Genetisk variation hos harr i Kvarken. Jan Nilsson & Anders Alanärä

Transkript

1 Genetisk variation hos harr i Kvarken Jan Nilsson & Anders Alanärä Vattenbruksinstitutionen Rapport 54 Umeå 2006

2 Projekt Kvarkenharr har fått stöd av INTERREG KVARKEN-MITTSKANDIA Västra Finlands Miljöcentral Länsstyrelsen Västerbotten Genetisk variation hos harr i Kvarken Jan Nilsson & Anders Alanärä SLU Vattenbruksinstitutionen Umeå Tel Fax E-post. vabr@slu.se Hemsida. Rapport nr 54, ISSN ISRN SLU-VBI-R--54 SE 2

3 SAMMANFATTNING Kvarkenområdets harr undersöktes populationsgenetiskt i syfte att skapa ett kunskapsunderlag för skötsel av bestånden. Prover för analys insamlades från övre och nedre delar i älvar som mynnar i området och från områden i havet som antogs kunna ha lekande bestånd samt från två finska älvar. Analyserna som genomfördes med hjälp av DNA markörer, mitokondrie DNA och 7 nukleära mikrosatelliter, visade att de övre delarna av älvarna på svenska sidan utgörs av starkt diversifierade bestånd av västlig invandringslinje. De nedersta delarna av älvar på svenska sidan bestod av bestånd som är en blandning av östlig och västlig invandring, men även mellan bestånden inom denna grupp fanns tydliga skillnader. I havet på svenska sidan (Holmön, Norrbyskär) dominerade den östliga invandringslinjen och på finska sidan erhölls enbart den östliga linjen. Vid åtgärder som kan påverka beståndens sammansättning bör hänsyn tas framförallt till historiska invandringsvägar, men även till förekomsten av differentierade lokala bestånd. Studien var ett delprojekt i Kvarkenharr, ett Interreg IIIA Kvarken- Mittskandia projekt. INLEDNING För många arter med delbestånd som förekommer i geografiskt avgränsade miljöer utgör delbeståndens genetiska sammansättning en viktig komponent som måste tas i beaktande i samband med åtgärder som påverkar bestånden och i synnerhet när spridning mellan delbestånden kan uppstå. Harr och andra laxartade fiskar är dokumenterade representanter för sådana arter. Det är därför av stor vikt att kartlägga hur den genetiska variationen fördelar sig geografiskt d v s undersöka om lokala bestånd är olika varandra och om det finns andra indelningar av betydelse till exempel som en följd av invandringshistorien efter istiden. I fisksammanhang har utsättningar som inkluderat förflyttningar av ägg och yngel mellan olika vatten förekommit i stor utsträckning. Om en sådan åtgärd kommer till stånd för harr inom Kvarkenområdet är det synnerligen viktigt att man gör avväganden mellan utsättningsmaterialets ursprung och den lokal där dessa ska sättas ut. Risken är att om man inte gör överväganden baserade på kunskap om de genetiska förhållandena mellan bestånden skapas ett ickenaturligt genflöde som påverkar den populationssammansättning som utvecklats i detta område efter inlandsisens försvinnande. En dåligt genomtänkt åtgärd medför, förutom att vara oacceptabel ur bevarandesynpunkt, även sannolikt att utsikterna till framgång minskas. Denna genetiska studie av harr har genomförts för att kartlägga relationer mellan lokala bestånd inom ett geografiskt område (Kvarken) som i tidigare arbeten (Koskinen m fl. 2000, 2002) framstått som en zon där olika invandringsvägar möts. Avsikten har varit att ta fram ett underlag som kan användas vid utformning av åtgärder för att förbättra beståndens utveckling. 3

