Galantamin och Alzheimers sjukdom

Galantamin och Alzheimers sjukdom Alex Dawood Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling, 7,5hp Uppsala Universitet, VT 2008 1

Innehållsförteckning Sammanfattning 3 Historiskbakgrund 3 Galantamin.. 4 Alzheimer sjukdom.. 5 Verkningsmekanism 6 Biosyntes.. 6 Biverkningar av läkemedel innehållande galantamin 7 Metoder för bearbetning, extrahering och isolering. 8 Bearbetning 8 Extraktion 8 separationsmetoder.. 8 Diskussion 9 Referenser.11 2

Sammanfattning Galantamin är en alkaloid som extraheras från växter i familjen Amaryllidaceae. Den alkaloiden isolerades först av Mashkovsky år 1950. Därefter gjordes många försök av världens forskare för att testa den farmakologiska effekten. Galantamin är en acetylkolinesteras hämmare som används vid behandling av Alzheimer sjukdom. Den fungerar på så sätt att den först hämmar enzymer acetylkolinesteras som bryter ner acetylkolin och sedan potentierar effekten av acetylkolin, vilket förbättrar den kognitiva förmågan hos Alzheimer patienter. Patienter med Alzheimer sjukdom har minnesproblem, koncentrationssvårigheter, uppmärksamhetsstörning samt försämrad orientering. Anledningen till detta är att det har skett en degenerering av kolinergika neuroner i kortex och hippokampus i hjärnan. Läkemedlet som innehåller galantamin som används mot denna sjukdom är Reminyl. En ökad dos leder till biverkningar som illamående, dålig matsmältning, feber och yrsel. För att kunna få fram en ren substans måste olika metoder användas. Man börjar med bearbetning, det vill säga man samlar de delar av växten som innehåller alkaloiden och sedan behandla dessa delar med olika ämnen för att få ett pulver. Detta pulver extraheras med ett lösningsmedel och då får man en blandning som innehåller galantamin och andra alkaloider. Sista steget är att använda en separationsmetod för att separera den substans man intresserad av. Förutom den naturliga vägen kan man biosyntetisera galantamin genom en intramolekylär oxidativ process, där man kopplar olika substanser med varandra för att tillslut få den färdiga produkten. Historisk Bakgrund Galantamin är en alkaloid som tillhör familj Amaryllidaceae. Förutom galantamin innehåller denna familj många andra alkaloider som inte bara har medicinska effekter utan också andra toxiska effekter. De första utredningar som gjordes på denna alkaloid var för många år sedan. Då var det först under det kalla kriget, där den ryska forskaren, Mashkovsy, kunde isolerade galantamin från växten galathus woronowii. Detta var år 1950. Därefter fortsatte Mashkovsky tillsammans med sin kollega Kruglikova- Lvova arbeta med galantamin alkaloiden genom att de gjorde några in vivo försök på kaniner och grisar för att testa den farmakologiska effekten som galantamin hade (Heinrich and Teoh, 2004). 3

År 1952 upptäckte forskarna Proskurnina och Yakovleva, med hjälp av material från galathus woronowii, den kemiska strukturen för galantamin med den tertiära kväveatomen. Några år senare efter upptäckten av den kemiska strukturen bevisade en annan forskare, Bubeva Ivanova, att alkaloider som extraherades från växten galanthus nivalis är samma som de från galathus woronowii. Det var väldigt många forskare som var intresserade av just detta område. Därför gjordes många prekliniska studier och test på djur för att testa den farmakologiska effekten av galantamin. I början tillverkades ett preparat, Nivalin, som användes inom många medicinska områden, exempelvis neurologi, gastroenterologi, cardiologi och fysioterapi, men efter några år bevisade man att denna alkaloid kunde penetrera blod-hjärn-barriären och därmed påverka den centrala nerv systemet. Detta har sedan blivit ett intressant område för många forskare (Heinrich and Teoh, 2004). Galantamin Alkaloider med galantamin liknande struktur isoleras från växter som tillhör familjen Amaryllidaceae. Det finns också andra klasser av alkaloider hos denna familj med viktiga farmakologiska och biologiska egenskaper. Galantamin är den mest utspridda alkaloiden i den familjen. Den har blivit av stor betydelse med tanke på den farmakologiska effekten den ger. Andelen galantamin varierar ganska mycket beroende på vilken växt man kollar på exempelvis, hos växten leucojum aestivum finns det bara 0,3 %, medan växten galanthus woronowii innehåller 0,9 % galantamin. Hos familjen, N.confusus, utgör galantamin alkaloiden det viktigaste huvudämnet. Den finns nästan i alla delar av organet i bladet, rötter och stammar (Lopez et al, 2003). Alkaloiden ingår i läkemedlet Reminyl som används vid behandling av Alzheimer sjukdomar. Denna alkaloid som sagt finns i växter tillhörande familjen Amaryllidaceae, men bara få av de har använts som källor för isolering av galantamin (Berkov et al, 2008). Galantamin är en acetylkolinesteras hämmare som först och främst används vid behandling av Alzheimer sjukdom (AD). Mekanismen fungerar på så sätt att galantamin och dess derivat hämmar enzymet acetylkolinesteras som bryter ner acetylkoloin, vilket gör att acetylkolin nivåer ökar. Det är faktiskt en tvåvägsmekanism, där först sker en inhibering av enzymet acetylkolinesteras och sedan potentieras effekten av acetylkolin vid nikotin-acetylkolin-receptorer. Detta i sin tur leder till att människans kognitiva förmåga förbättras (Samuelsson, 2004). 4

