UMEÅ UNIVERSITET 2011-01-11 Institutionen för molekylärbiologi RUT10 - Biomedicinsk vetenskap I FÄRGNING OCH MIKROSKOPERING AV MIKROORGANISMER Målsättning Att använda metoder för direkt observation av mikroorganismer. Bakgrund Det mänskliga ögat kan se en partikel med en diameter av ca 0,1 mm på ett avstånd av 25 cm. Bakterier är ytterligare 50-100 gånger mindre (1-2 m). Ljusmikroskops maximala upplösningsförmåga är ca 0,2 m, dvs två partiklar kan inte särskiljas om avståndet är mindre än 0,2 m. För att studera sedimenterade celler eller celler som växer på botten av ett odlingskärl används ett ljusmikroskop som är inverterat, sk invertmikroskop. För att få fram en skarpare bild av celler kan man använda ett faskontrastmikroskop där kontrasten mellan celler och omgivande medium förstärkts eller binda en fluorescerande substans till celler och observera dem i ett fluorescensmikroskop och då avger cellen ljus medan bakgrunden är mörk. Många celldelar och cellstrukturer kan ibland påvisas selektivt och på ett iakttagbart sätt med hjälp av färgningsmetoder. Färgningen medför oftast celldöd. De strukturer som iakttas i färgade celler förekommer därför inte säkert i den levande cellen utan måste påvisas genom jämförande studier. Celler avgränsas utåt av cellvägg och cellmembran, som fungerar som permeabilitetshinder för de flesta färgämnesmolekyler; även inuti cellen finns det barriärer mot fri diffusion. Av den anledningen får man sällan ett bra resultat om man behandlar celler direkt med en lösning av färgämnet. För att färgämnesmolekylerna ska nå cellens inre, måste således cellvägg och membran förstöras, vilket sker genom fixering med kemiska substanser eller med värme. Vid fixering i värme koaguleras cellproteinerna genom värmning i låga. Det är en grov metod i jämförelse med den kemiska fixeringen, men den går fort att utföra. Efter fixering har utfällt protein ett brytningsindex, som är nästan samma som immersionsoljans brytningsindex (1.52), medan löst protein (cytoplasma) har ett betydligt lägre brytningsindex (ca 1.35). Därför syns fixerade celler mycket klarare om oljeimmersionsobjektivet används. Mikroskopering: Att ställa in skärpan på mikroskopet kan vara besvärligt. En bra metod är att börja med lägsta förstoringen, 10X-objektivet (gult). Ställ in skärpan på täckglasets kant eller på en luftbubbla. När sedan objektivet vrids till 40X kommer skärpan att vara nästan rätt. Ställ in exakt, lägg på en droppe immersionsolja, vrid till 100X och finjustera. Olja måste användas på 100Xobjektivet. Däremot får olja inte användas på de andra objektiven. Man kan alltså i regel inte gå tillbaka och titta på 40X från 100X. Okularet (som man tittar i) förstorar 10X. 10X-objektiv + 10X-okular ger 100X förstoring, 40X ger 400X osv.
Materiel Färglösningar Täckglas Kleenex Sterilt vatten Preparatställ (sandlåda) Objektglas Acetonsprit 0.15M NaCl Preparathållare A. MIKROSKOPISK UNDERSÖKNING AV OFÄRGADE CELLER Mikroorganismer t. ex. Escherichia coli övernattkulturer på LAL-platta Sarcina lutea Saccharomyces cerevisiae 48 h gammal kultur på YE-platta eller andra av assistenten angivna stammar. Utförande 1. Tvätta ett objektglas med acetonsprit. På det torkade glaset sätts en droppe 0,9% NaCl. Fem l bakteriekultur doppas direkt på objektglaset. 2. Lägg försiktigt på ett väl avtorkat täckglas så att luftbubblor inte bildas. 3. Studera preparaten i mikroskop. 4. Rita av de olika celltyperna och kommentera iakttagelserna. B. FÄRGNING AV CELLER MED METYLENBLÅTT Färgning med metylenblått är en enkel och snabb metod som används för allmän färgning av bakterier, ibland även för klinisk identifiering. Metylenblått är ett positivt laddat färgämne som reagerar med negativa laddningar. Eftersom sådana laddningar förekommer överallt i cellen är metoden avsedd för färgning av hela celler och är alltså olämplig för studier av substrukturer. Mikroorganismer t. ex. Bacillus subtilis (övernattskultur på LAL-platta) eller annan av assistenten angiven mikroorganism. Färglösning Löfflers alkaliska metylenblått. 2