4 MATERIAL OCH METODER Provinsamling Prover för DNA analys av harrbestånd insamlades från de övre delarna av Lögdeälv, Öreälv och Sävarån (Figur 1). Lokalen i Lögdeälvens övre del är belägen uppströms ett vandringshinder ( Fällforsen). I Sävaråns övre del är lokalen belägen uppströms tidigare existerande men numera rivna vandringshinder. Kustnära prover från älvar togs i de nedersta forsarna i Lögdeälv, Öreälv, Sävarån och Rickleån. Havsfångad harr representerades av harr från Norrbyskärsområdet (Husskär och Pilhällan), Tavastögern, Holmön och Valsörarna. Proven från Holmön består dels av adulter från nätfisken och dels av nykläckta yngel fångade i strandzonen. Harr från två åar från den finska sidan (Siiponjoki, Olkijoki) har också inkluderats (Figur 1). Prover har tagits i form av en fenbit som frusits eller placerats i alkohol och sedan transporterats till Vattenbruksinstitutionen, SLU för analys. Totalt har 570 DNA prover från 14 lokaler/bestånd analyserats. Holmön Norrbyns Skärgård Valsörarna Figur 1. Karta över Kvarkenregionen visande provfiskelokaler för genetisk provtagning. Svarta prickar visar ungefärliga platser för provtagning. DNA analyser Analyser har genomförts av variation i mitokondriellt DNA (mtdna) och för 7 DNA mikrosatelliter: B12, B13, B15, B17, B18, Ogo2, One2 (Koskinen m fl ). Analyser av mtdna gjordes genom PCRamplifiering av ND 5/6 genen följt av klippning med restriktionsenzymet HINF1. De fragment som erhölls efter klippning visualiserades med hjälp av agarosgel och bandmönster noterades. Denna metod visar på tillhörighet till västlig eller östlig mitokondriell linje (se Koskinen & Primmer 2001) 4

5 beroende av erhållet bandmönster. Till skillnad från vanliga nukleära DNA markörer som exempelvis mikrosatelliter nedärvs mtdna enbart maternellt. Variation i mikrosatelliterna analyserades genom PCR amplifiering och analys av fragmentstorlek i en automatisk DNA sekvenserare (Beckman CEQ800). Statistiska analyser För analys av antal alleler per locus, variationsnivå (observerad och förväntad heterozygotigrad) och kopplingsojämvikt användes programmet PopGen. För analys av parvisa Fst användes Genepop3.2a. Fst värden är mått på genetisk likhet mellan populationer, värden mellan kan klassificeras som svag differentiering, värden mellan som måttlig differentiering och värden > 0.15 anger stark differentiering. Genetiska relationer mellan stammar visualiserades med hjälp av dendrogram (UPGMA) baserat på Nei s genetiska distans. Ett annat sätt att tydliggöra relationer mellan bestånd är en Principal Coordinates Analysis (PCA) som här utfördes med hjälp av programmet GenALEx och baserades på kovariansmatrisen av Nei s genetiska distans. För analys av genetisk struktur användes analysprogrammet AMOVA i Arlequin. AMOVA beräknar den relativa fördelningen av genetisk variation på olika hierarkiska nivåer (inom respektive mellan populationer samt mellan grupper av populationer). Vid denna analys gjordes a priori indelningar i grupper baserade på geografiskt läge för respektive provsamling. Analys av stamtillhörighet för individer (assignment) gjordes med hjälp av MSABayes. I denna analys testas enskilda individers genotypuppsättning mot referensvärden för kända populationer och individens sannolikhet att tillhöra en bestämd population beräknas. Programmet anger i procent hur ofta en viss individ i en rad upprepade tester har hänförts till någon av populationerna. Här sattes en gräns på 50%, dvs individer som i 50% eller mer angetts tillhöra en viss population har förts till denna. Individer som inte nådde 50% för någon population betraktades som oplacerade. RESULTAT Mitokondrievariation Fördelningen av variationen i den mitokondriella ND5/6 genen visas i Figur 2. I de svenska älvarnas övre delar återfinns enbart den västliga varianten. I älvarnas nedre delar förekommer både den östliga och den västliga varianten. För harrar i havet på den svenska sidan dominerar den östliga varianten. Misslyckade försök att finna leklokaler och yngel tyder på att Tavastögern inte är en egen population utan består av harr som sökt sig till havet från någon älv, sannolikt den närliggande Sävarån. Holmöns yngel är den enda egentliga havslokalen som har en hög andel av den västliga varianten och den avviker därigenom från Holmöns adulter som hade en låg frekvens västlig mtdna typ. Skillnaden beror sannolikt på lokal variation inom Holmön. Då adulter insamlats under längre tid och över ett geografiskt större områden än ynglen kan det vara rimligt att anta att adulterna bättre än ynglen avspeglar Holmöharrens sammansättning av mtdna 5

