COBAS TaqMan CT Test, v2.0

Transkript

1 COBAS TaqMan CT Test, v2.0 FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 CTM CT v Tests P/N: AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit CT/NG PREP 100 Tests P/N: ART: US: AVSEDD ANVÄNDNING COBAS TaqMan CT Test, v2.0 är ett in vitro-amplifieringstest med nukleinsyra för kvalitativ detektion av Chlamydia trachomatis DNA i pinnprov från livmoderhalsen på kvinnor, eller i urin från män eller kvinnor. Prov behandlas med AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit för manuell provextraktion och i analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 för automatisk amplifiering och detektion. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET Chlamydia är gramnegativa, icke-motila bakterier som existerar som obligata intracellulära parasiter i eukaryota celler på grund av deras oförmåga att syntetisera ATP. Genuset Chlamydia består av fyra rapporterade arter: C. trachomatis, C. psittaci, C. pecorum och C. pneumoniae (TWAR). C. psittaci är huvudsakligen en animal patogen, och den patogena rollen hos C. pecorum är inte klargjord 1. Chlamydia trachomatis-infektioner är idag den näst vanligaste sexuellt överförbara sjukdomen (STD) i världen med ungefär 89,1 miljon fall årligen 2. I USA rapporteras ungefär 2,8 miljoner fall per år 3. Chlamydia trachomatis orsakar infektion i livmoderhalsen, underlivssjukdom, spädbarnskonjunktivit, lunginflammation hos spädbarn, urinrörskatarr, bitestikelinflammation och inflammation i ändtarmen 1,4. Chlamydia trachomatis är även den främsta orsaken (ungefär % av fallen) till icke-gonokock urinrörskatarr hos män. Hos kvinnor kan obehandlade klamydiainfektioner få allvarliga följder. Eftersom cirka hälften av dessa infektioner är asymptomatiska, är det många fall som inte upptäcks och förblir obehandlade. Detta leder till följdproblem, i synnerhet hos gravida kvinnor. Spädbarn som fötts av klamydiasmittade mödrar löper stor risk att utveckla konjunktivit och lunginflammation. Odlingstester har varit den traditionella referensstandarden för identifiering av C. trachomatis. Standardiseringssvårigheter, stor teknisk komplexitet och behovet av att upprätthålla organismernas livsduglighet under transport och förvaring före odling har dock bidragit till att icke-odlingstester för C. trachomatis har utvecklats 5. I dessa metoder, som inte kräver livsdugliga organismer, ingår nukleinsyraamplifieringstester (NAAT), nukleinsyraprobtester, enzymimmunanalyser (EIA-tester), direkt fluorescerande antikroppstester (DFA) och komplementfixering 1,5. Vid kliniska utvärderingar har NAAT-metoder visat sig vara mer känsliga än odlings- och andra icke-odlingsmetoder; de har blivit de vanligast förekommande metoderna hos kliniska laboratorier för diagnos av C. trachomatis-infektioner 5. ANVÄNDNINGSPRINCIPER COBAS TaqMan CT Test, v2.0 baseras på två grundläggande principer: (1) manuell provextraktion för att erhålla CT DNA; (2) samtidig PCR-amplifiering 6 av target-dna med hjälp av CT-specifika komplementära primers, samt detektion av klyvda oligonukleotidprober märkta med två olika fluorokromer som möjliggör detektion av CT target-amplifierad produkt (amplicon) och CT internkontroll DNA, vilket amplifieras och detekteras samtidigt som provet. Master Mix-reagenset innehåller primerpar och prober som är specifika för kryptisk CT-plasmid DNA, CT-kromosomalt ompa gen DNA och CT internkontroll DNA. Master Mix har utvecklats för att garantera detektion av alla 15 CT-serovarerna. Detektion av amplifierat DNA utförs med hjälp av en målspecifik och en internkontroll-specifik dubbelmärkt oligonukleotidprob som tillåter oberoende identifiering av CT amplicon och CT internkontroll amplicon. Extraktion Urogenitala epitelceller som samplas upp på provtagningspinnar eller pelleteras från urin behandlas med en detergentlösning som frigör klamydia-dna som finns i retikulära klamydiakroppar. Ytterligare en detergentlösning tillsätts sedan som förbereder det lyserade provet för amplifiering. 1

2 PCR-amplifiering Val av target Förutom kromosomalt DNA innehåller C. trachomatis en kryptisk plasmid (ungefärlig storlek baspar) som är gemensam för alla C. trachomatis-serovarer 7,8. I COBAS TaqMan CT Test, v2.0 används CP102- och CP103-primers för att definiera en sekvens med cirka 206 nukleotider inom den kryptiska DNA-plasmiden i C. trachomatis. I COBAS TaqMan CT Test, v2.0 används dessutom CTMP101- och CTMP102-primers för att definiera en sekvens på cirka 182 nukleotider inom kromosomalt DNA i C. trachomatis. Amplifiering av target Extraherade prover tillsätts i amplifieringsblandningen i K-tubes eller K-trays där PCR-amplifiering sker. Reaktionsblandningen värms så att den isolerade DNA-kedjan denatureras och primer-målsekvenserna exponeras. När blandningen svalnar binder uppströms- och nedströmsprimern specifikt till en av DNAsträngarna, Z05 förlänger primern och en andra DNA-sträng syntetiseras. Detta slutför den första PCR-cykeln och ger en dubbelsträngad DNA-kopia av målregionerna för CT DNA och CT internkontroll DNA. Reaktionsblandningen värms igen så att den bildade dubbelsträngade DNA-kedjan separeras och primermålsekvenserna exponeras. När blandningen svalnar binder primers till target DNA. I närvaro av Mn 2+ och överskotts-dntps förlänger Z05 DNA-polymeras bundna primers längs målmallarna och producerar en dubbelsträngad DNA-molekyl som kallas ett amplicon. Proceduren upprepas automatiskt i analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 under ett bestämt antal cykler, varvid varje cykel effektivt fördubblar mängden amplicon- DNA. Det erforderliga antalet cykler förprogrammeras i analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. Amplifiering sker endast i regionen mellan primers på den kryptiska CT-plasmiden och/eller i ompa kromosomala regioner. Hela den kryptiska CT-plasmiden eller kromosomen amplifieras inte. Amplifiering av internkontroll I enzymbaserade amplifieringsprocesser, t.ex. PCR, kan effektiviteten minskas av hämmare som eventuellt förekommer i provet. CT internkontrollen möjliggör identifiering av extraherade prover innehållande ämnen som kan störa PCR-amplifieringen. CT internkontrollen är ett icke smittsamt rekombinant plasmid-dna med primerbindningsregioner identiska med C. trachomatis-målsekvensens, en randomiserad intern sekvens med samma längd- och baskomposition som C. trachomatis-målsekvensen, och en unik probbindningsregion som särskiljer CT internkontrollen från target amplicon. Dessa egenskaper valdes för att ge samma amplifiering för CT internkontrollen och C. trachomatis target DNA. CT internkontrollreagenset ingår i COBAS TaqMan CT Test, v2.0 och tillsätts i varje amplifieringsreaktion för att amplifieras tillsammans med target DNA från provet. CT internkontrollen är utformad för att garantera att prover inte innehåller hämmare som kan störa amplifiering och detektion av 20 eller fler kopior av C. trachomatis target nukleinsyra, fastställd genom Poisson-analys. Selektiv amplifiering Selektiv amplifiering av target-nukleinsyra från provet kan göras med COBAS TaqMan CT Test, v2.0 genom användning av AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) och deoxiuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet påvisar och katalyserar nedbrytning av DNA-strängar som innehåller deoxiuridin 9, men inte DNA som innehåller deoxitymidin. Deoxiuridin finns inte i naturligt förekommande DNA men finns däremot alltid i amplicon på grund av att deoxiuridintrifosfat används som en dntp i Master Mix-reagenset, varför endast amplicon innehåller deoxiuridin. Deoxiuridin gör kontaminerande amplicon känsligt för nedbrytning av AmpErase-enzymet före amplifiering av target-dna. Varje icke-specifik produkt som är skapad efter en initial aktivering av Master Mix med mangan förstörs av AmpErase-enzymet. AmpErase-enzymet, som ingår i Master Mix-reagenset, katalyserar klyvning av DNA innehållande deoxiuridin vid deoxiuridinresterna genom att öppna deoxiriboskedjan vid C1-positionen. Vid uppvärmning i det första termocykelsteget bryts amplicon- DNA-kedjan vid deoxiuridinets position vilket ger icke amplifierbart DNA. AmpErase-enzym är inaktivt vid temperaturer över 55 ºC, d.v.s. genom värmecykelstegen och förstör därför inte target amplicon som skapats under amplifieringen. Detektion av PCR-produkter i ett COBAS TaqMan Test I COBAS TaqMan CT Test, v2.0 används PCR-teknik i realtid 10,11. Användning av prober märkta med två olika fluorokromer möjliggör realtidsdetektion av PCR-produktansamling genom övervakning av emissionsintensitet av reporterfluorokromer som frigörs under amplifieringen. Proberna består av kryptisk CTplasmid, CT ompa och CT internkontroll-specifika oligonukleotider märkta med en reporterfluorokrom och en quencherfluorokrom. I COBAS TaqMan CT Test, v2.0 använder den kryptiska CT-plasmiden och ompaprober samma reporterfluorokrom. Proben för CT internkontrollen är märkt med en reporterfluorokrom som skiljer sig från både kryptisk CT-plasmid och ompa-prober. Om proberna som är märkta med två olika fluorokromer är intakta hämmas reporterfluorokromen av quencherfluorokromens närhet på grund av energiöverföringseffekter av Förster-typ. Medan PCR pågår hybridiseras proberna till deras respektive målsekvens och klyvs med 5' till 3' nukleasaktivitet hos värmebeständigt Z05 DNA-polymeras. När reporterfluorokromerna och quencherfluorokromerna har frigjorts och separerats avstannar quenching och den fluorescerande aktiviteten hos reporterfluorokromerna ökar. Amplifieringen av kryptisk CT-plasmid 2

