2012-07-04 Genetisk analys av Klarälvslax från Forshaga avelsfiske 2011 Stefan Palm & Tore Prestegaard Sötvattenslaboratoriet, Drottningholm, Institutionen för akvatiska resurser, SLU Inledning I Klarälven finns en av världens få insjölevande och storvuxna populationer av Atlantisk lax (Salmo salar). I historisk tid utgjorde sannolikt Klarälven ett av Sveriges mer produktiva laxvattendrag. Vattenkraftsutbyggnad och andra mänskliga aktiviteter har dock kraftigt påverkat vattendragets vandrande fiskarter, och sedan 1930-talet är den naturliga produktionen av lax i Klarälven helt beroende av att man med lastbil transporterat lekfisk förbi kraftverken i älvens nedre del. Sedan åtskilliga decennier sker även odling och utsättning av lax och öring av lokal stam i vattendragets nedre del. Sedan 1960/70-talen sker dessutom utsättning av odlad Gullspångslax och Gullspångsöring i Klarälven. En nyligen genomförd genetisk kartläggning av lax och öring från Vänern (Palm et al. 2012) har visat att Klarälvens laxfiskbestånd är att betrakta som genetiskt unika och skyddsvärda, trots årtionden av mänsklig påverkan i form av bland annat avsiktliga och oavsiktliga korsningar med de odlade stammarna från Gullspångsälven. För att långsiktigt skydda och bevara Klarälvens lax och sjövandrande öring samt de odlade Gullspångsstammarna rekommenderades att flytta de senare till annat vattendrag samt att avstå från upptransport av odlad fisk i Klarälven. Det rekommenderades också att med genetisk metodik närmare utvärdera den "säkerhetsgräns" som sedan länge använts i Forshaga och som innebär att ingen Klarälvslax (odlad eller vild) med en vikt över 5,5 kg används för avel eller vidare transport upp till lekområdena i älven. Syftet med denna regel är att minska risken för att lax av den mer storvuxna Gullspångsstammen (inkl. stamhybrider) av misstag ska feltolkas som K-lax. Samtidigt har genetiska analyser av Klarälvslax fångad ute i Vänern under senare år visat att omkring 20% av individerna i denna - 1 -
stam kan överstiga 5,5 kg (Palm et al. 2012). Att systematiskt sortera bort de mest storvuxna fiskarna innebär sannolikt ett betydande produktionsbortfall. Som exempel kan nämnas att säkerhetsgränsen för K-lax under säsongen 2011 resulterade i att man avstod från omkring 25% av honorna i vikt räknat (beräknat utifrån data erhållna från Marco Blixt, Fortum AB). I föreliggande genetiska delprojekt (Dnr 582-2700-2011) med finansiering inom pågående InterReg Sverige-Norgeprojektet "Vänerlaxens fria gång" har följande frågeställningar stått i fokus: Förekommer inslag av Gullspångslax (inkl. stamhybrider) bland den fenklippta samt oklippta, förmodat vildfödda, Klarälvslax som fångades och provtogs i Forshaga avelsfiske sommaren 2011? Hur stort inslag av "Gullspångsgener" föreligger bland individer understigande resp. överstigande 5,5 kg, den säkerhetsgräns som sedan lång tid tillämpas vid urval av lax för avel samt transport vidare upp i Klarälven? Material och metoder Fångststatistik och DNA-provtagning Under säsongen 2011 fångades totalt 1 177 laxar i Forshaga laxfälla vilka genom sitt fenklippningsmönster eller avsaknad av fenklippning bedömdes vara odlad respektive vildfödd lax av Klarälvsstam. Av de fångade Klarälvslaxarna hade 1 032 st. (88%) fettfenan kvar vilket tolkas som att de är vildfödda (data från Fortum AB). Provtagning för genetisk analys genomfördes vid sammanlagt 16 tillfällen under perioden 7 juli till 4 oktober. Ett mindre fenklipp för genetisk analys togs från sammanlagt 991 individer. Att inte all lax provtogs beror dels på att ett antal individer var alltför svårhanterliga för att medge snabb och enkel provtagning, samt att inga fenprov togs från det drygt hundratal fiskar som under slutet av säsongen reserverades för kommande avelsarbete. Inledningsvis noterades av misstag inte uppgifter om fenklippning eller kön vid genprovtagningen, varför sammanlagt 117 av de DNA-provtagna fiskarna saknar sådana data. Av de övriga 874 provtagna fiskarna hade 751 (86%) fettfenan kvar. En av de oklippta fiskarna ansågs vid provtagningen vara svårbedömd, och noterades som misstänkt arthybrid med öring (s.k. "laxing"). I ett senare skede visade sig 20 av de DNA-provtagna laxarna av okänd anledning sakna fenprov (tomma provrör) och sammanlagt har genetiska rådata erhållits för 970 individer vilket motsvarar 91% av de totalt 1 070 K-laxar som enligt Fortum AB transporterades upp i älven under 2011. - 2 -
