ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit REF M1990

Transkript

1 Sanquin Reagents Plesmanlaan CX Amsterdam The Netherlands Phone: Fax: Website: M1990 / January 2011 ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit REF M ELISA-set för kvantitativ in vitro-analys av mannosbindande lektin i humant serum (eller plasma) (sv) Ab BLANC BUF CAL COAT CONJ sv Antikroppar mot Blanko Buffert Kalibrerare beläggning Konjugat CONTROL DIL HUM MANNAN MOU SPE STOCK sv Kontroll Spädning Human Mannan Mus Prov Lager WASH - se Tvätta Gränsvärden 1

2 sv I. Inledning Mannosbindande lektin (MBL), som även kallas mannos- eller mannanbindande protein, är en viktig faktor för medfödd immunitet. MBL tillhör klassen kollektiner inom den överordnade gruppen lektiner av C-typ. Dessas funktion verkar vara att känna igen mönster i första försvarslinjen hos den redan immuna värden. MBL känner igen kolhydratmönster som finns på ytan hos många patogena mikroorganismer, som t.ex. bakterier, virus, protozoer och svamp (1,2,3). Bindningen av MBL till en mikroorganism leder till att den normala komplementvägen aktiveras, långt innan specifika antikroppar bildas. MBL har en oligomerisk struktur ( kda) och det är uppbyggt av underenheter som innehåller tre identiska peptidkedjor på 32 kda vardera. Även om MBL kan bilda olika oligomerer så finns det indikationer på att dimerer och trimerer inte är biologiskt aktiva och att det krävs minst en tetramer form för att komplementet ska aktiveras. Peptidkedjan består av en kollagenliknande del och av en lektindel. Lektindelen binds via CRD (kolhydratigenkännande domäner) till olika sockergrupper som mannos, maltos, N-acetylglukosamin, N-acetylgalaktosamin, fukos och glukos. Denna bindning har låg affinitet (Kd 10-3 ) och därför måste flera lektindelar från en och samma MBL-molekyl fästa samtidigt för att bindningen ska bli funktionell (4). I cirkulationen bildar MBL ett funktionskomplex med MASP (MBL-associerad serinproteas) 1, 2 och 3, som blir enzymatiskt aktiva efter att de bundit sig till en mikroorganism. MASP-2 är identiskt med C1-esteras på den normala komplementvägen och kan dela upp C4 och C2, så att C4b2a bildas. C4b2a fungerar som C3-konverterare och delar upp C3, så att C3b bildas, vilket leder till opsonisering av mikroben (2). Dessutom finns det tecken på att MBL binds direkt till kollektinreceptorer på fagocytytor och det antas att MBL binds till C1q-receptorn på neutrofila granulocyter, monocyter och makrofager. Bindningen till effektorceller kan stimulera produktionen av proinflammatoriska cytokiner. MBL är ett akutfasprotein som syntetiseras av hepatocyter. Omedelbart efter födseln stiger MBL-plasmakoncentrationen från ng/ml till maximalt ng/ml inom några veckor, därefter sjunker koncentrationen till en nivå på ng/ml hos vuxna. Individuella MBLkoncentrationer kan variera avsevärt och de kan öka upp till tjugo gånger den vanliga nivån under akuta fasreaktioner. MBL är viktigt under perioden efter födseln, som en del av det medfödda immunsystemet, då koncentrationen av antikroppar från modern sjunker och den egna IgG-produktionen måste inledas. Dessutom spelar MBL en viktig roll för alla åldrar vid den primära kontakten med mikroorganismer innan IgM-koncentrationerna stiger. MBL:s kliniska betydelse MBL-brist förekommer relativt ofta jämfört med andra brister hos komplementsystemet. Det förekommer hos 20-25% av populationen. MBL-brist associeras med ökad mottaglighet för infektioner, som öroninflammation, lunginflammation, mag-tarminflammationer, hjärnhinneinflammation, osteomyelit och sepsis. Hos barn ger en heterozygot