3 och/eller ompa target DNA mäts oberoende och vid en annan våglängd än CT internkontroll DNA. Proceduren upprepas för ett bestämt antal cykler, varvid varje cykel effektivt ökar emissionsintensiteten hos de enskilda reporterfluorokromerna, vilket ger oberoende identifiering av CT DNA och CT internkontroll DNA. REAGENS AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit 100 tester AMPLICOR CT/NG PREP CT/NG extraktionskit (P/N: ; ART: ; US: 83315) CT/NG URINE WASH 1 x 50 ml (CT/NG urintvättbuffert) Tris-HCl-buffert 300 mm natriumklorid < 0,1 % detergent 0,09 % natriumazid CT/NG LYS 1 x 25 ml (CT/NG lyseringsreagens) Tris-HCl-buffert < 1 % solubiliserande ämne 0,09 % natriumazid CT/NG DIL 2 x 50 ml (CT/NG spädningsmedel) Tris-HCl-buffert 6 mm magnesiumklorid < 25 % detergent 0,05 % natriumazid COBAS TaqMan CT Test, v2.0 CTM CT v tester (P/N: ) Kontrollreagens CT IC 3 x 0,1 ml (CT internkontroll) Tris-HCl-buffert 8 kopior/µl av icke smittsamt plasmid-dna (mikrobiellt) som innehåller C. trachomatis-primerbindningssekvenser och en unik probbindningsregion som motsvarar ungefär 20 IC-kopior/test < 0,005 % poly ra RNA (syntetiskt) EDTA Amarant-färgämne 0,05 % natriumazid CT (+) C, v2.0 1 x 0,75 ml [C. trachomatis (+)-kontroll, v2.0] Tris-HCl-buffert 8,6 kopior/µl av icke smittsamt plasmid-dna (syntetiskt) som innehåller C. trachomatis-sekvenser motsvarande ungefär 20 kopior/test < 0,005 % poly ra RNA (syntetiskt) EDTA 0,05 % natriumazid CT ( ) C, v2.0 1 x 0,75 ml [C. trachomatis ( )-kontroll, v2.0] Tris-HCl-buffert < 0,005 % poly ra RNA (syntetiskt) EDTA 0,05 % natriumazid 3

4 Amplifierings- och detektionsreagens CT MMX, v2.0 (COBAS TaqMan CT Master Mix, v2.0) 3 x 0,75 ml Tricinbuffert Kaliumhydroxid Kaliumacetat Glycerol < 0,001 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001 % uppströms- och nedströms-primers för kryptisk CT-plasmid och CT ompa < 0,001 % fluorescensmärkta oligonukleotidprober specifika för kryptisk CT-plasmid, CT ompa och CT internkontrollen < 0,001 % aptamer < 0,05 % Z05 DNA-polymeras (mikrobiellt) < 0,1 % AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) (mikrobiellt) 0,09 % natriumazid CT Mn 2+ (COBAS TaqMan CT manganlösning) 3 x 0,2 ml < 1,0 % magnesiumacetat Isättika 0,09 % natriumazid VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER A. FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. B. Betydelsen av termen kopia i den här metodmanualen är 1 kopia av C. trachomatis target nukleinsyra. En (1) kopia motsvarar den minsta mängd C. trachomatis target nukleinsyra som skulle generera ett positivt PCR-testresultat. C. Detta test är endast avsett att användas med livmoderhals- och urinprover. Testet är inte avsett att användas med svalg-, rektal- eller andra typer av prover. D. Pipettera inte med munnen. E. Ät, drick eller rök inte i laboratorium. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar prover och kitets reagens. Tvätta händerna noga efter hantering av prover och kitets reagens. F. Undvik mikrobiell kontaminering av reagensen när portioner tas från reagensflaskor. G. Användning av sterila engångspipetter och pipettspetsar rekommenderas. H. Sammanför inte reagens från olika loter eller från olika flaskor i samma lot. I. Blanda inte reagens från olika kit. J. Kassera oanvända reagens, avfall och prover enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. K. Använd inte kit efter utgångsdatum. L. Kontakta närmaste Roche-kontor om du vill erhålla säkerhetsdatablad (MSDS). M. Arbetsgången på laboratoriet ska börja i pre-amplifieringsområdet och fortsätta mot postamplifieringsområdet (amplifiering/detektion). Förbrukningsmaterial och utrustning ska speciellt tilldelas varje pre-amplifieringsarbete och får inte användas för andra arbeten eller flyttas mellan områden. Handskar ska användas i alla områden. Byt handskar innan ett område lämnas. Utrustning och förbrukningsmaterial som används för reagensextraktion får inte användas för provextraktion eller för pipettering eller bearbetning av amplifierat DNA eller andra källor för target DNA. Förbrukningsmaterial och utrustning för post-amplifiering ska alltid stanna kvar i post-amplifieringsområdet. N. Prover och kontroller ska behandlas som smittbärande material i enlighet med exempelvis de laboratorierutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 12 och i CLSI-dokument M29-A3 13. Rengör och desinficera noga alla arbetsytor med nyberedd lösning bestående av 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. OBS! Vanliga hushållsblekmedel innehåller normalt 5,25 % natriumhypoklorit. En utspädning 1:10 med hushållsblekmedel ger en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit. O. För prover som transporteras i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) ska pinnprov lämnas kvar i transportröret för att ge visuellt bevis på provinokulering. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 utvärderades med prover som transporterades med provpinnen i transportröret för M4RT 4

5 MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.). Prover som transporterats i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) utan provpinne har inte utvärderats och rekommenderas inte för användning med detta test. P. Förvaring av urinprov i rumstemperatur (15 30 C) i mer än 24 timmar kan leda till nedbrytning av prov. Urinprov som förvaras i rumstemperatur (15 30 C) i mer än 24 timmar ska inte användas för testning. Q. CT/NG URINE WASH, CT/NG LYS, CT/NG DIL, CT MMX, v2.0; CT Mn 2+, CT IC, CT (+) C, v2.0 och CT ( ) C, v2.0 innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- eller kopparrör och bilda mycket explosiva metallazider. Förhindra aziduppbyggnad genom att spola med mycket vatten om lösningar som innehåller natriumazid hälls ut i avloppet. R. Rör med skruvkork ska användas vid prov- och kontrollextraktion för att hindra stänk och möjlig överföring av smitta mellan prover. Rör med snäpplock får inte användas. S. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar reagens. Undvik att dessa material kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Vid spill av dessa reagens ska du späda med vatten innan spillet torkas upp. FÖRVARING OCH HANTERING Reagens och kontroller får inte frysas. A. Förvara CT/NG LYS vid 2 25 C. Förvara CT/NG URINE WASH och CT/NG DIL vid 2 8 C. Om en fällning bildas i något av reagensen vid förvaring ska reagenset värmas till rumstemperatur (15 30 C) och blandas noggrant innan det används. Reagensen är hållbara till det utgångsdatum som anges. B. Förvara CT MMX, v2.0; CT Mn 2+, CT (+) C, v2.0; CT ( ) C, v2.0 och CT IC i 2 8 C. Reagensen är hållbara till det utgångsdatum som anges. C. Förvara delvis använda kontroller vid 2 8 C mellan instrumentkörningarna. Kontrollera utgångsdatumet på öppnade kontroller innan de används. CT (+) C, v2.0 och CT ( ) C, v2.0 kan användas upp till tre gånger för att bereda arbetskontroller CT (+), v2.0 och CT ( ), v2.0. D. CT MMX, v2.0; CT Mn 2+ och CT IC levereras i engångsflaskor i uppsättningar om 16 reaktioner. Allt eventuellt oanvänt material i flaskorna måste kasseras. E. Working Master Mix (berett genom tillsats av CT Mn 2+ och CT IC i CT MMX, v2.0) ska förvaras mörkt i rumstemperatur (15 30 C) i högst 2 timmar eller vid 2 8 ºC i högst 16 timmar. Beredda prover och kontroller måste tillsättas inom 2 timmar efter att Working Master Mix har beretts om de förvaras i rumstemperatur (15 30 C), eller högst 16 timmar efter att Working Master Mix har beretts om de förvaras vid 2 8 ºC. F. Bearbetade prover är hållbara upp till 2 timmar vid C och 7 dagar vid 2 8 C. G. Amplifieringen ska startas inom 90 minuter efter att de bearbetade proverna och kontrollerna tillsätts i Working Master Mix. MATERIAL SOM MEDFÖLJER Provextraktionsreagens A. AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit AMPLICOR CT/NG extraktionskit (P/N: ; ART: ; US: 83315) CT/NG LYS (CT/NG lyseringsreagens) CT/NG URINE WASH (CT/NG urintvättbuffert) CT/NG DIL (CT/NG spädningsmedel) CT/NG PREP 5