Utöver dessa 970 laxar har även 22 döda individer provtagits. Dessa fiskar dog antingen i samband med fångst och mätning, eller senare under förvaring i väntan på transport vidare upp i Klarälven. Syftet med provtagningen av döda individer var att identifiera matchande genotyper hos tidigare provtagna (då levande) fiskar, för att senare kunna utesluta dessa individer vid kommande föräldraskapsanalyser av vildfödd avkomma till den lax som transporterades upp i Klarälven (analys av elfiskade årsyngel är planerad till hösten 2012). Genetiska och statistiska analyser Samma uppsättning av genetiska markörer (nio s.k. mikrosatelliter) som i studien av Palm et al. (2012) har analyserats. De statistiska metoder och program som använts är namngivna nedan i samband med resultatpresentationen. Vid databearbetningen har tidigare insamlade genetiska data för odlad och vild lax och öring i Klarälven (inkl. Gullspångsstammarna) i flera fall använts som referensprov. Resultat Öringar och arthybrider Av de 970 fiskar som DNA-analyserades (exklusive döda/återprovtagna) visade sig tre individer vara öring, medan tre andra fiskar var arthybrider mellan lax och öring (inklusive den fisk som redan vid provtagningen misstänktes vara en "laxing"). Samtliga tre öringar fångades och provtogs under säsongens första provtagningstillfälle (7 juli) och saknade därför uppgift om kön och eventuell fenklippning. Två av öringarna kunde, tack vare att tre av de nio analyserade mikrosatelliterna även används rutinmässigt vid genetiska studier av öring, med relativt hög sannolikhet klassas som rena Klarälvsöringar, medan den tredje fisken antingen var en odlad Gullspångsöring eller en stamhybrid mellan Gullspångs- och Klarälvsöring (ursprungsanalyser med programmen GENECLASS 2.0, Piry et al. 2004, samt ONCOR, Kalinowski et al. 2007). Av de tre arthybriderna var två oklippta medan en var fettfeneklippt. Åtminstone två av hybriderna (den fettfeneklippta och en oklippt) hade med hög sannolikhet en Gullspångsöring som förälder (99 resp. 84% sannolikhet). Vad gäller lax var stamursprunget hos föräldern mer oklart; för den fettfeneklippta hybriden var laxföräldern mest sannolikt av Gullspångsstam (71% sannolikhet), medan den ena oklippta fisken mest sannolikt hade avlats av en K-lax (75%). I det tredje fallet var laxförälderns ursprung oklart (51% G-lax, 49% K-lax). Genetiska skillnader mellan olika grupper av laxar I likhet med i tidigare analyser (Palm et al. 2012) gav en jämförelse av allelfrekvenserna hos oklippta (n=737) och fenklippta (n=120) laxar endast en marginell om än statistisk signifikant skillnad (genomsnittligt F ST över samtliga 10 loci var 0.002; P<0.001; randomiseringstest med - 3 -
FSTAT, Goudet 1995). Även en jämförelse mellan samtliga storvuxna (>5,5 kg) och mindre individer visade på en mycket liten (F ST <0.001) men statistiskt säkerställd genetisk skillnad. Inslag av "gullspångsgener" hos förmodad Klarälvslax För att analysera inslag av Gullspångslax enskilda rena fiskar (t.ex. genom missad bukfeneklippning) eller korsningar med K-lax (F 1 -hybrider) bland de återstående 964 förmodade Klarälvslaxarna jämfördes dessa med tidigare erhållna data för Gullspångs- och Klarälvslax (Palm et al. 2012). I ett första steg sammanställdes en s.k. genetisk "baseline" (referensprov) bestående av data för odlad vuxen Gullspångslax insamlad i Forshaga 2009 (n=40) samt odlade och vildfödda Klarälvslaxar från 2007 och 2009 (n=133). Eftersom odlad och vildfödd K-lax är genetiskt mycket lika slogs dessa samman till ett gemensamt stickprov. Utöver dessa data för riktig lax framställdes även 40 datorsimulerade hybridavkommor (F 1 ) mellan Gullspångs- och Klarälvslax (programmet HYBRIDLAB, Nielsen et al. 2006). Två skilda statistiska metoder användes för att skatta inslaget av lax med olika genetisk bakgrund. Med den första metoden (programmet NEWHYBRIDS; Anderson & Thompson 2002) beräknades, med hjälp av ovan nämnda bakgrundsdata för Gullspångs- och Klarälvslax (men ej F 1 ), sannolikheten att de 964 laxar som provtogs i Forshaga 2011 genetiskt sett var rena G-laxar, stamhybrider (F 1 ) eller K-laxar. Även med den andra metoden uppskattades andelen av samma tre grupper med hjälp av s.k. Mixed Stock Analys (MSA) och programmet ONCOR baserat på baseline-data för de rena stammarna samt de datorsimulerade stamhybriderna. Den senare metoden ger även 95% konfidensintervall för de erhållna skattningarna. Andelen ren Klarälvslax i totalmaterialet skattades till 97% (NEWHYBRIDS) respektive 98% (ONCOR), medan övriga 2-3% av individerna utgjordes huvudsakligen av stamhybrider med Gullspångslax (F 1 ; Tabell 1). Ett högre inslag av främmande genotyper (hybrider och ren G-lax) skattades för stora individer (>5,5 kg) med båda metoderna (4,3% respektive 4,1% bland stora fiskar, jämfört med 2,6% resp. 1,4% bland mindre). En motsvarande skillnad erhölls även mellan odlad/fenklippt och vildfödd/oklippt fisk, där inslaget av hybrider (och ren G-lax) skattades högre bland den odlade fisken (4,7% resp. 8,8%) än bland den oklippta (2,7% resp. 1,3%). Osäkerheten i MSA-skattningarna med ONCOR (breda konfidensintervall) återspeglar att de använda "baseline-stickproven" är relativt små, att antalet studerade DNA-markörer är begränsat samt att graden av genetisk skillnad mellan dagens (odlade) Gullspångslax och Klarälvslax inte är tillräckligt omfattande (F ST ca 0.10-0.13; Palm et al. 2012) för att med hög precision kunna ursprungsbestämma samtliga individer (inkl. intermediära F 1 -genotyper). Det ska dock betonas att konfidensintervallen illustrerar osäkerheten avseende skattningar för statistiska populationer som studeras med hjälp av stickprov av begränsad storlek. I detta fall ligger dock intresset till stor del på de analyserade stickproven i sig (d.v.s. den lax som fångats i Forshaga), vilket innebär att konfidensintervallen i flera fall förmedlar en betydligt högre grad av osäkerhet än befogat. - 4 -
Stamtillhörighet hos enskilda laxar Med ONCOR och NEWHYBRIDS beräknas även sannolikheten att enskilda individer har en viss stamtillhörighet (här G-lax, K-lax eller F 1 -hybrid) s.k. individual assignment (IA). Enligt ONCOR var nio fiskar (0,9%) med högst sannolikhet en F 1 -hybrid, medan övriga fiskar mest sannolikt var rena K-laxar. Av de nio utpekade fiskarna hade dock endast fem en sannolikhet högre än 85% att vara en F 1 -hybrid, medan övriga var mer osäkra (sannolikhet att vara F 1 -hybrid mellan 48-62%). NEWHYBRIDS pekade ut elva av individerna (1,1%) som avvikande från ren K-lax (nio st. F 1 hybrider och två st. G-laxar). Bland de elva fiskarna ingick sex av de laxar som enligt ONCOR var F 1 -hybrider. Sammantaget identifierades totalt 14 individer (1,5%) som varande mest sannolikt en F 1 hybrid eller G-lax av något eller båda programmen. Med ONCOR kan datorsimuleringar genomföras för att belysa hur stor andel av enskilda individer med olika genetisk bakgrund som vid individual assignment förväntas få en korrekt respektive felaktig stambestämning, samt i vilken riktning som eventuella felklassningar sker. Vid analysen används samma baseline-stickprov som vid MSA och IA. Man måste vidare ange den