Eftersom det har visats sig att substansen har förmåga att passera blod-hjärn-barriären har detta kunnat utnyttjas vid anestesi. Man har även studerat effekten av galantamin och jämfört den med andra substanser som har samma farmakologisk effekt och sett att galantamin verkar längre i det centrala nerv systemet (Harvy, 1995). Vad gäller galantaminets toxikologiska effekter så har man ännu inte sett några stora konsekvenser vid användning av läkemedel innehållande substansen galantamin. Den dagliga dosen bestående av 1 eller 4mg/kg orsakar inga signifikanta förändringar i människans vikt, blodinnehåll eller i hjärnans morfologi och histologi. Andra skador på lever, njurar, hjärta och skelettmuskulatur har inte heller rapporterats (Harvy, 1995). Alzheimer sjukdom Alzheimer sjukdom är den vanligaste formen av de neurodegenerativa sjukdomarna som förekommer hos äldre människor. Denna sjukdom utgör 60 % av alla demens sjukdomar. Anledningen till varför man får den typen av sjukdomar anses vara att det bildas degenerativ plack som resulteras av inlagring av proteinet beta-amyloid i hjärnan. Dessutom tror man att det fortfarande finns andra bidragande faktorer till sjukdomen (Johansson, 2007). Hos Alzheimer patienter är den kognitiva förmågan försämrad. Detta på grund av att det sker en degenerering av de kolinergika neuronerna i vissa delar av hjärnan, kortex och hippokampus. Som följd av detta motverkas transmissionen och reduceras acetylkolin nivåerna hos dessa patienter. Detta på verkas i sin tur frisättning av andra neurotransmittorer i de närliggande områdena. Det finns inga mediciniska behandlingar till patienter som lider av Alzheimer, inte heller symtomatiska metoder som kan återställa den kolinergika funktionen, men däremot finns det andra sätt som nämnts ovan, där läkemedelsubstanser exempelvis galantamin eller rivastigmin hämmar nyckelenzymet i det här fallet acetylkolinesteras som bryter ner acetylkolin (Samuelsson, 2004). Symtom man får vid Alzheimer sjukdom är minnesproblem. Vid den tidiga fasen av sjukdomen är dessa symtom diffusa och kommer smygande till den drabbade personen. Dessutom märks koncentrationssvårigheter och uppmärksamhetsstörning först i stressade situationer, det vill säga att dessa personer har svårt att hitta ord, lätt afasi och en försämrad orienteringsförmåga. När sjukdomen har gått vidare till sin andra fas försämras den kognitiva förmågan samt att svårigheter med att patienter klarar sina dagliga behov blir alltmer uppenbara (Johansson, 2007). 5

Vekningsmekanism Enligt vissa studier som gjort både in vivo och in vitro har man vissat hur galantamin och dess derivat som donepezil och rivastigmin fungerar genom att de hämmar enzymet acetylkolinesteras och samtidigt förstärker frisättning av ett väldigt viktigt protein, Amyloid Precursor Protein. Detta protein gör att mängden B-amyloid minskar så småningom i hjärnan. B-amyloid protein är länkad till acetylkolinesteras via acetykolinesteras-beta-amyloid cycle (se figur 1). Det här betyder att hos Alzheimer patienter ökar uttrycket av acetylkolinesteras enzymet, vilket ökar B-amyloid nivåer i hjärnan. Om denna process upprepas flera gångar kommer mängden B-amyloid att stiga alldeles för mycket och därmed resultera i att aktivitet och nivå av enzymet-cyklooxygenas-2 ökar i hjärnan och leder till aktivering av inflammatoriska processer Alzheimer patienter (Giacobini, 2000) FIG 1. AChE-COX-2 B-AMYLOID CYKEL HOS ALZHEIMER PATIENTER. Biosyntes Strukturen av galantamin (figur 2) tyder på att själva molekylen är en produkt som kan bildas genom en intramolekylär oxidativ process som böjar med omvandling av fenyalanin till sorbinsyre. Syren kommer sedan att bilda dihydroxybenzaldehyd efter att två kol lossnar från molekylen. Denna sista nämnda molekyl reagerar med tyrosin och leder till bildning av 4-Ometylnorbelladin. I detta steg sker en metylering reaktion. Därefter genomgår 4-Ometylnorbelladin molekylen en orto-para reaktion som resulterar formningen av dienon som via 6