6 Amplifierings- och detektionsreagens B. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 (P/N: ) CT IC (CT internkontroll) CT (+) C, v2.0 [C. trachomatis (+)-kontroll, v2.0] CT ( ) C, v2.0 [C. trachomatis ( )-kontroll v2.0] CT MMX. v2.0 (COBAS TaqMan CT Master Mix, v2.0) CT Mn 2+ (COBAS TaqMan CT manganlösning) CTM CT v2.0 MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER Instrument och programvara Analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 Programmet AMPLILINK Datastation för programmet AMPLILINK Instrumenthandbok till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 avsedd att användas med applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2-serien Applikationshandbok till programmet AMPLILINK version 3.2-serien för användning med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 och analysinstrumentet COBAS AMPLICOR K-tube-öppnare/tillslutare K-carrier till analysinstrument COBAS TaqMan 48 K-tray carrier till analysinstrument COBAS TaqMan 48 Provtagning och transport M4RT MicroTest BL KIT Ref , tillverkad och distribuerad av Remel, Inc. Produkten kan också beställas via Roches beställningssystem. (P/N: ) Urinprovsbehållare i polypropylen utan konserveringsmedel Engångsartiklar K-tubes K-trays till analysinstrument COBAS TaqMan 48 ÖVRIGT MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER Eppendorf Repeater -pipett med 1,25 ml Eppendorf Combitip -behållare (steril, styckförpackad) Vortexblandare Pipetteringshjälp: Drummond (P/N: ) eller motsvarande 2,0 ml polypropylenrör med skruvkork, sterila, ej silikonbehandlade, koniska (Sarstedt eller motsvarande)** Rörrack (Sarstedt eller motsvarande) Pipetter (50 µl, 100 µl, 200 µl, 250 µl, 500 µl och µl)* med spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning Mikrocentrifug (max. RCF x g, min. RCF x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M eller motsvarande Förlängda aerosolbarriärspetsar (Matrix 7055 eller liknande) för användning med prover som transporteras i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) (M4RT MicroTest BL KIT) 37 C ± 2 C värmeblock Absorberande papper Engångshandskar, puderfria * Pipetterna ska ha en noggrannhet inom 3 % av angiven volym. DNase-fria (eller nukleasfria) spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning ska användas när så anges, för att hindra överföring av smitta mellan prov och amplicon. ** Rör med skruvkork ska användas för prov- och kontrollextraktion för att hindra stänk och möjlig överföring av smitta mellan prover och kontroller. Rör med snäpplock får inte användas. 6

7 PROVTAGNING, TRANSPORT OCH FÖRVARING AV PROVER OBS! Hantera alla prover och kontroller som potentiellt smittbärande. Endast följande prover är godkända: 1. Urinprover (från män och kvinnor) som transporteras i rena polypropylenbehållare. Använd inte urinprover i behållare som innehåller konserveringsmedel. 2. Pinnprover från livmoderhalsen som tagits och transporterats i M4RT MicroTest odlingstransportsystemmedium (Remel, Inc.). Tillförlitliga testresultat erhålls genom att följa instruktionerna nedan så att provtagningen blir korrekt. Detta test är inte avsett för användning med svalgprover, rektalprover eller andra typer av prover än de som anges. För att säkerställa leverans av högkvalitativa prover till laboratoriet för testning ska urinprover och pinnprover från livmoderhalsen transporteras på så kort tid som möjligt till laboratoriet. Prover får inte transporteras utan kontrollerade temperaturförhållanden. A. Provtagning Urinprover (från män och kvinnor) OBS! Patienten får inte ha urinerat under de 2 närmast föregående timmarna. 1. Samla 10 till 50 ml av det första av urinstrålen (den första delen av strålen) i en ren polypropylenbehållare utan konserveringsmedel. 2. Förslut provbehållaren och märk den. Följ tillverkarens riktlinjer för provtagning och transport. Provet kan transporteras till testplatsen i rumstemperatur (15 30 C). Pinnprover (från kvinnor) som tagits i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) 1. Pinnprover från livmoderhalsen som tas och transporteras i 3 ml M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.). Använd rekommenderade metoder för att ta kolonnlika celler och kolonnlika skivepitelceller när slem från livmoderhalsen har avlägsnats Använd endast provtagningspinnar med toppar av dacron, rayon eller kalciumalginat och skaft av plast eller annat icke-aluminiummaterial. Använd inte provtagningspinnar med skaft av trä eller aluminium. 3. Lämna kvar provtagningspinnarna i transportmediet. Förslut provbehållaren och märk den. Följ tillverkarens riktlinjer för provtagning och transport. Provet kan transporteras till testplatsen i rumstemperatur (15 30 C). B. Transportera prover Urinprover (från män och kvinnor) 1. Urinprover kan transporteras till testplatsen vid C. Urinprover är hållbara i 24 timmar vid C. 2. Urinprover som ska levereras till avlägsna testplatser ska transporteras över natten med garanterad ankomst inom 24 timmar. Transporten kan ske vid C. Om urinprover transporteras vid C ska de förvaras vid 2 8 C fram till transporttidpunkten, så att förvaringstiden vid C inte överstiger 24 timmar. Vid transport av prover ska gällande bestämmelser för transport av etiologiska agens följas 15. Pinnprover (från kvinnor) som tagits i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) 1. Pinnprover kan transporteras till testplatsen vid C, förutsatt att den totala förvarings- och transporttiden vid C är kortare än 14 dagar. Placera pinnprover i kylskåp om transport till laboratoriet sker först efter mer än 14 dagar från provtagningstillfället. Om proverna ska användas för odling ska de hanteras enligt odlingsrekommendationerna ( 60 C om de inte odlas inom 24 timmar). 2. Pinnprover som ska levereras till avlägsna laboratorier kan transporteras vid C efter provtagning. Följ laboratoriets rutiner för transport av pinnprover. Vid transport av prover ska gällande bestämmelser för transport av etiologiska agens följas 15. C. Förvaring av prov OBS! Rutinnedfrysning eller förlängd förvaring av prover kan påverka resultaten. Urinprover (från män och kvinnor) Urinprover som inte behandlas inom 24 timmar efter provtagning ska förvaras vid 2 8 C och måste bearbetas inom 7 dagar efter provtagning. Urinprover som inte kan bearbetas inom 7 dagar efter provtagning kan förvaras vid 20 C eller kallare i upp till 30 dagar. 7