sanna proportionen av de olika stammarna i den individblandning som analyseras, då dessa andelar påverkar resultatet. En simuleringsanalys genomfördes under antagande att de sanna andelarna av fisk från de olika stammarna var desamma som resultatet vid MSA av totalmaterialet (0.001 G-lax, 0.019 F 1, 0.980 K-lax; Tabell 1). Sammanlagt simulerades 100 stickprov av samma storlek som totalmaterialet (n=964), vilket resulterade i totalt 96 400 stambestämda individer. Av de simulerade K-laxarna klassades 99,5% korrekt, medan övriga 0,5% klassades (felaktigt) som F 1 hybrider. Bland de simulerade sanna F 1 hybriderna klassades däremot endast 38% korrekt, medan övriga felaktigt klassades antingen som K-lax (52%) eller G-lax (10%). En alternativ simuleringsanalys genomfördes också under antagande att sanna andelen K-lax i materialet var 100%. I detta fall felklassades endast ca 0,1% av individerna felaktigt till F 1 hybrider. Om alla individer i totalmaterialet skulle vara rena K-laxar borde man således endast ha förväntat sig någon enstaka F 1 hybrid (felklassad K-lax) vid IA, mot nu erhållna nio sådana fiskar. Sammantaget antyder simuleringsresultaten dels att det verkligen förekommer F 1 hybrider (eller G-lax) i det analyserade materialet från Forshaga-2011, samt att man vid IA med ONCOR kan förvänta sig en underskattning av sanna andelen F 1 hybrider, om/när sådana förekommer i låg frekvens. Sammantaget framstår dock möjligheterna att på individnivå bestämma stamtillhörighet som begränsade. För säkrare identifieringar skulle i första hand sannolikt krävas analys av fler genmarkörer. - 5 -
Diskussion Bland den förmodade Klarävslaxen från Forshaga-2011 finns ett inslag (ca 2-3%) av korsningar med Gullspångslax, samt möjligen även enstaka rena G-laxar. De exakta andelarna av genetiskt avvikande fiskar är osäkra och varierande beroende på vilken statistisk skattningsmetod som använts. Genomgående finns dock en tendens till ett större inslag av F1-hybrider (och G-lax) hos större fiskar (>5,5 kg) än hos mindre, vilket är i linje med G-laxens snabbare tillväxt och större storlek som vuxen (och smolt). Det finns även en tendens till högre andel "Gullspångsgener" bland fettfeneklippta/odlade fiskar än hos oklippta/vildfödda, vilket gäller såväl större som mindre laxar. Noterbart är vidare att inslaget av Gullspångsgener hos den analyserade laxen från Forshaga-2011 är av samma storleksordning som det genomsnittliga genflöde per generation från Gullspångs- till Klarälvslax (1-3%) som tidigare skattats baserat på annan genetisk information av Palm et al. (2012). Det tycks således finnas visst fog för den säkerhetsgräns för K-lax som länge tillämpats vid Forshaga avelsfiske. Förekomsten av Gullspångsgener bland såväl vildfödd som odlad fisk även under 5,5 kg indikerar samtidigt att denna gräns inte utgör en tillräcklig åtgärd för att undvika fortsatt genetisk påverkan. För detta krävs sannolikt att den kompensationsodlade stammen av Gullspångslax (och -öring) flyttas från Klarälven till annat vattendrag. Den högre andelen Gullspångsgener bland fenklippt lax utgör ytterligare ett skäl till att undvika transport upp i Klarälven av odlad fisk. Andra anledningar som tidigare anförts till att avstå från odlad fisk för upptransport är att denna är uppvuxen under förhållanden som kraftigt skiljer sig från de naturliga och dessutom härstammar från ett lägre antal föräldrafiskar (Palm et al. 2012). Uppflyttad odlad Klarälvslax tycks också uppvisa ett avvikande lekvandringsbeteende jämfört med vild K-lax (Anna Hagelin, Karlstads universitet, pers. komm.), och det kan ifrågasättas i vilken grad odlad fisk bidrar till reproduktionen i älven. Att tillåta upptransport av större vildfödda Klarälvslaxar (>5,5 kg) skulle, av allt att döma, innebära ett något större tillskott av Gullspångsgener till det vilda lekbeståndet än vid transport av