MBL-genmutation fördubblad risk för sjukhusvistelse p.g.a. en infektionssjukdom, jämfört med barn som har normala MBL-nivåer. Vid homozygota genmutationer är infektionsrisken ännu större och sjukdomsförloppet blir värre än hos patienter med normala MBL-nivåer. Patienter med cystisk fibros som har en MBL-genmutation är mer mottagliga för infektioner med Pseudomonas aeruginosa eller Burkholderia cepacia och de lever oftast kortare än patienter med cystisk fibros som inte har denna mutation (5). Onkologipatienter som får cellgiftsbehandling och därefter utvecklar neutropeni drabbas oftare av längre feberperioder än om de har låga MBLplasmakoncentrationer. Hos barn yngre än ett år, som har Kawasakis sjukdom, är MBL-brist en riskfaktor för bråck på hjärtvenerna. HIV-positiva patienter utvecklar AIDS snabbare om de har MBL-brist. MBL-brist associeras också med upprepade missfall, möjligen p.g.a. infektioner i livmodern. MBL-brist associeras med autoimmunsjukdomar som Systemic Lupus Erythematosus (SLE) och ledgångsreumatism (RA). Sambandet mellan MBL-brist och både infektioner och autoimmuna sjukdomar har inte bara lett till en ökad MBL-diagnostik, utan det har dessutom påvisat behovet av terapeutisk användning av renat MBL. II. Teknisk princip Analysen är av ELISA-format och utförs i mikrobrunnar, belagda med mannan. MBL i en uppmätt volym i ett prov eller en kalibrerare binds till mannabeläggningen på mikrotiterplattan. Material som inte binds kan tvättas bort. Därefter läggs en HRP-konjugerad (HRP=horseradish peroxidase) antikropp till MBL (anti-humant MBL/1-HRP). Efter att det icke-bundna HRP-konjugatet tvättats bort tillfogas substratlösningen till brunnarna. Den färg som då utvecklas är proportionell till den mängd MBL som finns i provet eller kalibreraren. Den enzymatiska reaktionen stoppas på kemisk väg och färgintensiteten avläses vid 450 nm i en ELISA-avläsare. Utifrån provernas absorbering och absorberingen på en kalibreringskurva kan MBL-koncentrationen bestämmas genom interpolering. III. Förvaring och stabilitet MBL-ELISA-setet ska förvaras vid -18 C to -32 C. Setets funktion garanteras fram till det utgångsdatum som anges på etiketten. Transportförhållandena kan avvika från förvaringsförhållandena. Får ej frysas och tinas upp mer än tre gånger. IV. Setets innehåll MBL-ELISA-setet innehåller tillräckligt med material för 288 tester (tre plattor), inklusive kalibrerare, kontroller och tomma. Se vidare i tabellen i slutet av denna bipacksedel. Den mannan som används som beläggning har renats från Saccharomyces cerevisiae. Den monoklonala antikroppen har renats från vävnadsodlingsmedium med hjälp av kolonnkromatografi (jonbyte och affinitetskromatografi). Kalibrerar- och kontrollsubstansen är humanserum. V. Ytterligare material som krävs Ytterligare material: Destillerat vatten för förtunning av tvättnings-, förtunnings- och substratbuffrar. Bägare, flaskor och cylindrar för preparation av reagens. Pipettutrustning för att få korrekta volymer. En ELISA-tvättare av standardtyp eller en 500 ml plastsprutflaska för automatisk eller manuell tvättning av remsorna. En ELISA-avläsare av standardtyp för mätning av absorbering vid 450 nm. Loglineärt papper. 2