6 variation. Noterbart är att endast den östliga varianten återfanns bland harrar från Norrbyskär trots närheten till de nedre delarna av Öreälv. På den finska sidan erhölls enbart den östliga varianten. Figur 2. Variation för mtdna ND5/6 hos harr. Svart representerar andel västlig haplotyp, grått den östliga. Första raden består av bestånd i svenska älvars övre del, andra raden älvarnas nedersta del, tredje raden utgörs av samlingar från svenska kusten, tredje raden utgörs av prov från finska bestånd. Frekvenser anges i Figur 2. Resultaten tyder på att den från öster invandrande harren till viss del har påverkat harren i de nedre delarna av älvarna men inte har kunnat spridas till de övre delarna. Vandringshinder som uppstått som en följd av landhöjningen kan vara en delförklaring men åtminstone vad gäller Öreälven förefaller detta inte kunna förklara avsaknaden av den östliga varianten i dess övre del då inga vandringshinder förekommer mellan den övre och den nedre insamlingslokalen i denna älv. Resultaten från havet på den svenska sidan visar att den västliga varianten i någon mån har lyckats sprida sig till havsområdet. 6

7 Variation i DNA-mikrosatelliter Variationsnivån (He) var lägst i de övre delarna av de svenska vattendragen med ett medelvärde av och med extremt låg variation i övre Sävarån (Tabell 1). Kustnära bestånd samt havspopulationer visade klart högre nivåer (>0.58). En likartad observation gjordes för antalet alleler där det lägsta värdena erhölls för de övre sträckorna. Avvikelser mellan förväntad och observerad heterozygoti var mest markant för Sävaråns övre del och beror på ett överskott av homozygota individer. Denna population har en i övrigt från andra populationer avvikande sammansättning och visar tecken på förlust av variation, troligen som en följd av liten beståndsstorlek och isolering. Även de övre bestånden i Lögde- och Öreälv visade tendenser till homozygotöverskott, möjligen kan flera lokala genetiskt skilda små bestånd ingå i våra prover från dessa lokaler. Tabell 1. Genetiska parametrar för harrbestånd. N antal individer från respektive lokal, obs het = observerad genomsnittlig heterozygotigrad, förv. Het = förväntad genomsnittlig heterozygotigrad. A = genomsnittligt antal alleler per markör. Population: n obs het förv. het A Holmön adulter Holmö yngel Lögde nedre Lögde övre Norrby Öre nedre Öre övre Rickleå Säv nedre Säv övre Tavast Valsörarna Olkijoki Siiponjoki Genetiskt avstånd mätt som parvisa Fst värden var i de flesta fall höga (tabell 2). Framförallt visar de övre delarna av Lögdeälv, Öreälv och i synnerhet Sävarån mycket höga värden i alla parvisa jämförelser med varandra och med harr från andra älvar och havet (>0.15). Mellan älvarnas nedre delar (inklusive Rickleån) är Fst värdena mer måttliga ( ). Holmöpopulationen (adulter) visar måttlig differentiering mot de nedre sträckorna i de svenska åarna ( ) och på gränsen till svag differentiering mot de finska (0.05). I jämförelse med adulter visar yngel från Holmön generellt en högre grad av differentiering mot alla kategorier av annan harr och skiljer sig, om än svagt, även mot adulter från Holmön (0.04). De finska åarnas harr är minst differentierade mot Holmöharren och som väntat mer skilda från harren i de övre delarna av åarna på den svenska sidan (>0.23) jämfört med de nedre (<0.15). Inom åar visar Öre den svagaste differentieringen och Sävarån den starkaste. Samtliga parvisa 7