en spontan reaktion reduceras till N-demetylgalantamin. Denna i sin tur N-mehyleras och därmed bildar den önskade produkten galantamin (Samuelsson, 2004). FIG 2. BIOSYNTES AV GALANTAMIN biverkningar av läkemedel innehållande Galantamin Vissa biverkningar man får vid användning av läkemedel innehållande substansen galantamin eller någon liknande kommer i början av behandlingen eller i samband med dos ökning. Dessa 7

biverkningar försvinner efter ett tag när kroppen anpassar sig till behandlingen. De vanliga biverkningarna är kräkningar, illamående, minskad aptit och dålig matsmältning. Man är oftast trött, deprimerad, har yrsel och feber. Man riskerar drabba av olika skador då man har den typen av biverkningar. Det finns andra biverkningar som patienter med Alzheimer kan få exempelvis, hjärtproblem, stroke och muskelkramper men de typerna är ovanliga och mindre förekommande. Vissa av biverkningarna dyker upp under behandlingen, medan andra kan vara på grund av sjukdom, därför det är alltid bra om Alzheimer patienter kollar upp det här med sina läkare så fort de får biverkningar (FASS, 2008). Metoder för bearbetning, extrahering och isolering Bearbetning Olika typer av växter tillhörande familjen Amaryllidaceae samlas från många olika ställen i världen mellan mars och juni under blomstringstider. Sedan transporteras växterna och bevaras under speciella tillstånd. Bearbetningsprocessen sker genom att de delar av växter som innehåller alkaloider görs till ännu mindre delar. Dessa får man torka vid 40 C tills man får en konstant vikt. Därefter görs alla delar man samlat till ett pulver med hjälp av mortel och pestil. Pulvret blandas sedan med 10ml etanol under 24 timmar för att det ska lösa upp sig innan hela blandningen läggs i ett ultraljudsbad vid rumstemperatur. Det sista man gör är en centrifugeringsprocess och sedan filtrera med hjälp av cellulosa papper innan användning av olika separationsmetoder (Lopez et al,2002). Extraktion 100 mg av blandningen filtreras och filtratet evaporeras för att etanol ska försvinna från blandningen. Resten av blandningen som innehåller de aktiva substanserna man intresserad av löses upp i 0,5 ml papaverine lösning (intern standard) och 0,150 ättiksyre. Efter omskakning och filtration kan man använda sig av de olika separationsteknikerna för att isolera den aktiva substansen (Gotti et al, 2006). Separationsmetoder High-performance liquid chromatography (HPLC): Under åren har HPLC metoden blivit en av de mest använda metoderna vid analys av olika alkaloider. Denna metod karaktäriseras av att ha en hög selektivitet och sensitivitet. Metoden 8

används mest för att undersöka olika läkemedels famakokinetik och metabolism. Det finns två faser man kan använda i denna metod. En normal fas, där den mobila fasen är opolär, medan den stationära fasen är polär. Den andra fasen består av en polär mobil fas och en opolär stationär fas. Oftast används reversed fas HPLC för separation av alkaloider från olika växter och även för kvantitativ bestämning av en substans och dess metaboliter (Novikova and Tulaganov, 2002) Vid den typen av HPLC har man en C18 kolonn. Den mobila fasen består av ammonium acetat och en blandning av buffert och acetonitril (95:5). Flödet i kolonnen brukar vara 0,2 ml/minut. Till HPLC kopplar man electrospray ionisation (ESI) som selekterar de joner man är intresserad av. Detta system får optimeras med hjälp av en referens som är i detta fall galantamin. Sedan finns det en UV detektor som detekterar våglängder av alkaloiden galantamin (Gotti et al, 2006). Det finns andra metoder som används för att separera alkaloider extraherade från växter. Gas kromatografi (GC) är en av dessa, där den mobila fasen är en gas istället för vätska. Till den metoden kan ett mass spektroskopi system kopplas, vilket gör att den kvantitativa bestämningen av alkaloider blir lättare genom att man bara bestämmer molekyl vikten av substansen man detekterar (Gotti et al, 2006). Diskussion Utvecklingen av galantamin till ett framgångsrikt läkemedel som används vid behandling av Alzheimer sjukdomar är baserad på tidiga erfarenheter, där man i östra Europa använde läkemedel innehållande galantamin för att behandla muskel förlamning hos människor. Substansen galantamin som extraheras från naturväxter spelar inte bara en roll vid behandling av Alzheimer sjukdomar, utan även den leder till fördröjning av sjukdomsförloppet så att patienters tillstånd inte förvärras lika fort som när man inte behandlas (Heinrich and Teoh, 2004). Man har visat att många växter som tillhör familjen Amaryllidaceae innehåller substansen galantamin och andra substanser också. Hos vissa av dessa växter är innehållet stort att dessa växter har fått ett stort intresse av många forskare. Dessutom har man, med hjälp av screeningsmetoder kunnat påvisa att alkaloiden extraherad från dessa galantaminrika växter ansvarar för den inhibitoriska effekten man får (Lopez et al,2002). 9