enbart mindre fisk. Samtidigt skulle dessa stora fiskar sannolikt ge en tämligen kraftigt ökad naturlig laxproduktion i Klarälven. I sammanhanget bör också nämnas att någon total genetisk isolering av Klarälvens laxbestånd inte framstår som önskvärd. Under naturliga och opåverkade förhållanden förekommer ett begränsat genutbyte mellan lokala laxstammar tack vare "felvandring", vilket motverkar inavel och långsiktig förlust av genetisk variation. Hur stort detta naturliga genflöde till Klarälvens laxbestånd från andra laxstammar i Vänern ursprungligen varit är emellertid oklart. - 6 -
Tabell 1. Resultat vid ursprungsbestämning av 964 förmodade (vildfödda och odlade) Klarälvslaxar fångade i Forshaga avelsfiske 2011 (G-lax = odlad Gullspångslax, K-lax = odlad/vildfödd Klarälvslax, F 1 -hybrid = korsning i första generationen mellan Gullspångs- och Klarälvslax). Två olika statistiska metoder har använts (programmen NEWHYBRIDS samt ONCOR). De sistnämnda skattningarna ges med 95% konfidensintervall. Notera att uppgift om fenklippning saknas för en andel av fisken i totalmaterialet. NewHybrids MSA/Oncor (95% CI) n G-lax F1-hybrid K-lax G-lax F1-hybrid K-lax Stor fisk (> 5,5 kg) Fenklippt 26 0.011 0.055 0.934 0.038 (0.000 -- 0.124) 0.107 (0.000 -- 0.351) 0.855 (0.615 -- 1.000) Oklippt/vildfödd 153 0.005 0.030 0.965 0.000 (0.000 -- 0.023) 0.027 (0.000 -- 0.115) 0.973 (0.883 -- 1.000) Uppgift saknas 18 0.007 0.072 0.921 0.000 (0.000 -- 0.166) 0.083 (0.000 -- 0.360) 0.917 (0.633 -- 1.000) All stor fisk 197 0.006 0.037 0.957 0.008 (0.000 -- 0.032) 0.033 (0.000 -- 0.137) 0.958 (0.857 -- 0.990) Mindre fisk ( 5,5 kg) Fenklippt 94 0.008 0.033 0.959 0.000 (0.000 -- 0.036) 0.074 (0.000 -- 0.212) 0.926 (0.786 -- 1.000) Oklippt/vildfödd 584 0.002 0.023 0.975 0.000 (0.000 -- 0.007) 0.008 (0.000 -- 0.065) 0.992 (0.935 -- 1.000) Uppgift saknas 88 0.000 0.023 0.976 0.000 (0.000 -- 0.001) 0.000 (0.000 -- 0.113) 1.000 (0.887 -- 1.000) All mindre fisk 766 0.002 0.024 0.973 0.000 (0.000 -- 0.006) 0.014 (0.000 -- 0.075) 0.986 (0.925 -- 0.997) Fenklippt fisk All fenklippt fisk 120 0.009 0.038 0.954 0.010 (0.000 -- 0.043) 0.078 (0.000 -- 0.216) 0.913 (0.776 -- 0.991) Oklippt fisk All oklippt fisk 737 0.003 0.024 0.973 0.000 (0.000 -- 0.008) 0.013 (0.000 -- 0.066) 0.987 (0.933 -- 0.997) All fisk 964 0.003 0.027 0.970 0.001 (0.000 -- 0.009) 0.019 (0.005 -- 0.081) 0.980 (0.918 -- 0.992) - 7 -
Erkännanden Johan Dannewitz (SLU-Aqua) har läst och kommenterat en tidigare version av denna rapport. Tack till Richard Gow och Anna Hagelin (Lst Värmland och Karlstads universitet) samt Klas Jarmuzewski med medarbetare (Fortum AB) för provtagning av lax i Forshaga. Tack också till Marco Blixt (Fortum AB) som bidragit med fångststatistik. Studien har genomförts av SLU- Aqua på uppdrag av Länsstyrelsen Värmland, i samråd med Fylkesmannen i Hedmark, med finanisering inom Interregprojektet "Vänerlaxens fria gång". Referenser Anderson EC, Thompson EA (2002) A model-based method for identifying species hybrids using multilocus genetic data. Genetics 160:1217 1229. Goudet J (1995) FSTAT (vers. 1.2): a computer program to calculate F-statistics. Journal of Heredity 86:485 486. Kalinowski, ST, Manlove KR, Taper M (2007) ONCOR: a computer program for genetic stock identification. Montana State University. Nielsen EE, Bach LA, Kotlicki P (2006) HYBRIDLAB (version 1.0): a program for generating simulated hybrids from population samples. Molecular Ecology Notes 6:971 973. Palm S, Dannewitz J, Johansson D, Laursen F, Norrgård J, Prestegaard T, Sandström A (2012) Populationsgenetisk kartläggning av Vänerlax. Aqua reports 2012:4. Sveriges lantbruksuniversitet, Drottningholm. 64s. Piry S, Alapetite A, Cornuet JM, Paetkau D, Baudouin L, Estoup A (2004) GENECLASS2: A Software for genetic assignment and first-generation migrant detection. Journal of Heredity 95:536 539. - 8 -