Gaskromatografi. Laborationsrapport

Transkript

1 Gaskromatografi Laborationsrapport Ida Henriksson, Simon Pedersen, Carl-Johan Pålsson Analytisk Kemi, KAM010, HT 2012 Handledare Anna Said Institutionen för Kemi och Bioteknik Chalmers tekniska högskola Två kommersiella matoljor, en olivolja och en majsolja, analyseras med gaskromatograf för att ta reda på innehållet av mättade, enkelomättade respektive fleromättade fettsyror. Oljorna transesterifieras till fettsyrornas metylestrar och förs på en temperaturprogrammerad kolonn där fettsyraestrarna separeras och detekteras med en flamjonisationsdetektor. En intern standard, den syntetiska fettsyran heptadekansyra, tillsätts de båda proven före derivatiseringen. Två standardlösningar med mättade respektive omättade fettsyror analyseras också för att relatera analyternas retentionstider till specifika fettsyror och därmed identifiera dessa. Med hjälp av internstandarden räknas sedan förekomsten av fettsyrorna i oljorna fram.

2 Experimentell metod Upparbetning av prov Intern standard (heptadekansyra) vägdes upp i två vialer, 13,2 mg (prov 1) resp. 12,3 mg (prov 2). Till prov 1 sattes 0,1993 g olivolja och till prov 2 sattes 0,2025 g majsolja. Proven ställdes i ett värmeskåp, ca 90 ⁰C, för att internstandarden skulle lösas i oljan. En droppe av prov 1 och av prov 2 överfördes till var sin torr vial. Till dessa adderades 1,0 ml heptan, 0,5 ml dimetylkarbonat och 0,5 ml natriummetoxidlösning i metanol (0,5M) i tur och ordning. Rören vändes om några gånger och vilade sedan i 3 min. 1,5 ml vatten tillsattes proven. Rören vändes om några gånger och tilläts sedan fasseparera för att extrahera metylestrarna till heptanfasen. 0,1 ml av den övre (organiska) fasen från vardera prov sögs upp och fördes över till ny vial. De två proven späddes sedan med 1,0 ml heptan vardera, innan de analyserades i gaskromatografen. Injektion i GC Totalt fyra provlösningar om vardera 4 µl injicerades; prov 1 och 2 samt två standardlösningar med metylestrar av mättade och omättade fettsyror. Mellan varje injektion sköljdes sprutan med heptan fem gånger. Provlösningarna injicerades med en 10 µl spruta till en splitinjektor. Kolonnen, en kvartskapillär, var 15 m lång och 0.32 mm i diameter. Den stationära fasen var 25 µm tjock och av typ DB-23, och bärgasen som användes var vätgas vid 5 bar och 50 ml/min. Temperaturprogrammet som användes var enligt följande: I kolonnen initialt 110 ⁰C i 2 minuter, därefter en ökning med 14 ⁰C/min till 200 ⁰C. Denna sluttemperatur hölls sedan i ytterligare 2 minuter. I detektorn var temperaturen 230 ⁰C och i injektorn 180 ⁰C. Fyra kromatogram fås ut av detektorn som är av flamjonisationstyp. Topparnas area och t R noterades. Resultat Kromatogram De två standardlösningarna som kördes gav ett antal toppar vardera; fettsyrorna antogs eluera ordnat på deras längd, med fleromättade fettsyror eluerande senare än enkelomättade av samma antal kol. Standarderna gav kromatogram enligt tabellerna 1 och 2. Koncentrationen av respektive fettsyra i standarderna var given.