I vissa studier som gjorts på patienter med Alzheimer sjukdom har man visat att hos denna typ av patienter sker en stegvis förlust av nikotin receptorer. Detta anses vara kopplat till den nedsatta kognitiva förmågan och uppmärksamheten. Man har även sett att tillförseln av galantamin leder till modulering av nikotinreceptorerna i prefrontala cortex, vilket ökar frisättning av viktiga substanser som serotonin, glutamat och dopamin. Det här i sin tur gör att den kognitiva förmågan och koncentrationen förbättras samt att det sker en viss lindring av aggression och depression hos dessa patienter. Alltså modulering av de presynaptiska nikotin- acetylkolin receptorerna aktiverar inte bara det kolinergika systemet, utan också det anti-kolinergika systemet som är helt nedsatt hos Alzheimer patienter. (Thavichachart, 2006). Olika separations metoder används för att separera den substans man är intresserad av. Den mest använda metoden är HPLC. Den använder man för att kvantitativ bestämning av galantamin eller andra alkaloider. Dessutom kan man använda andra system som gas kromatografi och kapillär elektrofores för att isolera galantamin från en blandning med andra alkaloider. Dessa tekniker har faktiskt blivit mer populära på senare tid, därför man försöker nuförtiden utveckla de för att själva isoleringsprocessen blir snabbare och mer effektiv (Lopez et al,2002). 10

Referenser Berkov S., Bastida J., Viladomat F and Codina C. Analysis of Galanthamine-type Alkaloids by Capillary Gas Chromatography Mass Spectrometry in Plants. Phytochemical Analysis. 2008 ( under press). Giacobini E. Cholinesterase Inhibitors Stabilize Alzheimer Disease. Neurochmical research. 2000, 25: 1185-1190. Gotti R., Fiori J., Bartolini M and Cavrini V. Analysis of Amaryllidaceae alkaloids from Narcissus by GC MS and capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2006, 42: 17-24. Harvy A L. Tha pharmacology of galanthamine and its analogues. Pharmacology and therapeutics. 1995, 69: 113-128. Heinrich M., Teoh H L. Galanthamine from snowdrop the development of a modern drug against Alzheimer s disease from local Caucasian knowledge. Journal of Ethnopharmacology. 2004, 92: 147-192. Johansson L. Substanser och metoder alltid förbjudna vid så vältävling som träning. Läkemedelsboken. 2007/2008: 860-866. Lopez S., Bastida J., Viladomat F and Codina C. Galanthamine pattern in Narcissus confusus plants. Planta medica, 2003, 69: 1166-1168. Lopez S., Bastida J., Viladomat F and Codina C. Acetylcholinesterase inhibitory activity of some Amaryllidaceae alkaloids and Narcissus extracts.life science. 2002, 71: 2521-2529. Novikova Y and Tulaganov A A. Physicochemical methods for the analysis of galanthamine. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2002, 36: 44-48. 11

Samuelsson G. Drug of natural origin. Farmakognosi boken, 5 th edition, 530-531. Thavichachart N., Phanthumchinda K., Chankrachang S., Praditsuwan R., Nidhinandana S., Senanarong V and Poungvarin N. Efficacy study of galantamine in possible Alzheimer s disease with or without cerebrovascular disease and vascular dementia in Thai patients: a slow-titration regimen. International Journal of Clinical Practice. 2006, 60: 533-540. www.fass.se: http://www.fass.se/lif/produktfakta/artikel_produkt.jsp?nplid=20040213000026&doctypei D=7&UserTypeID=2, 2008-05-16, kl 10:40. 12