3 Extra buffrar och lösningar: Beläggningsbuffert: 0,1 M karbonat-/bikarbonatbuffert ph 9,6 Buffrar och lösningar för enzymatisk färgutveckling: Substratbuffert: 0,11 M acetatbuffert ph 5,5 Lös upp 15,0 g natriumacetat ( CH3COONa.3H2O ) i 800 ml destillerat vatten. Anpassa ph-värdet till 5,5 med isättiksyra och lägg till destillerat vatten tills volymen blir 1 liter. Tillfoga inga konserveringsmedel (t.ex. mertiolat, natriumazid) eftersom det kan påverka den enzymatiska färgutvecklingen. 3,5,3',5'-tetrametylbenzidin (TMB) moderlösning: 6 mg/ml TMB i DMSO. Lös upp 30 mg 3,5,3',5'-tetrametylbenzidin (TMB) i 5 ml dimetylsulfoxid (DMSO). Hydrogenperoxid moderlösning: 3% H2O2-lösning i destillerat vatten. Stopplösning: 1,8 M H2SO4-lösning i destillerat vatten. För en mikrotiterplatta ska 12 ml substratlösning förberedas genom att följande ingredienser blandas: 12 ml substratbuffert 200 μl TMB moderlösning 12 μl H2O2 moderlösning VI. Hantering av proverna Blodprover ska samlas in aseptiskt. Serum utgör det bästa provet, men heparin eller EDTA antikoagulerad plasma kan också används för analysen. Om plasma används ska 10 U/mL heparin tillfogas till förtunningsbufferten. Proverna ska vara så färska som möjligt eller förvaras frysta. VII. Analyskontroll Tina alla reagenser på provdagen, vänta tills de uppnått rumstemperatur (18-25 C) och blanda försiktigt. Undvik bubblor eller skum. 5 gångers koncentrerad förtunningsbuffert kan läggas i vattenbad på 37 C och blandas regelbundet. Kalibreraren och kontrollen kan tinas genom att hålla dem i handen. Centrifugera alla flaskor innan de används (1 minut vid g). Vi rekommenderar att alla prover, kontroller och kalibrerarförtunningar testas i två exemplar. Se tabell 4 i den bifogade broschyren för en lämplig plattplan. Mikrotiterplatta Setet innehåller tre mikrotiterplattor. Beroende på hur många prover som ska testas ska en eller fler plattor beläggas med mannan och detta ska göras dagen före testet. Mannan följer med som 100 gångers koncentration i det här setet. Beläggningsbufferten ska prepareras samma dag. Till varje mikrotiterplatta ska 120 μl mannan tillfogas till 12 ml beläggningsbuffert. Tillfoga 100 μl till alla brunnar, täck över mikrotiterplattorna med lock och inkubera över natten vid rumstemperatur (18-25 C). Buffrar Räkna ut hur pass mycket tvättningsbuffert som krävs och tillred en tillräckligt stark lösning genom att späda ut bufferten 20 gånger i destillerat vatten (det går åt cirka 300 ml till en platta). Den utspädda tvättningsbufferten måste förvaras vid 2-8 C och den förblir stabil i 1 vecka. Förtunningsbuffert: Räkna ut hur pass mycket förtunningsbuffert som krävs och tillred en tillräckligt stark lösning genom att späda ut bufferten 5 gånger i destillerat vatten. Tillredning av kalibrerare och kontroller (med duplikat) För koncentrationer, se Tabell 2 och 3 i den bifogade informationsbroschyren. Tina kalibreraren och kontrollen genom att hålla dem i handen och blanda försiktigt. Märk två provrör, två för kontrollen (med duplikat) och två för den högsta (350 ng/ml) kalibreringspunkten (med duplikat). Kalibrerare: I tabell 1 i den bifogade informationsbroschyren anges hur den högsta kalibreringspunkten prepareras. Märk åtta provrör, ett för varje kalibreringskurvas spädning (med duplikat): 140; 56; 22,4 och 9,0 ng/ml. Ta sedan med en pipett upp 150 μl förtunningsbuffert i dessa provrör. För över 100 μl från provröret med den högsta kalibreringspunkten i det andra provröret, märkt 140 ng/ml och blanda ordentligt. Upprepa spädningen tre gånger till genom att tillsätta 100 μl från det tidigare provröret med utspädd kalibrerare till den 150 μl spädning som finns i de märkta provrören. Kalibreringskurvan ska innehålla 350; 140; 56; 22,4; 9,0 ng/ml (med duplikat). Använd förtunningsbufferten som tomt värde (0 ng/ml). Kontroll: Ta med pipett upp 380 μl förtunningsbuffert av tillräcklig styrka i provrören för kontrollen (med duplikat), tillsätt 20 μl av kontrollen och blanda ordentligt. Preparation av prover Späd ut proverna 1:20 i förtunningsbuffert, motsvarande kontrollserumet. För resultat som ligger utanför de angivna gränsvärdena (se Tabell 1 i den bifogade informationsbroschyren) ska testet upprepas med en annan provförtunning. 1. Första tvättningssteget Sug upp mannanlösning ur mikrotiterplattornas brunnar och fyll brunnarna helt och hållet (> 300 µl) med tvättningsbuffert och kasta bort. Upprepa proceduren tre gånger. Slutligen bör brunnarna vara helt tomma. Efterföljande reagens bör tillsättas omedelbart. Låt inte brunnarna stå torra under en längre tid. 3