8 populationsjämförelser utom två var statistiskt signifikanta efter korrigering för antal tester. De två undantagen var Norrbyn-Tavastögern och Sävar nedre-tavastögern. Lågt antal individer från Tavastögern och Norrbyn samt att Tavastögern inkluderade individer från Sävarån är troliga förklaringar. Tabell 2. Parvisa Fst-värden mellan harrpopulationer. Holmön Lögde nedre Lögde övre Norrby Öre nedre Öre övre Rickleån Sävar nedre Sävar övre Tavastögern Valsörarna Olkijoki Siiponjoki Lögde n Lögde ö Norrby Öre n Öre ö Rickleån Sävar n Sävar ö Tavast Valsör Olkij Siiponj Holmö y I dendrogrammet (Figur 2) baserat på DNA mikrosatellitvariation kan tre grupperingar urskiljas. Holmöharr, harr från finska sidan samt harr från Norrbyskärsområdet bildar en grupp som även karakteriseras av hög frekvens av den östliga mitokondrievarianten. En annan grupp består av harr från älvars nedre delar samt Tavasten och har en intermediär frekvens av östlig mitokondrievariant. Den tredje gruppen består av Öre nedre och övre samt Lögde övre där de två övre lokalerna helt saknar den östliga varianten. Sävarån övre avviker från alla populationer men i likhet med andra övre bestånd saknas den östliga mitokondrievarianten. Med två undantag (Öre nedre samt Holmö juveniler) ger de olika markörtyperna (mtdna resp. mikrosatelliter) samma huvudindelning: en grupp bestående av harr från de övre delarna, en andra grupp som finns representerade i älvarnas nedre delar samt i kustzonen och en tredje grupp av harr från havet och den finska sidan. Det förefaller rimligt att föreslå att harren i de nedre delarna och i kustzonen (som kan vara harr som hör till älvarnas nedre del) utgör en hybridisering mellan östlig och västlig harr 8

9

10 Den relativa fördelning av den genetiska variationen på olika nivåer skattades med hjälp av AMOVA. Här indelades populationerna i två grupper (östlig resp västlig). Av Tabell 3 framgår att denna gruppering förklarade ca 4 procent av variationen och var statistisk signifikant. Tabell 3. Analys av mikrosatellitvariation mellan och inom grupper. Grupp 1: Holmön adulter, Holmön yngel, Norrby, Valsörarna, Siiponjoki, Olkijoki. Grupp 2 : Lögde övre, Lögde Nedre, Öre övre, Öre nedre, Sävar övre, Sävar nedre, Rickleå, Tavastögern. ** indikerar att P <0.01; *** indikerar att P< Variations Kvadrat- Varians- Procent av orsak f. g summa komponent variation Mellan Va 4.09** grupper Mellan populationer inom grupp Vb 14.45*** Inom populationer Vc 81.46*** Total Om de övre delarna av älvarna utesluts från analysen så att den därmed endast innefattar harr från de allra nedersta delarna av älvarna samt harr från havet och finsk harr blir resultatet av analysen likartat för variation mellan grupper. Däremot minskar komponenten mellan populationer inom grupp från till 6.19 och inom population komponenten ökar i motsvarande grad. Samtliga komponenter var statistiskt signifikanta även vid denna analys. Att komponenten Mellan grupper var signifikant indikerar att den gjorda grupperingen av bestånden var relevant och motsvaras av verkliga genetiska skillnader. Den högsta andelen av variationen återfinns i komponenten Inom populationer vilket är ett förväntat resultat. Stamtillhörighet och ursprung för harr fångad i havet utanför lekperioden Detta avsnitt behandlar analyser av harr som fångats på tider av året då lek ej pågår och på platser där det inte har kunnat bekräftas att reproduktion sker. Analyserna sker genom att individuella genotyper matchas mot motsvarande data för populationer. De populationer som använts som tänkbara ursprung är: Lögdeälv nedre, Öreälv övre och nedre, Sävarån övre och nedre, Holmön, F och S. I denna analys har vi använt individer fångade i Norrbyskärsområdet (Husskär, Pilhällan), Tavastögern och Valsörarna. Dessutom har, som en test av analysen, harr fångad i Lögdeälvens övre del samt harryngel från Holmön inkluderats. Resultaten presenteras i Tabell 4. Av tabellen framgår att samtliga harrar från Lögdeälvens övre del 10