3 Tabell 1: Gaskromatografdata för standardlösning av mättade fettsyrametylestrar Metylester av fettsyra Topparea Koncentration i standard (g/l) relativt IS Kaprylsyra 1,411 59,139 0, ,418 1,305 Kaprinsyra 3, ,430 0, ,811 1,573 Laurinsyra 4,905 63,470 0, ,859 1,482 Myristinsyra 6,366 95,469 0, ,414 1,251 Palmitinsyra 7, ,464 0, ,511 1,178 Heptadekansyra 8,203 54,911 0, ,555 1,000 Stearinsyra 8,777 56,605 0, ,025 1,031 Arachinsyra 9,827 63,589 0, ,492 0,941 Behensyra 10,795 36,887 0, ,435 0,672 Tabell 2: Gaskromatografdata för standardlösning av omättade fettsyrametylestrar Metylester av fettsyra Topparea Koncentration i standard (g/l) relativt IS Palmitoleinsyra 7,760 49,363 0, ,693 1,360 Heptadekansyra 8,203 37,234 0, ,105 1,000 Oljesyra 8,859 32,670 0, ,380 0,976 Linolsyra 9,105 52,585 0, ,161 0,828 Linolensyra 9,417 27,560 0, ,780 0,743 Eikoseinsyra 9,893 26,512 0,269 98,558 0,627 Erukasyra 10,894 14,470 0,224 64,598 0,411 Topparna som gavs av provlösningarna identifierades sedan med hjälp av dessa data. Den relativa detektorresponsfaktorn användes för att beräkna den relativa förekomsten av varje fettsyra i ursprungsprovet, det vill säga i oljan. Tabell 2: GC-data för prov 1, olivolja. Syrorna identifierades med hjälp av retentionstider från standard. Topparea Identifierad syra Beräknad konc. (g/l) Massa analyt (µg) Relativ förekomst (%) 7,580 15,545 Palmitinsyra 0,041 0,163 5,66% 7,711 1,577 Palmitoleinsyra 0,004 0,0165 0,57% 8,154 8,550 Heptadekansyra 0,054 0,218-8,728 0,788 Stearinsyra 0,003 0,0108 0,37% 8,859 78,307 Oljesyra 0,523 2,09 72,54% 9,073 12,237 Linolsyra 0,113 0,454 15,74% 9,368 1,202 Linolensyra 0,014 0,0554 1,92% 9,745 0,902 Arachinsyra 0,004 0,0148 0,51% 9,860 1,195 Eikoseinsyra 0,019 0,0773 2,68%

4 Tabell 3: GC-data för prov 2, majsolja. Syrorna identifierades med hjälp av retentionstider från standard. Topparea Identifierad syra Beräknad konc. (g/l) Massa analyt (µg) Relativ förekomst (%) 7,596 21,047 Palmitinsyra 0,055 0,221 4,07% 8,187 11,679 Heptadekansyra 0,314 1,25-8,761 0,901 Stearinsyra 0,003 0,0124 0,23% 8,876 46,569 Oljesyra 0,311 1,24 22,91% 9,138 95,053 Linolsyra 0,881 3,53 64,93% 9,401 2,253 Linolensyra 0,026 0,104 1,91% 9,778 0,964 Arachinsyra 0,004 0,0158 0,29% 9,877 1,577 Eikoseinsyra 0,026 0,102 1,88% 10,877 1,364 Erukasyra 0,051 0,205 3,78% Om de omättade, enkelomättade och fleromättade fettsyrorna i varje prov summeras, fås följande procentandelar; inom parentes anges tillverkarens halt enligt förpackningen. Mättat Enkelomättat Fleromättat Olivolja 6,5 % (13 %) 75,8 % (77 %) 17,7 % (10 %) Majsolja 4,6 % (13 %) 28,6 % (28 %) 66,8 % (59 %) Slutsatser Man ser ovan att mätningarna gav en halt av enkelomättade fettsyror som stämde väl överens med tillverkarens specifikation. Dock stämde inte halterna av mättat och fleromättat fett mängden mättat fett har visats som mindre än i verkligheten, medan mängden fleromättat fett har registrerats som högre. Eftersom detektorresponsfaktorn för internstandarden heptadekansyra skiljer sig kraftigt mellan de två körningarna av standardlösningar, blir resultaten oprecisa när samtida beräkningar på mättade och omättade fettsyror görs. Halterna är ändå så pass rimliga att man kan anta att instrumenten fungerat tillfredsställande, och att mätfelen kommer av den mänskliga faktorn. Inkonsistens i injektionen kan ha bidragit, eftersom olika personer gjorde injektionerna från prov till prov.