4 2. Första inkuberingssteget Tillsätt 100 μl av de utspädda kalibrerarna och proverna i lämpliga brunnar. Täck över plattan med en häftande försegling, skaka försiktigt genom att knacka på kanten på mikrotiterplattan i några sekunder för att blanda innehållet i varje brunn. Inkubera i 1 timme i rumstemperatur (18-25 C). Strax före tvättning, framställ nästa inkubationsreagens enligt beskrivningen under punkt Andra tvättningssteget Sug ut supernatant från brunnarna och tvätta plattan enligt beskrivningen under punkt Inkubation med anti-humant MBL-HRP. Späd ut konjugatet 1:100. Till varje mikrotiterplatta ska 120 μl HRP-konjugat tillfogas till 12 ml förtunningsbuffert. Tillsätt 100 μl till varje brunn. Täck över plattan med en häftande försegling, skaka försiktigt genom att knacka på kanten i några sekunder för att blanda innehållet i varje brunn. Inkubera i 1 timme i rumstemperatur (18-25 C). Preparera nästa inkubationsreagens TMB-substrat strax innan tvättningen. Se beskrivningen under V (Ytterligare material som krävs). 5. Tredje tvättningssteget Sug ut supernatant från brunnarna och tvätta plattan enligt beskrivningen under punkt Inkubation med TMB-substrat Tillsätt 100 μl TMB-substratlösning i alla brunnar. Skaka försiktigt genom att knacka på kanten på mikrotiterplattan i några sekunder för att blanda innehållet i varje brunn. Inkubera i max 30 minuter i ett mörkt utrymme med rumstemperatur (18-25ºC). Obs! Hur pass snabbt den enzymatiska färgutvecklingen går beror på flera faktorer, som temperaturen och kvaliteten hos den TMB som används. 7. Stoppa enzymatisk reaktion Tillsätt 100 μl stopplösning i alla brunnar. 8. Avläsning av platta Läs av inom 30 minuter vid 450 nm i en ELISA-avläsare. VIII. Resultat och tolkning av data Registrera absorberingen vid 450 nm för varje brunn och beräkna genomsnittet på duplikatvärdena. För varje prov bör duplikaten inte avvika mer än 15 % från medelvärdet. Om duplikaten avviker mer bör analysen göras om. Markera de genomsnittliga absorberingarna av kalibrerarna (y-axel) jämfört med den relaterade MBL i ng/ml (x-axel) på loglineärt papper och rita bäst passande kurva. MBL-nivåerna hos kontrollserumet ska ligga inom de gränsvärden som anges i Tabell 3 i den bifogade informationsbroschyren. Interpolera de genomsnittliga absorberingsvärdena för varje prov på referenskurvan. Prover som visar en genomsnittlig absorbering utanför området för referenskurvans förtunningar bör spädas ut på lämpligt sätt. IX. Analysområden Se Tabell 1 i den bifogade informationsbroschyren för de setspecifika analysområdena. X. Referensområden Mätningar hos en grupp vanliga, friska blodgivare i Nederländerna (n=244) gav följande MBL-värden: 10 % percentil <0,04 μg/ml 25 % percentil 0,4 μg/ml 50 % percentil 1,1 μg/ml 75 % percentil 2,0 μg/ml 90 % percentil 3,3 μg/ml Eftersom referensvärdena beror på flera påverkande variabler som kan variera mellan alla populationer som undersöks måste varje laboratorium upprätta ett eget referensvärde. XI. Specifikationer Reproducerbarhet Variation inom analysen: Två olika utspädningar av ett serumprov mättes elva gånger vardera vid en och samma analys. Variation mellan analyser: I sex till tio olika analyser mättes mängden MBL i tre olika serumprov. Inom analysen Genomsnitt Variation Spädning 1 (1:10) Spädning 2 (1:50) 1,46 μg/ml 1,53 μg/ml 6,0 % 6,1 % Mellan analyser Genomsnitt Variation Prov 1 Prov 2 Prov 3 1,52 μg/ml 1,49 μg/ml 1,60 μg/ml 7,9 % 4,8 % 1,2 % 4