8 Pinnprover från livmoderhalsen som tas i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-media (Remel, Inc.) Förvara pinnprover som inte testas vid ankomst till testlaboratoriet vid C och bearbeta inom 14 dagar. Pinnprover som inte kan bearbetas inom 14 dagar efter provtagning ska förvaras vid 20 C eller kallare och testas inom 30 dagar efter provtagning. BRUKSANVISNING OBS! Detaljerad information om användning, utskrift av resultat samt tolkning av flaggor, kommentarer och felmeddelanden finns i instrumenthandboken till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 avsedd att användas med applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2-serien och applikationshandboken till programmet AMPLILINK version 3.2-serien för användning med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 och analysinstrumentet COBAS AMPLICOR. OBS! Alla amplifierings- och detektionsreagens måste ha uppnått rumstemperatur (15 30 C) innan de används; ta ut dem ur kylskåpet (2 8 C) minst 30 minuter före användning. OBS! Pinnprover och urinprover måste ekvilibreras i minuter i rumstemperatur (15 30 C) innan de används. OBS! Använd pipetter med spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning om så anges. Var ytterst noga med att undvika smitta. Omgångsstorlek: Varje COBAS TaqMan CT Test, v2.0-kit innehåller reagens för tre omgångar med 16 test, vilka kan utföras separat eller samtidigt. Ett replikat vardera av CT ( ) C, v2.0 och CT (+) C, v2.0 måste ingå i varje testomgång av upp till 48 prover och kontroller (se avsnittet Kvalitetskontroll ). Amplifierings- och detektionsreagensen är förpackade i engångsflaskor för 16 test. Reagensen utnyttjas bäst om prover och kontroller extraheras i grupper som är multiplar av 16. Extraktionssreagensen är förpackade i engångsflaskor för 100 tester. Prov- och kontrollextraktion A. Extraktion utförd i: Pre-amplifiering provextraktionsområde Urinprover (från män och kvinnor) 1. Märk ett 2,0 ml rör med skruvkork för varje patientprov. 2. Tillsätt 500 µl CT/NG URINE WASH i vart och ett av de märkta rören. 3. Vortexa urin noga (3 10 sekunder). Om frysta prover används ska proverna tinas i rumstemperatur (15 30 C) innan de vortexas (större volymer än 2 ml ska tinas över natten vid 2 8 C); fortsätt processen även om en fällning bildas. Ta försiktigt bort korkarna från behållarna med urinprov. Var noga med att inte kontaminera handskarna med urin i korken. Byt ut handskarna mot ett rent par om de skulle kontamineras innan du fortsätter med nästa prov. 4. Tillsätt 500 µl av varje väl blandat urinprov i röret med etikett med CT/NG URINE WASH. Använd en ny aerosolbarriärspets för varje prov. Sätt tillbaka korkarna på rören och blanda väl genom att vortexa. 5. Inkubera rören vid 37 C i 15 minuter. 6. Centrifugera vid x g i 5 minuter. 7. Häll av supernatant och torka varje rör på ett eget absorberande papper. 8. Tillsätt, med hjälp av en pipett med en ny aerosolbarriärspets för varje prov, 250 µl CT/NG LYS i varje rör. Sätt tillbaka korkarna på rören och blanda väl genom att vortexa. 9. Inkubera rören i 15 minuter i rumstemperatur (15 30 C). 10. Tillsätt, med hjälp av en pipett med en ny aerosolbarriärspets för varje prov, 250 µl CT/NG DIL i varje rör. Sätt tillbaka korkarna på rören och blanda väl genom att vortexa. 11. Centrifugera rören i 10 minuter i x g. 12. Bearbetade prover kan förvaras i rumstemperatur (15 30 C) i upp till 2 timmar innan portionerna överförs till K-tubes eller K-trays som innehåller Working Master Mix. Förvara extraherade prover vid 2 8 C om portionerna inte överförs till K-tubes eller K-trays inom 2 timmar. Extraherade prover som förvaras vid 2 8 C måste testas inom 7 dagar. Pinnprover OBS! COBAS TaqMan CT Test, v2.0 har utvärderats med M4RT MicroTest odlingstransportsystem-media (Remel, Inc.). Användning av alternativa transportmedia måste utvärderas av laboratoriet. 8

9 1. Kontrollera att M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medieröret (Remel, Inc.) innehåller en provtagningspinne. Provpinnar bör lämnas i M4RT MicroTest odlingstransportsystemmedieröret (Remel, Inc.) för att undvika felbehandling. Förekomsten av provpinnar i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medieröret (Remel, Inc.) garanterar inte rätt provtagning. 2. Märk ett 2,0 ml rör med skruvkork för varje patientprov. Rör med snäpplock får inte användas. 3. Tillsätt 100 µl CT/NG LYS i de märkta 2 ml-polypropylenrören. 4. Blanda väl genom att vortexa. Om proverna förvarades frusna ska de tinas i rumstemperatur (15 30 C) innan de vortexas. Ta försiktigt bort korkarna från provrören. Se noga till att handskarna inte kontamineras. Byt ut handskarna mot ett rent par om de skulle kontamineras innan du fortsätter med nästa prov. 5. Tillsätt, med hjälp av en pipett med en ny aerosolbarriärspets, 100 µl av det välblandade provet i motsvarande rör som innehåller CT/NG LYS. Använd en ny aerosolbarriärspets för varje prov. Sätt tillbaka korken på röret och blanda väl genom att vortexa. 6. Inkubera rören i rumstemperatur (15 30 C) i 10 minuter. 7. Tillsätt, med hjälp av en pipett med en ny aerosolbarriärspets för varje prov, 200 µl CT/NG DIL i varje rör. Sätt tillbaka korken på röret och blanda väl genom att vortexa. 8. Inkubera rören i rumstemperatur (15 30 C) i 10 minuter. 9. Bearbetade prover kan förvaras i rumstemperatur (15 30 C) i upp till 2 timmar innan portionerna överförs till K-tubes eller K-trays som innehåller Working Master Mix. Förvara extraherade prover vid 2 8 C om portionerna inte överförs till K-tubes eller K-trays inom 2 timmar. Extraherade prover som förvaras vid 2 8 C måste testas inom 7 dagar. B. Kontrollextraktion utförd i: Pre-amplifiering provextraktionsområde OBS! Arbetskontroller måste beredas varje dag som testet utförs. Arbetskontroller kan användas för att bereda flera bearbetade kontroller under dagen. De ska dock kasseras i slutet av dagen. OBS! Reagensen CT (+) C, v2.0- och CT ( ) C, v2.0 som medföljer COBAS TaqMan CT Test, v2.0-kitet är utformade för att användas upp till tre gånger för att preparera arbetskontroller CT (+), v2.0 och CT ( ), v2.0. OBS! Om både pinn- och urinprover testas är det nödvändigt att bereda en uppsättning kontroller för varje provtyp. Arbetskontroller: Bered följande CT (+), v2.0- och CT ( ), v2.0-arbetskontroller. 1. Använd en pipett med steril pipettspets och tillsätt 1 ml CT/NG DIL i vart och ett av två 2 mlpolypropylenrör med skruvkork. Märk ett rör med CT (+), v2.0-arbetskontroll och det andra röret med CT ( ) v2.0-arbetskontroll. 2. Vortexa CT (+) C, v2.0 och CT ( ) C, v2.0 i 5 sekunder med maximal hastighet. Ta försiktigt bort korkarna från provrören. Se noga till att handskarna inte kontamineras. Byt ut handskarna mot ett rent par om de skulle kontamineras innan du fortsätter med nästa prov. 3. Tillsätt med hjälp av en pipett med en ny aerosolbarriärspets 100 µl CT (+) C, v2.0 i röret som är märkt CT (+), v2.0-arbetskontroll. Förslut och förvara CT (+) C, v2.0-röret vid 2 8 C. 4. Tillsätt med hjälp av en pipett med en ny aerosolbarriärspets 100 µl CT ( ) C, v2.0 i röret som är märkt CT ( ), v2.0-arbetskontroll. Förslut och förvara CT ( ) C, v2.0-röret vid 2 8 C. 5. Sätt tillbaka korkarna på arbetskontrollrören och blanda väl genom att vortexa. Förvara i rumstemperatur (15 30 C) och kassera i slutet av arbetsdagen. Urinprover: Bered följande bearbetade kontroller CT (+), v2.0 och CT ( ), v Använd en pipett med steril pipettspets och tillsätt 250 µl CT/NG LYS i vart och ett av två 2 mlpolypropylenrör med skruvkork. Märk ett rör med CT (+), v2.0 bearbetad kontroll och det andra röret med CT ( ), v2.0 bearbetad kontroll. 2. Tillsätt med hjälp av en pipett med en ny aerosolbarriärspets 250 µl CT (+), v2.0-arbetskontroll i röret som är märkt CT (+), v2.0 bearbetad kontroll. 3. Tillsätt med hjälp av en pipett med en ny aerosolbarriärspets 250 µl CT ( ), v2.0-arbetskontroll i röret som är märkt CT ( ), v2.0 bearbetad kontroll. 4. Sätt tillbaka korkarna på rören och blanda väl genom att vortexa. Inkubera i rumstemperatur (15 30 C) i 10 minuter. Förvara i rumstemperatur (15 30 C) och kassera i slutet av arbetsdagen. 9

