonectidae) on mosquitoes (Diptera: Culicidae): Predation or selective oviposition? Environmental Entomology 13:531-538. Dabrowski-Prot, E. and Luczak, J. 1968. Studies on the incidence of mosquitoes in the food oftetragnatha montanasimon and its food activity in the natural habitat. Ekologia Polska Seria A 16:843-852. Deding, J. 1988. Gut content analysis of diving beetles (Coleoptera: Dytiscidae). Natura Jutlandica 22:177-184. Drobniewski, F. A. 1993. The safety of Bacillus species as insect vector control agents. Journal of Applied Bacteriology 76:101-109. Eskils, K. 2001. Microbial ecology and virulence gene studies of the insect pathogen Bacillus thuringiensis. PhD Thesis, Department of Microbiology, Stockholm University. Eskils, K. and Lövgren, A. 1997. Release of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis in Swedish soil. FEMS Microbiology Ecology 23:229-237. Forsberg, B., Persson, T. Z., Petersson, E., Schäfer, M. and Lundström, J. O. 2006. Biologisk myggbekämpning i nedre Dalälven - Uppföljning av effekter på dykarskalbaggar (Fam. Dytiscidae). Rapport, Institution för ekologi och evolution, Uppsala Universitet. Glare, T. R. and O'Callaghan, M. 1998. Environmental and health impacts of Bacillus thuringiensis israelensis. Biocontrol & Biodiversity, Grasslands Divison, AgResearch. Goldberg, L. J. and Margalit, J. 1977. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univitattus, Aedes aegypti and Culex pipiens. Mosquito News 37:355-358. Halkova, Z., Zaykov, C., Antov, G., Mihaylova, A., Mircheva, V., Dinoeva, S. and Chipilska, L. 1993. Experimental study of subacute oral, dermal and inhalation toxicity of Bulmoscide preparation. Polish Journal of Occupational Medicine and Environmental Health 6:19-25. 14

Hershey, A. E., Lima, A. R., Niemi, G. J. and Regal, R. R. 1998. Effects of Bacillus thuringiensis israelensis (BTI) and methoprene on nontarget macroinvertebrates in Minnesota wetlands. Ecological Applications 8:41-60. Houston, J., Dancer, B. N. and Learner, M. A. 1989. Control of sewage filter flies using Bacillus thuringiensis var. isaraelensis-ii. Full scale trials. Water Research 23:379-385. Ignatiev, V. I., Karopv, E. G. and Meliksetyan, V. S. 1988. Studies on the effect of serotype H-14 Bacillus thuringiensis preparations on warm-blooded animals. Mikrobiologicheskij zhurnal (in Russian) 50:73-77. Iversen, T. M. 1971. The ecology of a mosquito population (Aedes communis) in a temporary pool in a Danish beech wood. Archiv für Hydrobiologie 61:309-332. Keil, C. B. 1991. Field and laboratory evaluation of a Bacillus thuringiensis var. israelensis formulation for control of fly pests of mushrooms. Journal of Economical Entomology 84:1180-1188. Lacey, L. A. and Mulla, M. S. 1990. Safety of Bacillus thuringiensis ssp.israelensis and Bacillus sphaericus to nontarget organisms in the aquatic environment. 169-188. In M. Laird et al (ed.) Safety of Microbial Insecticides. CRC Press, Boca Raton, Fla, USA. Lee, F. C. 1967. Laboratory observations on certain mosquito larval predators. Mosquito News 27:332-338. Lundström, J. O., Schäfer, M., Persson, T. Z., Petersson, E. and Forsberg, B. 2006. Produktion av insekter i översvämningsvåtmarker med och utan biologisk kontroll av stickmygglarver. Rapport, Institution för ekologi och evolution, Uppsala Universitet. Margalit, J. 1990. Discovery of Bacillus thuringiensis israelensis. 3-9. In H. d. Barjac & D. J. Sutherland (eds.) Bacterial Control of Mosquitoes and Black Flies. Ruthgers University Press, New Brunswick, NJ, USA. Nilsson, A. 1986. Community structure in the Dytiscidae (Coleoptera) of a northern Swedish seasonal pond. Annales Zoologici Fennici 23:39-47. Nilsson, A. N. and Holmen, M. 1995. The aquatic Adephaga (Coleoptera) of Fennoscandia and Denmark. II. Dytiscidae. E. J. Brill., Leiden, The Netherlands. Nilsson, A. N. and Svensson, B. W. 1994. Dytiscid predators and culicid prey in two boreal snowmelt pools differing in temperature and duration. Annales Zoologici Fennici 31:365-376. Onyeka, J. O. A. 1983. Studies on the natural predators of Culex pipiens L. and C. torrentium Martini (Diptera: Culicidae) in England. Bulletin of Entomological Research 73:185-194. Pont, D., Franquet, E. and Tourenq, J. N. 1999. Impact of different Bacillus thuringiensis variety israelensis treatments on a chironomid (Diptera Chironomidae) community in a temporary marsh. Journal of Economic Entomology 92:266-272. Read, N., Balcer, M. D., Schmude, K. L. and Lima, A. 1999. Does Bti or methoprene affect wetland invertebrates other than mosquitoes? 3-year and 8-year results compared. National Meeting of the Entomological Society of America. Renshaw, M., Silver, J. B., Service, M. W. and Birley, H. M. 1995. Spatial dispersion patterns of larval Aedes cantans (Diptera: Culicidae) in temporary woodlands. Bulletin of Entomological Research 85:125-133. Service, M. W. 1977. Ecological and biological studies on Aedes cantans (Meig.) (Diptera: Culicidae) in Southern England. Journal of Applied Ecology 14:159-196. 15

Siegel, J. P. and Shadduck, J. A. 1990. Clearance of Bacillus sphaericus and Bacillus thuringiensis ssp. israelensis from mammals. Journal of Economical Entomology 83:347-355. Sinegre, G., Babinot, M., Vigo, G. and Tourenq, J. N. 1990. Sensibilité de trois espèces de Chironomus (Diptera) à huit insecticides utilisés en démoustication. Annales de Limnologi 26:65-71. Smits, P. H. and Vlug, H. J. 1990. Control of Tipulid larvae with Bacillus thuringiensis var. israelensis protoxin activationand safety. Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control, Adelaide, Australia. Toth, R. S. and Chew, R. M. 1972. Development and energetics of Notonecta undulata during predation on Culex tarsalis. Annals of the Entomological Society of America 65:1270-1279. Warren, R. E., Rubenstein, D., Ellar, D. J., Kramer, J. M. and Gilbert, R. J. 1984. Bacillus thuringiensis var. israelensis: Protoxin activation and safety. The Lancet 323:678-679. WHO. 1981. Data sheet on the biological control agent Bacillus thuringiensis serotype H-14 (debarjac 1978). World Health Organisation, Document WHO/VBC/79.750 Rev. 1. WHO. 1999. Bacillus thuringiensis. Environmental Health Critera 217. WHO/IPCS/IOMC. 16