5 Obs! De värden som anges för testets specifika prestationskännetecken representerar typiska resultat och ska inte betraktas som specifikationer för detta set. Känslighet Setet har en lägsta detektionsnivå på 9,0 ng/ml och ett mätbart koncentrationsområde på 9,0-350 ng/ml. Obs! De värden som anges för testets känslighet representerar typiska resultat och ska inte betraktas som specifika för detta set. Specificitet Frånvaro av korsreaktion med annan plasma eller andra serumkomponenter stöttas av det faktum att avläsningar som inte kan urskiljas från noll erhålls från givare med en viss MBL-brist men i övrigt normala värden. Förväntade värden Se X (Referensområden). XII. Restriktioner 1. Användaren ska ha utbildning i och känna till ELISA-analyser och testproceduren. 2. Kraftigt hematolyserade eller lipemiska prover ska inte användas. Oväntade resultat kan erhållas av prover med reumatoidfaktor, höga bilirubinnivåer eller andra existerande immunkomplex. Sådana prover ska analyseras med andra metoder. 3. Prover som ligger utanför gränsvärdena ska analyseras på nytt, med en annan förtunning. 4. Om en minskad nivå av MBL skulle hittas kan det inte betraktas som en definitiv diagnos utan enbart som en indikation på att immunsystemet är rubbat, vilket kräver fler undersökningar. 5. µlanvänd alltid kontrollserum för att kontrollera kalibreringskurvans giltighet. När kontrollen ligger utanför gränserna är provresultaten inte pålitliga. Testet bör göras om. 6. Reagenser från olika batches kan inte bytas ut mot varandra. 7. Reagensrester (t.ex. död volym) ska inte blandas med innehållet i nyöppnade flaskor. 8. Lock och flaskor får inte bytas ut. Locken ska sättas tillbaka på de rätta flaskorna. 9. Trots att den humana kalibreraren och kontrollserumet har testats på markörer av specifika sjukdomsöverförande agenter i enlighet med gällande EU-direktiv om GMP och befunnits vara non-reaktiva, ska alla komponenter från människor betraktas som potentiellt infektionsfarliga. 10. Konserveringsmedel: mertiolat 0,001 %. 11. Använd nya plattlock för varje inkubation/fixeringssteg i ELISA-experimentet för att undvika korskontamination. Använd inte aluminiumfolie. 12. Använd engångsspetsar för pipetten till varje överföring för att undvika kontamination. 13. Varje gång setet används bör färska förtunningar av kalibrerare, konjugat och buffrar göras. 14. Använd inga andra reagenser och mikrotiterplattor än de som levereras med setet. 15. Natriumazid inaktiverar HRP. Använd inte lösningar som innehåller natriumazid, tillsätt inte heller natriumazid i buffrarna. Använd inte mertiolat eftersom det kan påverka den enzymatiska färgutvecklingen. 16. Avfallshanteringen ska ske enligt gällande föreskrifter på laboratoriet. 17. Låt inga brunnar stå utan lock eller torra alltför länge mellan inkubationsstegen. XIII. Referenser 1. Turner, M.W. (1996) Immunol Today 17: Gadjeva, M. Thiel, S. Jensenius, J.C. (2001) Curr Opin Immunol 13: Klabunde, J. et al (2002) Parasitol Res 88(2): Thielens, N.M. et al (2001) J Immunol 166: Garred, P. (1999) J Clin Invest 104: ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit μl COAT MANNAN STOCK 1: μl CAL μl CONTROL μl HRP MOU Ab HUM MBL CONJ 1: ml BUF DIL STOCK 1: ml BUF WASH STOCK 1: x8 WELL 10 SEALS 5