Utförande 1. Tvätta rent ett objektglas med acetonsprit. På det torkade glaset sätts en droppe 0.9% NaCl, i vilken lite celler från en koloni på plattan slammas upp. Droppen breds ut med plastplatinösen till en yta av ca 1 cm2. 2. Preparatet torkas långsamt ca 50 cm över brännarens stora låga (vattnet får inte börja koka). 3. Fixera cellerna genom att föra objektglaset med bakteriesidan uppåt genom stora lågan 4-5 gånger. 4. Droppa flödigt med färglösning på den torkade bakteriesuspensionen och vänta 2-3 min. Häll av färgen i sandlådan. 5. Doppa glaset i en bägare med kallt vatten. Spola kranvatten mot bägarens kant tills ingen ytterligare färg löses ut. 6. Torka preparatet försiktigt med Kleenex. 7. Studera preparatet i mikroskop. 8. Rita av preparatet, dvs de färgade cellerna och kommentera dina iakttagelser. C. GRAMFÄRGNING Gramfärgningen är värdefull vid klassificiering och identifiering av bakterier. Gramreaktionen är ett stabilt karakteristikum för en bakterie. Grampositivitet är en egenskap hos aktivt växande celler av vissa arter. Celler i stationärfas förlorar denna egenskap och det är därför viktigt att vid färgning använda celler i logaritmisk tillväxtfas. Bakterier t. ex. Staphylococcus aureus och Escherichia coli (övernattkulturer på LAL-plattor) eller andra av assistenten angivna bakterier. Färglösningar Kristallviolett Lugols lösning Avfärgningslösning Saffraninlösning Utförande 1. Tvätta rent ett objektglas med acetonsprit. På det torkade glaset sätts en droppe 0,9% NaCl, i vilken litet celler från en bakteriekoloni på plattan slammas upp. Ta cellprovet från kanten av kolonin där det förekommer aktivt växande celler. Droppen breds ut med öglan till en yta av ca 1 cm2. 2. Preparatet torkas långsamt ca 50 cm över brännarens stora låga (vattnet får inte börja koka). 3. Fixera genom att föra objektglaset med bakteriesidan uppåt genom stora lågan 4-5 gånger. 4. Droppa på rikligt med kristallviolett på den torkade bakterie-fläcken och vänta 60 sekunder. Låt färgen rinna av i sandlådan och doppa glaset i en bägare med kallt vatten. Spola kranvatten mot bägarens kant till dess ingen ytterligare färg löses ut. 3
5. Droppa på rikligt med Lugols lösning (jod-jodkaliumlösning). Vänta 60 sekunder. Skölj försiktigt i vatten (se ovan). 6. Droppa på rikligt med avfärgningslösning till dess ingen ytterligare färg löses ut. 7. Skölj sedan preparatet noggrant (och försiktigt) i kallt kranvatten i bägare. Spola vatten mot bägarens kant. 8. Badda preparatet torrt med Kleenex - torka inte bort bakterierna! 9. Mikroskopera. Grampositiva celler blir blå, gramnegativa avfärgas. 10. För att få klarare skillnad mellan grampositiva och gramnegativa celler kontrastfärgas preparatet med Saffranin som droppas på flödigt. Vänta 45 sekunder. 11. Skölj preparatet med vatten och torka. 12. Mikroskopera.Gram-positiva organismer färgas blå-rödvioletta. Gramnegativa organismer färgas röda. Rita av, ange Gramreaktion och redogör för den mikroskopiska bilden av respektive preparat med och utan kontrastfärgning. Redogörelse inlämnas i form av ifyllda resultatblad. 4
APPENDIX RECEPT PÅ FÄRGLÖSNINGAR Löfflers alkaliska metylenblått. Recept: Metylenblåttklorid, mättad lösning i 95% etanol (löslighet ca 1,6 g/100 ml vid 20 ) 30 ml KOH löst i vatten, 0.01% 100 ml Kristallviolett Recept: Lösning A: Kristallviolett 10 mg Etanol 95% 100 ml Blanda till dess innehållet gått i lösning Lösning B: Ammoniumoxalat, 1% i destillerat H2O Blanda 20 ml av lösning A och 80 ml av lösning B. Lugols lösning. Recept: 3.3 g jod och 6.7 g kaliumjodid (KI) blandas i en mortel och behandlas till dess komponenterna blandats väl. Fukta massan med små uppmätta portioner vatten, överför allting kvantitativt till en glasproppsflaska. Fyll på med totalt 1 l vatten. Skaka till dess innehållet gått i lösning. Avfärgningslösning för gramfärgning Recept: Isopropanol, 75 ml plus Aceton 25ml (alt. Etanol 75 ml plus aceton 25 ml). Saffraninlösning 0.5% vattenlösning. 5
UMEÅ UNIVERSITET Kurs Institutionen för molekylärbiologi Termin/År Grupp nr Namn FÄRGNING OCH MIKROSKOPERING AV MIKROORGANISMER. RESULTAT A. MIKROSKOPISK UNDERSÖKNING AV OFÄRGADE CELLER Kommentarer: 6
B. FÄRGNING AV CELLER MED METYLENBLÅTT Kommentarer: C. GRAMFÄRGNING Kommentarer: : 7