5 Frågor 1. Vilka är de största skillnaderna i fettsyrasammansättning mellan de olika proverna? Den stora skillnaden är fördelningen mellan enkel- och fleromättade fettsyror. Proportionerna är nästan de omvända; majsolja innehåller en betydligt större andel fleromättat fett än olivolja. Halten mättat fett är nästan samma i de båda oljorna. 2. Vilka begränsningar har gaskromatografi, när det gäller vilka föreningar som kan bestämmas? Hur kan man lösa detta problem? Föreningarna måste vara någorlunda lättflyktiga för att kunna transporteras genom kolonnen. Dessutom krävs det att de är termiskt stabila vid gaskromatografens arbetstemperaturer. För att överkomma det förra problemet kan man derivatisera föreningar till att ha ett högre ångtryck, och det senare problemet kan delvis avhjälpas genom så kallad on-column-injektion. 3. Varför derivatiserar ni här och varför kan man vilja derivatisera i andra fall? Hur bör en optimal derivatisering vara? Föreslå ett reaktionsschema för den genomförda derivatiseringen. Dels hydrolyseras fettet för att frigöra fettsyrorna och låta dem analyseras var för sig; samtliga fettsyror konverteras sedan till respektive metylestrar för att höja deras flyktighet. En bra derivatisering ska inte förändra den relativa förekomsten av olika ämnen. Vidare ska den påverka alla analyter i samma utsträckning. Det måste också vara möjligt att separera de derivatiserade analyterna från ursprungsprovet. Reaktionen föreslås ske enligt figuren nedan: Anjonen som bildas av glycerolderivatet reagerar sedan med dimetylkarbonat (eller metanol?) för att regenerera metoxidjonen.

6 4. Vad är skillnaden mellan intern standard, extern standard och standardtillsats? En standard används för att kunna kvantifiera analyterna; utan standard finns ingen referens som relaterar kromatogrammet till analyternas koncentrationer. En intern standard tillsätts ursprungsprovet och prepareras (derivatiseras, späts et cetera) tillsammans med analyterna. Den måste kunna särskiljas från analyterna i kromatogrammet. En extern standard behandas separat från analyterna; om det inte finns möjlighet att identifiera standarden från analyterna i kromatogrammet körs den som ett eget prov. Standardtillsats används när provet innehåller okända, potentiellt störande, ämnen. Olika (kända) kvantiteter av analyten tillsätts till en serie prov och utifrån en serie mätningar kan förekomsten av analyt extrapoleras fram. 5. Av vilka anledningar kan man vilja ha en intern standard och hur väljer man intern standard? Hur uppfyller vårt ämne kraven på en intern standard? Den interna standarden används för att kunna bestämma koncentrationerna av analyterna genom att relatera topparean till en känd koncentration. Internstandarden väljs så att den går att särskilja från de andra ämnena på kromatogrammet och så att den påverkas likadant som analyterna av derivatiseringen. Heptadekansyra derivatiseras likadant som de andra fettsyrorna; det är en fettsyra med ett udda antal kol, något som inte förekommer naturligt. Det finns alltså ingen chans att standarden skulle kunna förekomma i provet innan tillsats. 6. Varför gav interna standarden inte samma topparea/invägd massa vid de olika analyserna? Kan bero på förluster i förbehandlingen; extraktionen kan ha varit olika effektiv till exempel. 7. Jämför ECD, FID och masspektrometri (MS) m.a.p. känslighet, selektivitet och andra egenskaper när de används som detektorer vid gaskromatografi. En ECD kan vara otroligt mycket känsligare än en FID, men är selektiv mot elektronegativa funktioner i molekyler. Den detekterar således framför allt halogener och halider. FID är mer generell och ger signal på de flesta brännbara substanser, inklusive flertalet kolväten. Masspektrometern är mycket generell och kan både detektera och identifiera de flesta föreningarna, men är mycket mindre känslig än ECD och dessutom dyr.