10 Pinnprover: Bered följande bearbetade kontroller CT (+), v2.0 och CT ( ), v Använd en pipett med steril pipettspets och tillsätt 100 µl CT/NG LYS i vart och ett av två 2 mlpolypropylenrör med skruvkork. Märk ett rör med CT (+), v2.0 bearbetad kontroll och det andra röret med CT ( ), v2.0 bearbetad kontroll. 2. Tillsätt med hjälp av en steril pipettspets 100 µl M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) i vart och ett av rören som innehåller CT/NG LYS. 3. Sätt tillbaka korkarna på rören och blanda väl genom att vortexa. 4. Tillsätt med hjälp av en pipett med en ny aerosolbarriärspets 200 µl CT (+), v2.0-arbetskontroll i röret som är märkt CT (+), v2.0 bearbetad kontroll. 5. Tillsätt med hjälp av en pipett med en ny aerosolbarriärspets 200 µl CT ( ), v2.0-arbetskontroll i röret som är märkt CT ( ), v2.0 bearbetad kontroll. 6. Sätt tillbaka korkarna på rören och blanda väl genom att vortexa. Inkubera i rumstemperatur (15 30 C) i 10 minuter. Förvara i rumstemperatur (15 30 C) och kassera i slutet av arbetsdagen. Amplifiering och detektion OBS! K-carriers och K-carrier-hållare ska torkas av med en luddfri trasa fuktad med 70-procentig isopropanollösning. A. Beredning av reagens OBS! Prover och kontroller som extraherats med COBAS TaqMan CT Master Mix, v2.0 (CT MMX, v2.0), Working Master Mix (Working MMX) och Working MMX plus är ljuskänsliga. Skydda dessa reagens mot ljus. OBS! COBAS TaqMan CT Master Mix, v2.0 (CT MMX, v2.0); COBAS TaqMan CTmanganlösning (CT Mn 2+ ) och COBAS TaqMan CT internkontroll (CT IC) måste ekvilibreras i rumstemperatur (15 30 C) i minst 30 minuter innan Working Master Mix bereds. OBS! Bered Working MMX när prov- och kontrollextraktion har slutförts. OBS! Working MMX måste användas inom 2 timmar efter beredning om förvaring sker i rumstemperatur (15 30 C) eller inom 16 timmar om förvaring sker vid 2 8 ºC. OBS! När extraherade prover och kontroller har tillsatts i Working MMX måste amplifiering påbörjas inom 90 minuter. 1. Ekvilibrera en flaska CT MMX, v2.0, en flaska CT IC och en flaska CT Mn 2+ i rumstemperatur (15 30 C) i minst 30 minuter. 2. Placera en K-carrier i en K-carrier-hållare. Placera nya K-tubes eller en ny K-tray i K-carrier utan att vidröra sidorna på K-tubes eller K-tray-brunnarna. OBS! Om färre än 24 rör ska köras måste positionerna 1, 2, 5, 20, 23 och 24 beläggas så att rätt balans åstadkoms på K-carriern i termocykeln. 3. Om det är lämpligt, avlägsna korkarna på K-tubes med hjälp av K-tube-öppnaren/-tillslutaren. Placera korkarna i parkeringspositionshållaren för K-tube. 4. Bered Working MMX på följande sätt: För 16 tester tillsätts 150 µl CT Mn 2+ och 50 µl CT IC i en flaska CT MMX, v2.0. Förslut flaskan och blanda väl genom att vända 10 gånger. Vortexa inte Working MMX. Skydda Working MMX mot ljus och använd det inom 2 timmar om det förvaras i rumstemperatur (15 30 C) eller inom 16 timmar om det förvaras vid 2 8 C. 5. Pipettera 50 µl Working MMX i varje K-tube eller K-tray-brunn. OBS! Om extraherade prover har varit frysta innan amplifieringen ska de tinas i rumstemperatur (15 30 C) och blandas noggrant genom att vortexa. Centrifugera bearbetade prover i 10 minuter i x g efter vortexing. OBS! Rör inte pipettspetsen mot någon annan yta än den avsedda K-tube eller K-traybrunnen när Working MMX fördelas. Om spetsen råkar nudda ytorna på K-tray carrier måste spetsen kasseras för att undvika att PCR-hämmare introduceras. 6. Tillsätt 50 µl av varje extraherat prov och extraherad kontroll i lämplig K-tube eller K-traybrunn som innehåller Working MMX med hjälp av en mikropipett med spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning. Blanda försiktigt varje prov eller kontroll genom att pipettera upp och ned tre gånger med mikropipetten utan att bubblor genereras. OBS! Rör inte pipettspetsen mot någon annan yta än den avsedda K-tube eller K-traybrunnen när behandlade prov och kontroller fördelas. Om spetsen råkar nudda ytorna på K-tray carrier måste spetsen kasseras för att undvika att PCR-hämmare introduceras. 10

11 7. Upprepa steg 6 för varje extraherat prov och extraherad kontroll tills alla har överförts till K-tubes eller K-trays. Använd en ny spets för varje prov och kontroll. Kontrollera om det förekommer bubblor och avlägsna dem vid behov. Täck över K-tray eller försegla K-tubes med en K-tubeöppnare/-tillslutare. Kontrollera att korrekt volymer har tillsatts. 8. Amplifieringen ska startas inom 90 minuter efter att de extraherade proverna och kontrollerna har tillsatts i K-tubes eller K-traybrunnarna med Working MMX. 9. Förvara återstoden av varje bearbetat prov vid 2 8 C i de fall då de behöver testas om. Omtestning måste utföras inom 7 dagar efter provextraktion. B. Laddning och drift av analysinstrumentet COBAS TaqMan Slå på datorarbetsstationen och logga in på Windows XP med rätt användar-id och lösenord. 2. Slå på analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. Kontrollera att instrumentet startar och är klart att användas. Om K-carriers från tidigare körning(ar) finns kvar i någon termocykler ska de tas bort med hjälp av K-carrier-transportören. 3. Öppna programmet AMPLILINK på datorn. Logga in med rätt användar-id och lösenord. 4. Om du vill skapa K-carrier-beställningar för de prover som ska analyseras klickar du på ikonen Orders. Välj fliken Sample och klicka sedan på knappen New och ange beställningsnumret för varje prov med hjälp av tangentbordet eller streckkodsläsaren. Välj testdefinitionsfilen för COBAS TaqMan CT Test, v2.0. Upprepa för varje prov. Klicka på knappen Save. OBS! Om färre än 24 rör ska köras måste positionerna 1, 2, 5, 20, 23 och 24 beläggas så att rätt balans åstadkoms på K-carriern i termocykeln. 5. Ange kvalitetskontrollinformation på fliken Quality Control i fönstret Orders. Klicka på knappen New och ange den information om COBAS TaqMan CT Test, v2.0 som medföljer kitet med hjälp av tangentbordet eller streckkodsläsaren. Ange lotnumret för COBAS TaqMan CT Test, v2.0, utgångsdatum, intervall för Low (+) Control samt kalibreringskoefficienter i angivna fält. Klicka på OK. 6. Tilldela körningen ett K-carrier-nummer genom att klicka på fliken K-Carrier i fönstret Orders. Klicka på New i fönstret K-Carrier. Skriv in K-carrier-numret från streckkoden på K-carrier i rutan till höger om K-Carrier ID med hjälp av tangentbordet eller en streckkodsläsare. Observera att resultat från tidigare körningar med samma K-carrier-id måste vara godkända. När samma K-carrier-streckkodsnummer har använts två gånger på samma analysinstrument måste resultaten från körningarna vara godkända, arkiverade och rensade innan samma streckkodsnummer kan användas igen. Välj testdefinition för COBAS TaqMan CT Test, v2.0 från testpanelen i fönstrets nedre del. 7. Välj den första raden i kolumnen Type (T) i arbetslistan (Worklist). Markera fältet så att du får åtkomst till rullistan och välj sedan önskad kontrolltyp. Dubbelklicka därefter i fältet för prov-id på samma rad. Fönstret LookUp Control visas med alla tillgängliga kontroller. När kontrollen väljs visas motsvarande kalibrerings- och kontrollvärden längst ned till höger i informationspanelen. Upprepa för alla kontroller som önskas. 8. Om du vill lägga till prover i arbetslistan (Worklist) dubbelklickar du på den första positionen (raden) för inmatning av prov. Fönstret Lookup Sample visas. Det innehåller de tilldelade provbeställningarna. Om du vill markera fler än ett beställningsnummer använder du skift- och piltangenterna. Bekräfta att alla beställningar har tilldelats testdefinitionen för COBAS TaqMan CT Test, v Spara K-carrier-beställningstilldelningen genom att klicka på Save. C. Amplifiering och detektion 1. Välj ikonen Systems på fliken System; öppna termocyklern genom att klicka på Open. När termocykelskyddet har öppnats helt och Ready to Load visas i fönstret Systems, lyfter du termocykellocket och håller det öppet. Flytta den laddade K-carriern som innehåller förslutna K-tubes eller K-tray med Working Master Mix och prover och kontroller till termocyklern med hjälp av K-carrier-transportören. Stäng termocyklerlocket. 2. Klicka på Start i fönstret Systems nedanför TC-ikonen så stängs termocyklerskyddet och körningen startas. 3. Amplifiering och detektion utförs automatiskt i analysinstrumentet COBAS TaqMan