11 placerades till Lögdeälvspopulationen. Ynglen från Holmön befanns till allra största delen (93%) höra till Holmöpopulationen. Att ett av ynglen fördes till Sävaråpopulationen är inte ett bevis för att detta yngel verkligen skulle härstamma från Sävarån, eller av föräldrafiskar från Sävarån, utan sannolikt en avvikelse som man kan räkna med i denna typ av analys. Tabell 4. Föreslagna ursprung (antal, procent) för grupper av harr. Lokal n Ursprung Lögdeälven övre 17 Lögdeälven % Holmön yngel 29 Holmön 27 93% Sävar ned 1 3.5% Oplacerade 1 3.5% Norrbyskär 20 Holmön 9 45% Sävar ned 6 30% Oplacerade 5 25% Tavastögern 11 Holmön 3 27% Sävar ned 7 64% Oplacerade 1 9% Valsörarna 12 Holmön 3 25% Siiponjoki 5 42% Oplacerade 4 33% Harrarna från Norrbyskär placerades i två populationer, majoriteten i Holmön och en något mindre andel i Sävarån och relativt många kunde ej med säkerhet föras till någon population. Flera möjligheter till tolkning finns här. Dels kan resultatet avspegla att Holmö- och Sävaråharr dominerar bland den harr som uppehåller sig i Norrbyskärsarkipelagen. En annan möjlighet är att Norrbyskärsområdet hyser en egen population som genetiskt står nära Holmöharren och i viss mån Sävaråharren. Att en fjärdedel av harrarna inte med någon säkerhet kunde placeras i en känd population kan i viss mån ses som ett stöd för en hypotetisk Norrbyskärspopulation. Om harr i våra älvar vandrar ut i nämnvärd omfattning borde man i Norrbyskärsområdet ha påträffat framförallt Öreälvsharr men även Lögdeälvsharr, men ingen indikation har framkommit i denna analys på att så är fallet. Bland fångsten från Tavastögern dominerade Sävaråharr, ett inte helt oväntat resultat p g a av geografisk närhet. Några placerades till Holmön vilket inte är någon orimlighet. Av harrarna från Valsörarna angavs den största gruppen komma från Siiponjoki och en mindre grupp från Holmön. I likhet med Norrbyskär kan detta avspegla antingen en vandring till Valsörarna av dessa grupper eller att området har en egen population som har störst genetisk likhet med dessa två bestånd. Att en tredjedel av harrarna inte med någon rimlig grad av säkerhet kunde föras till någon population kan indikera att den egentliga ursprungspopulationen saknas i vårt bakgrundsmaterial. Som helhet kan man bedöma att analyserna med tillfredsställande precision lyckas fastställa ursprunget för individuella harrar. Den fisk som inkluderats med känt ursprung (Lögdeälv resp Holmön) placerades med hög grad av korrekthet till rätt population. Begränsningarna ligger framförallt i att det kan finnas för oss okända 11

12 bestånd som kan utgöra delar av fångsterna. Mindre vattendrag som ej inkluderats i studien kan vara sådana felkällor men beståndsstorlekarna från dessa är rimligtvis så begränsade att det är ett mindre problem. Däremot kan förekomsten av okända havslekande bestånd vara av potentiellt betydelse. Analysens förmåga att korrekt hänföra individer till population ökas med ökat antal genetiska markörer. Här har sju mikrosatelliter och en mtdna markör utnyttjas och det är sannolikt att ett ökat antal markörer till viss del kan förbättra resultaten. DISKUSSION Harren i det undersökta området karakteriseras genetiskt av en fördelning på tre grupperingar: de svenska älvarnas övre delar, de allra nedersta delarna av de svenska älvarna i närheten av mynningen, samt havsbestånden inkluderande finska älvbestånd. Denna indelning är med all sannolikhet ett resultat av invandringshistorien med både en östlig och en västlig linje som möts i kustzonen på den svenska sidan. Förutom denna indelning finns inom varje grupp tydliga skillnader mellan enskilda lokaler vilket visar att det finns genetiskt differentierade lokala bestånd. Detta är i överensstämmelse med resultat från andra geografiska områden som Bajern (Gross m fl 2001, Gum m fl 2003) och Saimaa (Koskinen m fl 2001). Denna lokala differentiering kan existera trots avsaknad av fysiska hinder för migration vilket visas av att harren i älvarnas nedre delar kan mycket väl migrera till vilken annan älv i området som helst. Då enbart en mycket begränsad migration, i storleken några få individer per generation, är tillräckligt för att motverka genetisk differentiering tyder resultaten på att harren har en stark benägenhet att reproducera sig på den plats den själv härstammar från. Den i jämförelse med övriga bestånd låga variationsgraden och samtidigt uttalat starka differentiering för harr i de övre delarna av vattendragen visar att dessa harrbestånd sannolikt har varit isolerad från andra harrbestånd under lång tid. En isolering som medfört litet inflöde av variation och starkare genetisk drift. Effekterna av drift på de övre delarnas harr illustreras väl i PCA analysen där harren från de övre delarna hamnade långt ifrån varandra och i diagrammets perifera delar. De kustnära bestånden uppvisar en högre variationsnivå och en moderat differentieringsgrad vilket är en rimlig följd av att dessa bestånd lättare kunnat nås av migrerande individer från övre delar av älvarna och från andra älvar samt från havslekande bestånd. Trots detta är de nedre delarnas harrar tydligt och signifikant differentierade från varandra vilket tyder på att trots relativt lättillgängliga lägen (inga vandringshinder, nära havet) har endast ett begränsat genflöde (migration) förekommit. Holmöharren var klart skild från andra bestånd och uppvisade störst likhet med de finska populationerna. Den skillnad som erhållits mellan adulter och yngel från Holmön indikerar att det även på denna ö kan förekomma lokal differentiering. Adulterna kan förväntas inkludera harr som härstammar från ett flertal lekområden runt ön men ynglen fångades längs en mycket begränsad strandremsa. Den lägre variationsnivån för yngel jämfört med adulter från Holmön kan vara ett resultat av detta. De små provsamlingarna från Norrbyn, Tavasten och Valsörarna gör att data från dessa bör bedömas med försiktighet. De indikationer de ger förefaller emellertid rimliga då Tavastens harr liknar den närliggande Sävaråns, Valsörarna visar störst likhet med Holmöharr och finsk harr och Norrbyarkipelagens harr är mest lik Holmöharr och övrig 12