12 RESULTAT Resultatberäkning Analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 bestämmer automatiskt om CT DNA detekteras eller inte för provet eller kontrollen. Analysinstrumentet COBAS TaqMan 48: Bestämmer cykeltröskelvärdet (Ct) för CT DNA och CT internkontroll DNA. Bestämmer om CT DNA detekteras baserat på Ct-värdena för CT DNA och CT internkontroll DNA. Validering Försäkra dig om att körningen är giltig genom att kontrollera om det förekommer flaggor eller kommentarer i utskriften eller i resultatfönstret i AMPLILINK-programmet v3.2. Körningen är giltig om inga flaggor visas för COBAS TaqMan CT-kontrollerna, v2.0. Följande resultat erhålls vid en giltig körning: Kontroll Resultat Betydelse Negativ kontroll Target Not Detected Kontrollen innanför intervallet Positiv kontroll 1 Positive Kontrollen innanför intervallet Körningen är inte giltig om någon av följande flaggor visas för COBAS TaqMan CT-kontrollerna, v2.0: CT negativ kontroll, v2.0: Flagga Resultat Betydelse _N_NC_INVALID Invalid Smitta eller ingen IC-signal CT positiv kontroll, v2.0: Flagga Resultat Betydelse _L_LPC_INVALID Invalid Kontrollen utanför intervallet, ingen målsignal eller ingen IC-signal Om körningen är ogiltig måste du upprepa hela körningen, dvs. prov- och kontrollextraktion, amplifiering och detektion. 12

13 Tolkning av resultat: Ta reda på om körningen är giltig genom att kontrollera varje enskilt prov avseende flaggor eller kommentarer på resultatutskriften. Tolka resultaten så här: En giltig körning kan innehålla båda giltiga och ogiltiga provresultat, beroende på om flaggor och/eller kommentarer erhålls för de enskilda proverna. Provresultaten tolkas på följande sätt: Flagga Resultat Betydelse Ingen flagga Target Not Detected C. trachomatis DNA ej påvisat. Provet antas vara negativt för C. trachomatis. Ett negativt resultat utesluter inte C. trachomatis-infektion eftersom resultaten är beroende av rätt provtagning, avsaknad av hämmare och tillräckligt med DNA. Ingen flagga 1 Positive C. trachomatis DNA påvisat. Provet är positivt för eller C. trachomatis. > 1 Positive _Q_RFITOOLOW > 1 Positive C. trachomatis DNA påvisat. Provet är positivt för C. trachomatis. _Q_QS_INVALID Invalid Hämmare. Om C. trachomatis DNA förekommer är det inte detekterbart. Extrahera en ny portion av det ursprungliga provet och upprepa testet. Hämmare är ofta labila, och prover som initialt är hämmade är kanske inte hämmade när de upprepas. Om det ursprungliga provet inte finns tillgängligt måste ett nytt prov tas. KVALITETSKONTROLL Ett replikat vardera av COBAS TaqMan CT ( )-kontroll, v2.0 och COBAS TaqMan CT (+)-kontroll, v2.0 måste ingå i varje testomgång. Liksom för alla nya laboratorieförfaranden bör nya användare överväga att använda ytterligare kontroller varje gång testet utförs tills de har fått tillräcklig erfarenhet av testet. Det finns inga krav avseende kontrollernas position i K-carriern. Kontrollera om det finns flaggor och kommentarer i utskriften så att du säkerställer att körningen är giltig. Negativ kontroll CT ( ) C, v2.0 måste ge ett Target Not Detected -resultat, dvs. Ct-värdet för CT DNA var ovanför gränsen för analysen eller inget Ct-värde erhölls för CT DNA, men ett giltigt Ct-värde erhölls för CT internkontrollen DNA. Om CT ( ) C, v2.0 inte uppfyller dessa kriterier är hela körningen ogiltig. Upprepa hela förfarandet (provoch kontrollextraktion, amplifiering och detektion). Om CT ( ) C, v2.0 är konsekvent ogiltig ska du kontakta din Roche-representant och begära teknisk hjälp. Positiv kontroll Det tilldelade intervallet för CT (+) C, v2.0 anges på värdekortet till COBAS TaqMan CT Test, v2.0. Resultatet av CT (+) C, v2.0 måste falla inom det intervall som indikeras på värdekortet till COBAS TaqMan CT Test, v2.0. Om den positiva kontrollen inte uppfyller kriterierna är hela körningen ogiltig. Upprepa hela förfarandet (prov- och kontrollextraktion, amplifiering och detektion). Kontakta din Roche-representant och begär teknisk hjälp om resultatet för den positiva kontrollen konsekvent ligger utanför det tilldelade intervallet. CT (+)-kontrollen, v2.0 innehåller ungefär 20 kopior/test av en C. trachomatis-plasmid DNA-sekvens. Det är ungefär fyra gånger analysens minsta detektionsnivå fastställd genom Poisson-analys. Amplifiering och detektion av CT (+)-kontrollen, v2.0 säkerställer att amplifiering skett. CT (+)-kontrollen, v2.0 övervakar inte testets amplifieringseffektivitet eller detektionsnivå. Internkontroll Internkontrollen är avsedd att identifiera prover som innehåller polymerashämmare. Användning av internkontrollen utesluter inte alla falskt negativa testresultat. 13

14 FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Liksom för alla testmetoder är det mycket viktigt att använda god laboratorieteknik för att denna analys ska fungera korrekt. Med hänsyn till testets höga analytiska sensitivitet är stor noggrannhet nödvändig så att kitets reagens- eller amplifieringsblandningar hålls rena. Renheten ska övervakas noga för alla reagens. Kassera reagenset i tveksamma fall. TESTETS BEGRÄNSNINGAR 1. Testa endast de angivna provtyperna. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 har utvärderats med pinnprover från livmoderhalsen som tagits i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-media (Remel, Inc.) och urinprover från kvinnor och män som tagits utan konserveringsmedel. Testning av andra provtyper har inte validerats för användning och kan resultera i falskt negativa eller falskt positiva resultat. 2. Detektion av C. trachomatis är beroende av antalet organismer i provet och kan påverkas av provtagningsmetoder, patientfaktorer (t.ex. ålder, STD-historik, förekomst av symptom), infektionsstadium och/eller smittande C. trachomatis-stam. 3. Falskt negativa resultat kan uppstå på grund av polymerashämmare. CT internkontrollen har lagts till i COBAS TaqMan CT Test, v2.0 för att möjliggöra identifiering av extraherade prover som innehåller ämnen som kan påverka PCR-amplifieringen med mer än 20 kopior/test. 4. Förekomst av klamydiainfektion i en population kan påverka resultatet. Positiva predikativa värden minskar när populationer med låg prevalens eller personer utan risk för infektion testas. Eftersom prevalensen av C. trachomatis kan vara låg i vissa populationer eller patientgrupper, kan ett falskt positivt värde på 4 5 % överstiga det sant positiva värdet så att det predikativa värdet för ett positivt test är väldigt lågt. Eftersom vissa patienter som är faktiskt smittade inte identifieras genom att ett enskilt prov testas, kan det faktiska värdet för falskt positiva prov inte fastställas eller förutsättas utifrån kliniska data. Hur stort antal falskt positiva testresultat som förekommer kan bero på erfarenhet, användarens kunskap, reagens- och provhantering eller andra liknande faktorer som gäller det enskilda laboratoriet. 5. Resultatens tillförlitlighet förutsätter rätt provtagning, transport, förvaring och extraktion av prover. Variabler som beror på förvaring har inte helt definierats. 6. Tillsats av AmpErase-enzym i Master Mix möjliggör selektiv amplifiering av target-dna. Kontaminering av reagens kan dock endast undvikas om god laboratoriesed tillämpas och de förfaranden som beskrivs i den här bipacksedeln noga följs. 7. Huruvida läkemedelsbehandling lyckas eller ej kan inte avgöras med detta test. 8. Liksom för alla diagnostiska test ska resultaten från COBAS TaqMan CT Test, v2.0 tolkas med hänsyn till alla kliniska fynd och laboratoriefynd. 9. Endast personer med erfarenhet av PCR-teknik bör använda produkten. 10. Provernas tillförlitlighet (för pinnprover) kan endast bedömas genom mikroskopisk visualisering av kolonnlika epitelceller i proverna. 11. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 rekommenderas inte för bestämning av misstänkt sexuellt utnyttjande eller för andra rättsmedicinska indikationer. 12. Ytterligare testning rekommenderas i alla de fall där falskt positiva eller falskt negativa resultat kan leda till negativa medicinska, sociala eller psykologiska följder. 13. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 ger kvalitativa resultat. Det finns inget samband mellan hur högt ett positivt elbow-värde är med COBAS TaqMan CT Test, v2.0 och antalet C. trachomatis-celler i ett infekterat prov. Testet detekterar endast C. trachomatis; inte C. psittaci, C. pneumoniae eller C. pecorum. 14. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 för urintestning på män och kvinnor bör utföras slumpmässigt på det första av urinstrålen (definierat som de första 10 till 50 ml av urinstrålen). Effekterna av andra variabler, t.ex. den första delen av strålen vs. mellanstrålen, efterstrålen osv. har inte utvärderats. 15. Effekterna av andra möjliga variabler, t.ex. vaginalflytning, användning av tamponger, sköljning osv. samt provtagningsvariabler har inte utvärderats. 16. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 är inte avsett att ersätta undersökning av cervix och provtagning från livmoderhalsen för diagnos av urogenital infektion. Patienterna kan ha infektion i livmoderhalsen, urinrörskatarr, urinvägsinfektion eller vaginala infektioner på grund av andra orsaker eller samtidigt pågående infektioner med andra agenser. 17. Den här produkten kan endast användas tillsammans med analysinstrumentet COBAS TaqMan Närvaron av PCR-hämmare kan orsaka falskt negativa eller ogiltiga resultat. 14

15 19. Interfererande ämnen inkluderar, men är inte begränsat till följande: Förekomst av slem i cervixprover kan hämma PCR och ge falskt negativa testresultat. Slemfria prover rekommenderas för optimala testresultat. Använd en torksudd eller en stor provtagningspinne för att avlägsna sekret och utsöndring från cervix innan provet tas 16. Prover som innehåller mer än 1 % (viktprocent) blod kan ge falskt positiva resultat. 20. Mutationer inom de maximalt konserverade regionerna på det kryptiska plasmid-dna eller kromosomalt DNA hos C. trachomatis som täcks av testets primers och/eller prob är visserligen sällsynta, men kan resultera i att närvaron av bakterier i det här fallet inte kan detekteras. 21. På grund av inneboende skillnader mellan metoder rekommenderas användaren, innan en metod byts ut mot en annan, att genomföra metodkorrelationsanalyser i laboratoriet för att bestämma skillnaderna mellan metoderna. ICKE-KLINISK EGENSKAPSUTVÄRDERING Analytisk specificitet: Specificiteten för COBAS TaqMan CT Test, v2.0 utvärderades genom tillsats av DNA från odlade celler, odlade virus eller plasmidkonstruktioner i CT/NG Specimen Preparation-reagens och testades med proceduren för COBAS TaqMan CT Test, v2.0. De organismer som testades innefattar många som kan isoleras från det urogenitala området. Ingen av följande organismer eller virus visade reaktivitet i COBAS TaqMan CT Test, v2.0: Achromobacter xerosis Lactobacillus acidophillus Acinetobacter Iwoffi Lactobacillus brevis Acinetobacter calcoaceticus Lactobacillus crisptus Acinetobacter sp. genospecies 3 Lactobacillus lactis lactis Actinomyces isrealii Lactobacillus oris Aerococcus viridans Lactobacillus parabuchnerri Aeromonas hydrophila Lactobacillus vaginalis Agrobacterium radiobacter Lactococcus lactis cremoris Alcaligenes faecalis Legionella bozemanii Bacillus thuringiensis Legionella pneumophila Bacillus subtilis Leuconostoc paramesenteroides Bacteriodes fragilis Micrococcus luteus Bacteroides caccae Moraxella osloensis Bifidobacillus longum Morganella morganii Bifidobacterium adolescentis Mycobacterium smegmatis Branhamella catarrhalis Mycoplasma hominis Brevibacterium linens Neisseria elongata Candida albicans Neisseria mucosa Chlamydia psittaci Neisseria perflava Chlamydia pneumoniae Neisseria polysaccharea Chromobacter violaceum Pasteurella maltocida Citrobacter freundii Pediococcus acidilactica Clostridium innocuum Peptostreptococcus magnus Clostridium perfringens Peptostreptococcus productus Corynebacterium genitalium Prevotella bivia Corynebacterium xerosis Prevotella corporis Cryptococcus neoformans Prevotella intermedia Deinococcus radiopugnans Propionibacterium acnes Derxia gummosa Proteus mirabilis Epstein-Barr-virus Providencia stuartii Eikenella corrodens Pseudomonas aeruginosa Enterobacter cloacae Pseudomonas putida Enterococcus avium Rahnella aquatilis Enterococcus faecalis Salmonella minnesota Enterococcus faecium Salmonella typhimurium Erysipelothrix rhusiopathiae Serratia denitrificans Escherichia coli Serratia marcescens Ewingella americana Staphylococcus aureus Flavobacterium meningosepticum Staphylococcus epidermidis 15

16 Gardnerella vaginalis Gemella haemolysans Gemella morbillorum Haemophilus influenzae Haemophilus ducreyi Herpes simplex-virus 1 Herpes simplex-virus 2 Humant papillomavirus typ 16 Humant papillomavirus typ 18 Kingella kingae Klebsiella pneumoniae ss ozaenae Streptococcus agalactiae Streptococcus anginosus Streptococcus bovis Streptococcus dysgalatia Streptococcus equinis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius Treponema pallidum Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Analytisk sensitivitet: renat DNA Vid bestämning av analytisk sensitivitet för renat DNA, visade COBAS TaqMan CT Test, v2.0 möjligheten att reproducerbart detektera ( 95 % positiva resultat) 5 eller fler kopior av renat C. trachomatis-dna per PCR-reaktion. Antalet kopior av det C. trachomatis-dna som användes i det här experimentet bestämdes genom Poisson-analys. Detektionsgräns: Icke-varianter av C. trachomatis-celler Detektionsgränsen för COBAS TaqMan CT Test, v2.0 bestämdes genom analys av spädningar av odlade C. trachomatis-celler i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-media (Remel, Inc.) och normal human urin. Minst 6 oberoende spädningsserier analyserades för varje matristyp. Totalt 144 replikat per koncentration analyserades för varje matristyp. Negativa nivåer analyserades med replikatstorleken 72. Resultaten från studien, som visas i tabell 1, visar att COBAS TaqMan CT Test, v2.0 genom probitanalys upptäckte C. trachomatis vid förutsedda koncentrationer på 3,9 IFU/ml eller större för både M4RT MicroTest odlingstransportsystem-media (Remel, Inc.) och urin med ett positivitetsvärde på 95 % eller högre. Parallella tester med COBAS TaqMan CT Test (v1.0) gav väldigt snarlika probitresulat, vilket indikerar samma känslighet för båda testerna. På grund av det varierande antalet inklusionskroppar i C. trachomatis-odlingar, är antalet livsdugliga organismer i C. trachomatis inte direkt relaterat till mängden amplifierbar CT target. 16

17 Tabell 1 Detektionsgräns för COBAS TaqMan CT Test, v2.0 med icke-varianter av C. trachomatis-celler Matris Panelnivå (IFU/ml) Panelnivå (IFU/PCR) Genomsnittlig CT-elbow Genomsnittlig IC-elbow Totalt giltiga N Positiva träffar % positiva M4RT 80 1,0 34,1 35, % M4RT 8 0,1 37,5 36, % M4RT 4 0,05 38,6 36, % M4RT 2 0,025 39,5 36, ,1 % M4RT 1 0, ,9 36, ,9 % M4RT , % 95 % probit-värde: 2,0 IFU/ml 95 % konfidensintervall: 1,7 2,6 Matris Panelnivå (IFU/ml) Panelnivå (IFU/PCR) Genomsnittlig CT-elbow Genomsnittlig IC-elbow Totalt giltiga N Positiva träffar % positiva Urin 20 1,0 36,2 36, ,3 % Urin 4 0,2 38,1 36, ,8 % Urin 2 0,1 38,5 36, ,5 % Urin 1 0,05 39,2 36, ,3 % Urin 0,5 0,025 40,3 36, ,6 % Urin 0,25 0, ,0 36, ,9 % Urin 0,125 0, ,9 36, ,2 % Urin , % 95 % probit-värde: 3,9 IFU/ml 95 % konfidensintervall: 2,9 5,9 Detektionsgräns: C. trachomatis nvct-celler (svensk variant) Detektionsgränsen för COBAS TaqMan CT Test, v2.0 bestämdes genom analys av spädningar av odlade C. trachomatis nvct-celler i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) och normal human urin. Minst 6 oberoende spädningsserier analyserades för varje matristyp. Totalt 144 replikat per koncentration analyserades för varje matristyp. Negativa nivåer analyserades med replikatstorleken 72. En 7-faldig till 10-faldig korrigeringsfaktor användes för att justera det slutliga probitresultatet för att kompensera för skillnaderna i målkopior mellan ompa-genen (1 kopia per cell) och kryptisk plasmid (från 7 till 10 kopior/cell). Resultaten från studien, som visas i tabell 2, visar att COBAS TaqMan CT Test, v2.0 genom probitanalys upptäckte C. trachomatis nvct (svensk variant) vid koncentrationer på 36,4 till 52 IFU/ml för M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) (i genomsnitt 44,2 IFU/ml) och 16,8 till 24 IFU/ml för urin (i genomsnitt 20,4 IFU/ml) med ett positivitetsvärde på 95 % eller högre. På grund av det varierande antalet inklusionskroppar i C. trachomatis-odlingar, är antalet livsdugliga organismer inte direkt relaterat till mängden amplifierbar CT target. 17

18 Matris Panelnivå (IFU/ml) Tabell 2 Detektionsgräns för COBAS TaqMan CT Test, v2.0 med C. trachomatis nvct-celler (svensk variant) Panelnivå (IFU/PCR) Genomsnittlig CT-elbow Genomsnittlig IC-elbow Totalt giltiga N Positiva träffar % positiva M4RT 80 1,0 35,1 36, ,0% M4RT 8 0,1 38,9 36, ,6% M4RT 4 0,05 40,0 36, ,3% M4RT 2 0,025 40,7 36, ,1% M4RT 1 0, ,8 36, ,9% M4RT , % 95 % probit-värde: (okorrigerat) 5,2 IFU/ml 95-procentigt konfidensintervall 4,4 6,7 95 % probit-värde (Target-kopia # med hjälp av 7-faldig korrigeringsfaktor) 95 % probit-värde (Target-kopia # med hjälp av 10-faldig korrigeringsfaktor) 95 % probit-värde (Target-kopia # med hjälp av genomsnittlig korrigeringsfaktor) Matris Panelnivå (IFU/ml) Panelnivå (IFU/PCR) 36,4 IFU/ml 95-procentigt konfidensintervall 30,8 46,9 52 IFU/ml 95-procentigt konfidensintervall ,2 IFU/ml 95-procentigt konfidensintervall 37,4 57,0 Genomsnittlig CT-elbow Genomsnittlig IC-elbow Totalt giltiga N Positiva träffar % positiva Urin 20 1,0 35,3 35, ,0% Urin 4 0,2 37,7 36, ,9% Urin 1 0,05 39,6 35, ,0% Urin 0,25 0, ,6 35, ,3% Urin 0,125 0, ,7 36, ,9% Urin , % 95 % probit-värde: (okorrigerat) 2,4 IFU/ml 95-procentigt konfidensintervall 1,8 3,4 95 % probit-värde (Target-kopia # med hjälp av 7-faldig korrigeringsfaktor) 95 % probit-värde (Target-kopia # med hjälp av 10-faldig korrigeringsfaktor) 95 % probit-värde (Target-kopia # med hjälp av genomsnittlig korrigeringsfaktor) 16,8 IFU/ml 95-procentigt konfidensintervall 12,6 23,8 24 IFU/ml 95-procentigt konfidensintervall ,4 IFU/ml 95-procentigt konfidensintervall 15,3 28,9 18

19 Inklusivitet En IFU per PCR från alla C. trachomatis-serovarer kan detekteras med COBAS TaqMan CT Test, v2.0. Kvantifierade ATCC-odlingar från 15 olika C. trachomatis-serovarer späddes i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) och normal human urin till koncentrationerna 80 IFU/ml respektive 20 IFU/ml. Koncentrationerna motsvarar en input på 1 IFU/PCR för båda matristyperna. Tjugotvå (22) replikat av varje matristyp för varje serovar behandlades med COBAS TaqMan CT Test, v2.0. Alla 15 serovarerna detekterades med 100-procentiga positivitetsvärden för varje matristyp. Reproducerbarhet I syfte att utvärdera reproducerbarheten hos COBAS TaqMan CT Test, v2.0 studerades två paneler bestående av fyra prover vardera, en som bereddes i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-media (Remel, Inc.) och den andra i normal human urin. Proverna preparerades från en kvantifierad ATCC-odling med C. trachomatis och förvarades frusna vid 80 C. Panelproverna preparerades vid CT-koncentrationer som utformats för att motsvara det lägsta antalet C. trachomatis-organismer som sannolikt återfinns vid odling av kliniska prover: 0, 0,5, 1,0 och 1,5 IFU till den slutliga PCR-reaktionen för prov från M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) och 0, 0,5, 1,0 och 2,0 IFU till den slutliga PCR-reaktionen för urinprover. Reproducerbarheten utvärderades genom flera reagensloter och instrument (användare). Varje användare utförde 5 dagars testning på vart och ett av tre reagenslot. De resultaten från studien sammanfattas i tabell 3 för behandlade prover för M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) och tabell 4 för behandlade urinprov. Negativa resultat erhölls med 100 % av de 270 CT-negativa proverna från varje matris. Den totala reproducerbarheten för M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) och urinprov sammanfattas i tabell 3 respektive 4. För båda matriserna var alla CT-positiva prover 100 % positiva i studien. Variationskoefficientvärden för CT-elbow var 2,3 % eller lägre för M4RT MicroTest odlingstransportsystem-mediereplikationer (Remel, Inc.) och 4,2 % eller lägre för urinreplikat, vilket påvisar god reproducerbarhet för kvalitativa resultat med testet. Tabell 3 Resultat för total reproducerbarhet för C. trachomatis-celler i M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) CT Target IFU/PCR Totalt antal giltiga replikat 0 IFU/PCR 0,5 IFU/PCR 1,0 IFU/PCR 1,5 IFU/PCR Positiva resultat i % 0 % 100 % 100 % 100 % Genomsnittlig CT elbow Minsta värde Högsta värde 0 35,3 34,3 33,7 0 32,5 31,3 31,4 0 39,1 37,1 37,8 Standardavvikelse 0 0,79 0,74 0,79 Variationskoefficient 0 2,2 % 2,2 % 2,3 % 19

20 Tabell 4 Resultat för total reproducerbarhet för C. trachomatis-celler i urin CT Target IFU/PCR Totalt antal giltiga replikat 0 IFU/PCR 0,5 IFU/PCR 1,0 IFU/PCR 2,0 IFU/PCR Positiva resultat i % 0 % 100 % 100 % 100 % Genomsnittlig CT elbow Minsta värde 0 35,7 35,0 33,8 0 34,1 33,2 31,9 Högsta värde 0 41,9 40,3 39,4 Standardavvikelse 0 1,02 1,35 1,41 Variationskoefficient 0 2,9 % 3,9 % 4,2 % Diagnostisk sensitivitet, diagnostisk specificitet och korrelation Egenskaperna hos COBAS TaqMan CT Test, v2.0 och BD ProbeTec ET Test (Becton Dickinson, Sparks, MD USA) jämfördes i en analys av pinnprover från livmoderhalsen med M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) och urinprover från friska och CT-infekterade patienter. Prover samlades in och testades på platser i Sverige med hög prevalens av den svenska stamvarianten (nvct). Totalt 758 urinprov (141 frusna, sparade urinprov och 617 nya urinprov) testades med COBAS TaqMan CT Test, v2.0 och BD ProbeTec ET Test. Två konsekvent ogiltiga prov togs bort från provurvalet. Den diagnostiska sensitiviteten för urinprover var 95,7 %. Den diagnostiska specificiteten var 99,8 %, och den totala procentandelsöverensstämmelsen (se tabell 5) för urinprover var 98,7% mellan COBAS TaqMan CT Test, v2.0 och BD ProbeTec ET Test. När resultaten delades upp efter kön (se tabell 6 och 7) var den diagnostiska sensitiviteten 95,9 % för prov från män och 95,5 % för prov från kvinnor {Fishers exakta test (p-värde ~ 1,0)}, den diagnostiska specificiteten var 99,8 % för prov från män och 100 % för prov från kvinnor {Fishers exakta test (p-värde ~ 1,0)}. Den totala procentuella överensstämmelsen var 98,8 % för prov från män och 98,4 % för prov från kvinnor {Fishers exakta test (p-värde 0,7165)}. Fishers exakta test indikerar inte några statistiskt viktiga skillnader i korrelation för prov från män, kvinnor eller det totala antalet urinprov mellan de två testmetoderna. Totalt 413 pinnprover från livmoderhalsen hämtade med M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel. Inc), (alla nya) testades med COBAS TaqMan CT Test, v2.0 och BD ProbeTec ET Test. Den diagnostiska sensitiviteten för pinnprover från livmoderhalsen med M4RT MicroTest odlingstransportsystemmedium (Remel, Inc.) var 96,0 %. Den diagnostiska specificiteten var 100 %, och den totala procentöverensstämmelsen (se tabell 8) för pinnprover från livmoderhalsen med M4RT MicroTest odlingstransportsystem-medium (Remel, Inc.) var 99,5 % mellan COBAS TaqMan CT Test, v2.0 och BD ProbeTec ET Test. Tabell 5 Sammanfattning av resultaten från COBAS TaqMan CT Test, v2.0 jämfört med BD ProbeTec ET Test med urinprover från friska och CT-infekterade patienter Samtliga urinprov N=758 BD ProbeTec ET Test Positiva Negativa Totalt Positiva CTM CT Test, v2.0 Negativa Totalt Diagnostisk sensitivitet = 202/211 = 95,7 % (95 % CI 92,0 %, 98,0 %) Diagnostisk specificitet = 546/547 = 99,8 % (95 % CI 99,0%, 100,0 %) Överensstämmelse för total procentandel = 748/758 = 98,7 % (95 % CI 97,6 %, 99,4 %) 20