13 kustnära harr. Med hänsyn till att harren från Norrbyskärsområdet grupperades med Holmöharr och finsk harr i analyser baserade på mikrosatellitvariation och dessutom har enbart den östliga mitokondrievarianten fins det anledning att anta att i Norrbyskärsområdet förekommer en i likhet med Holmön havslekande harr. Alternativet vore att harr från de nedre delarna av någon eller några åar vandrar ut för födosök men detta motsägs av den genetiska analysen då de nedre delarna av Lögdeoch Öreälv är klart skilda från Norrbyskärsharren både vad beträffar mikrosatellitvariation och mitokondriell sammansättning. För skötsel av harrbestånden i Kvarkenområdet är det väsentligt att hänsyn tas både till den uppdelning som består av lokala bestånd men framförallt till den övergripande gruppering som är ett resultat av att det förekommit flera invandringsvägar till området då det koloniserades efter istiden. I synnerhet bör man ta hänsyn till att det havslekande beståndet på Holmön, och det troliga beståndet i Norrbyskärsområdet, visar ett starkt genetiskt släktskap med den finska harren och därmed kan antas ha sitt ursprung i den östliga invandringslinjen. Att just den östliga linjen blivit den som förmått att anpassa sig till att kunna klara av reproduktionen i havsmiljön kan vara en slump, enbart ett resultat av att denna linje först nådde området. Men möjligt är också att den östliga och västliga harren har utvecklats och anpassats olika under den långa tidsrymd de varit separerade från varandra. Kanske har detta bidragit till att den östliga harren har haft en fördel framför den västliga när det gäller att bilda havslekande bestånd. I framtida forskning skulle en undersökning av eventuella egenskapsskillnader mellan harr från de två invandringsvägarna kunna ge värdefull och användbar information. 13

14 REFERENSER Gross, R, R Kuhn, M Baars, W Schröder, H Stein & O Rottman Genetic differentiation of European grayling populations across the Main, Danube and Elbe drainages in Bavaria. Journal of Fish Biology 58: Gum, B, R Gross, O Rottmann, W Schröder & R Kuhn Microsatellit variation in Bavarian populations of European grayling (Thymallus thymallus): implications for conservation. Conservation Genetics 4: Koskinen, M. T., Ranta, E., Piironen J., Veselov A., Titov, S., Haugen T.O., Nilsson, J.,Carlstein, M. and Primmer C.R Genetic lineages and postglacial colonization of the grayling (Thymallus thymallus, Salmonidae) in Europe, as revealed by mitochondrial DNA analyses. Molecular Ecology 9: Koskinen, M. T., J. Piironen & C R Primmer Interpopulation genetic divergence in European grayling (Thymallus thymallus, salmonidae) at a microgeographic scale: implications for conservation. Conservation genetics 2: Koskinen, M. T., & C R Primmer High throughput analysis of 17 microsatellite loci in grayling (Thymallus spp. Salmonidae. Conservation Genetics 2: Koskinen, MT, J Nilsson, AJ Veselov, AG Potutkin, E Ranta & CR Primmer Microsatellite data resolve phylogeographic patterns in European grayling, Thymallus thymallus, Salmonidae. Heredity 88: