LABORATIONSHANDLEDNING

Transkript

1 LABORATIONSHANDLEDNING CELLBIOLOGI EN DELKURS INOM BASKURSEN FÖR BIOLOGI, DISTANSKURSEN VT 2008 INSTITUTIONERNA FÖR: CELL & MOLEKYLÄRBIOLOGI / MIKROBIOLOGI VÄXT- OCH MILJÖVETENSKAPER / VÄXTFYSIOLOGI ZOOLOGI / ZOOFYSIOLOGI

2 Växtcellens Anatomi... 4 Bakgrund...4 Snittning...4 Färgning...5 Uppgifter...5 Kloroplaströrelser, mikroskopering av vattenpest... 7 Utförande...7 Uppgifter...7 Utförande...7 Uppgifter...8 Laboration: Färgning av bakterier... 9 Mikroskopteori...9 Faskontrastmikroskop...9 OLIKA PREPARAT...10 Fixering...10 Preparat framställning...11 Färgämnen...11 Gramfärgning-prokaryoter...12 Teori...12 Material:...12 Utförande:...13 Sporfärgning-prokaryoter...14 Teori...14 Material:...14 Utförande:...14 Negativfärgning-prokaryoter...15 Teori...15 Material:...15 Utförande:...15 Metylenblå-färgning-prokaryoter...16 Teori...16 Material:...16 Utförande:...16 Laboration: Cellskellett...17 Inledning...17 Cellodling...17 Cellskelettet...17 Hur kan cytoskelettet undersökas?...18 Utförande...19 Genöverföring hos Escherichia coli...21 Teori...21 Konjugation...21 Material...22 Utförande...22 resultat...23 Renodling genom utstryk- FYRSTRYK...24 Teori

3 Utförande:...24 Kommentar:

4 BAKGRUND Växtcellens Anatomi Växter kan delas upp i två grupper, monokotyledoner (enhjärtbladiga) och dikotyledoner (tvåhjärtbladiga). Dessa två skiljer sig ifrån varandra på flera sätt, däribland när det gäller inre uppbyggnad. I denna laboration skall deras uppbyggnad studeras med snitt från blad och stam. Enkla preparat framställes från färskt växtmaterial och studeras i mikroskop både före och efter infärgning. Huvudvikt lägges på epidermis (med klyvöppningar), grundvävnad och ledningsvävnad (xylem, floem). Xylem transporterar vatten och mineraler uppåt från rötterna samt har en stödjande funktion medans floem är det vävnadssystem som transporterar socker och andra organiska näringsämnen. Vävnadernas utseende i olika växtorgan hos såväl monokotyledoner som dikotyledoner skall ritas av för att åskådliggöra hur växternas inre uppbyggnad kan se ut. Material Mikroskop Objektglas Täckglas Rakblad Färglösningar Pincett Pensel Frigolitbitar Petriskål Vatten Växter: Solros (Helianthus, dikotyledon) och majs (Zea, monokotyledon) SNITTNING För att kunna se hur växterna är uppbyggda måste man göra tunna snitt av dem. Det är viktigt att skära med sågande rörelser utan att trycka för hårt och med ett vasst rakblad. Om snitten ej skall studeras omedelbart lägg dem i en petriskål med vatten. Snittet läggs sedan på ett objektsglas tillsammans med en droppe vatten och täcks med ett täckglas. Börja sedan mikroskoperingen med lägsta förstoringen inställd. Gå sedan upp i förstoring för att tydligt se de olika celltyperna i de olika vävnaderna. Högsta förstoringen behövs i allmänhet inte användas. Det är inte heller nödvändigt att få ett tunt helt snitt genom hela vävnaden så länge det är tillräckligt för att studera utsendet. Börja med att göra ett tvärsnitt av stammen (d.v.s. en tunn skiva av stammen). Detta görs antingen med hjälp av frigolit enlig assistents anvisningar eller på fri hand. Då ett tillräckligt tunnt snitt har gjorts skall ledningsvävnaden i stammen synas i genomskärning (se bild nedan). Notera skillnaden i ledningsvävnadens organisation mellan mono- och dikotyledoner! Gör sedan epidermisavdrag längs med undersidan av blad både från mono- och dikotyledonen. För dikotyledonen kan dessa med fördel göras genom att riva av en bit av bladet. För monokotyledonen görs dessa genom att försiktigt böja bladundersidan och sedan försiktigt såga en tunn bit längs med undersidan. Assistenterna visar båda 4

5 metoderna. Studera skillnaden i cellernas utseende och hur cellerna ligger ordnade i epidermis. Studera också hur klyvöppningarna ser ut. FÄRGNING För att lättare särskilja olika cellslag eller vävnader kan preparaten färgas. Innan täckglas läggs på kan en droppe färglösning tillsättas. Denna får verka några minuter, varefter den sugs av och ersätts med vatten. Eventuellt kan färgning och avfärgning ske när snitten redan ligger under täckglaset genom att suga lösningen förbi snitten med hjälp av läskpapper. Handskas försiktigt med färgämnena då en del är giftiga. Kaliumjodid: färgar stärkelse blå-blåsvart. Metylgrönt-fuchsin: färgar cytoplasman röd, kärnor blå, förvedade väggar violetta och ej förvedade väggar blå-blågröna. Safranin: färgar förvedade (lignininnehållande) cellväggar röda. UPPGIFTER Börja med att studera bilderna i kompendiet av stammen och jämför ev. med bilderna i läroboken och bilder från assisteterna. Detta underlättar identifieringen av celler och vävnader i de preparat du skall framställa. Gör preparat av de organ angivna ovan. Mikroskopera och rita tydliga teckningar av de olika preparaten, så att det framgår om celler och vävnader ser olika ut och var de förekommer i förhållande till varandra. Identifiera de olika vävnaderna och celltyperna med hjälp av böcker och assistenter. Visa assistenterna dina teckningar när du fortfarande har preparaten kvar. Sätt ut beteckningar på de olika vävnaderna och celltyperna. Färga preparaten och upprepa mikroskoperingen. Stam av en tvåhjärtbladig växt, en dikotyledon, tvärsnitt, (Helianthus, solros) 5

6 Stam av en enhjärtbladig växt, en monokotyledon, tvärsnitt, (Zea, majs) 6

7 Kloroplaströrelser, mikroskopering av vattenpest Fotosyntesen är i cellen lokaliserad till en speciell organell som kallas kloroplast. Den är diskusformad och ca 8 µm lång och 3µm bred. Inuti finns alla pigment, elektrontransportörer och enzymer som behövs vid ljusenergins omvandling till kemisk energi såsom ATP, NADPH, kolhydrat, fett och protein. Hos vattenpest är bladen långt anpassade till ett liv under vatten. Bladuppbyggnaden är reducerad till två cellskikt. Detta gör det lätt att studera kloroplaster i levande celler. Material Vattenpest (Elodea) Objektglas Täckglas Mikroskop Jodlösning (2 g KI + 1 g I till 300 ml vatten) UTFÖRANDE Tag ett blad av en gren av vattenpest, som stått i mörker eller svagt ljus någon timme, och lägg det i en vattendroppe på ett objektglas. Lägg ett täckglas över. Observera i mikroskop kloroplasternas form och placering i cellerna. Då bladet utsätts för starkt ljus från mikroskoplampan kommer kloroplasternas orientering i cellerna att ändras så att deras ljusupptag minskar. De diskusformade kloroplasterna ordnar sig med så liten yta som möjligt mot ljuset. Detta medför minskat ljusupptag och därmed minskad risk för ljusskador, s k fotooxidation. Minska till svagt ljus innan skador uppstått och se om kloroplasternas orientering ändras. Stärkelse ger med jod blå-blåsvart färg. Tag ett nytt blad och skär av nederdelen av bladet så att du får en snittyta. Lägg en droppe jodlösning på ett objektglas och ett vattenpestblad i lösningen. Då jodlösningen bäst tränger in genom "bladnerven", måste bladets snittyta vara nere i lösningen. Efter några minuter läggs ett täckglas ovanpå bladet och du kan i mikroskopet se var stärkelse finns i cellen. UPPGIFTER Studera bladen av vattenpest. Var i cellen finns kloroplasterna? Varför finns dom just där? Vad händer då ni ändrar ljuset från starkt till svagt och från svagt till starkt? Efterinfärgning, var återfinns stärkelsen? Varför återfinns den just där? Blomfärgämnen Blommors kronblad kan innehålla flera typer av pigment. Ofta skiljer man på fettlösliga (däribland klorofyller och karotenoider) och vattenlösliga pigment. Här skall vi främst titta på de vattenlösliga pigmenten och deras egenskaper. De vanligaste är i färgskalan blått till rött, men det finns också gula. UTFÖRANDE Material Glaspetriskålar med lock 7

8 Filtrerpapper Droppflaskor med koncentrerad ammoniak. VARNING, hälsovådligt! Droppflaskor med koncentrerad saltsyra. VARNING, hälsovådligt! Kronblad från blommor Fukta filterpappret och lägg det i en petriskål. Lägg ett kronblad på pappret och sätt på locket. Gör i ordning tre sådana skålar. Flytta skålarna till ett dragskåp. Tillsätt sedan till skål nummer ett (undvik att droppa på bladet!) några droppar saltsyra och till skål nummer två några droppar ammoniak. Skål tre används som kontroll, alltså droppas ett par droppar vatten i den. Vänta till reaktion erhålls. Om bladen innehåller vattenlösliga pigment (flavonoider) förväntas ett färgomslag. De kan delas in på följande sätt: Flavoner, flavonoler, flavanoner och några till är oftast färglösa i sur miljö och gula i basisk. Vita blommor kan alltså bli gula i skålen med ammoniak. Antocyanidiner (t.ex. pelargonidin, delfinidin, cyanidin) är oftast röda i sur miljö och blå i basisk. UPPGIFTER Studera färgomslagen på era blommor. I vilken behandling ses störst omslag? Vad säger det om miljön i blommornas celler i normala fall? Vilka färgämnen verkar troligt att ni har i era blad? 8

9 Laboration: Färgning av bakterier MIKROSKOPTEORI Mikroskopets viktigaste delar utgörs av tre linssystem: kondensor, objektiv samt okular. Kondensorn riktar ljuset mot preparatet så det blir kraftigt belyst. Objektivet förstorar bilden av preparatet. Okularet gör bilden rättvänd samt förstorar något ytterligare. Den totala förstoringen är produkten av objektivets och okularets förstoringar. Det begränsande för ett ljusmikroskop är emellertid inte förstoringen utan upplösningsförmågan d.v.s. hur bra mikroskopet kan skilja på två punkter. Detta kan räknas fram matematiskt enl. d = våglängd NA K x NA o Där d är det kortaste avstånd mellan två punkter då man kan urskilja dem som två punkter och NA = numerisk apertur för kondensor respektive okular. Numerisk apertur får man från formeln: NA = n x sinα där n är brytningsindex för mediet mellan preparat och lins (oftast luft < 1,0) och α är objektivets halva öppningsvinkel (brukar anges på objektivet). Upplösningsförmåga (d) Öga 0,2 mm. Ljusmikroskop 0,2 µm Elektronmikroskop 0,1 nm FASKONTRASTMIKROSKOP Vill man betrakta ofärgade preparat som inte absorberar ljus speciellt bra, d.v.s. det är genomskinligt, kan man utnyttja s.k. faskontrast. Detta fenomen baserar sig på att ljusvågorna fördröjs något på sin väg genom preparatet, mera ju större brytningsindex och tjocklek preparatet har, jämfört med omgivningen. Denna fasskillnad kan man dock inte uppfatta med ögat. Med hjälp av en fasring i kondensorn och en fasplatta i objektivet kan man emellertid omvandla den uppkomna fasförskjutningen till en intensitetsskillnad i ljusstyrkan, som ögat sedan kan uppfatta. Från fasringen strömmar ljuset till objektivet där det sitter en ringformad fasplatta som motsvarar fasringen. Dessa två är centrerade till varandra så att det direkta ljuset avskärmas. Endast lite svagare "ströljus" lyser igenom till okularen. Preparat som är placerat 9

10 mellan kondensorn och objektivet böjer av ljuset olika mycket beroende på dess brytningsindex. När det är frågan om ofärgade celler kan man utgå från att ju tjockare cellen är ju kraftigare böjs ljuset av. Detta gör att runda celler klarar av att böja av det direkta ljuset tillräckligt mycket för att det skall passera fasplattan, vilket gör att de cellerna kommer att verka ljusa mot bakgrunden. OLIKA PREPARAT Levande bakterier studeras i regel ofärgade i sk hängande droppe eller i faskontrastmikroskop. Hängande droppe kan erhållas på följande sätt. En droppe av en flytande bakteriekultur eller av en uppslamning i vatten eller koksaltlösning från fast kultur placeras på mitten av ett täckglas. Ett urholkat objektglas lägges på täckglaset. Så vänder man snabbt på det hela så att droppen kommer att hänga fritt ner från täckglaset. I vanligt ljusmikroskop kan man sedan observera bakterien som på grund av ljusets brytning syns mörk mot ljus omgivning. En del bakterier, främst spirocheter, har emellertid så liten ljusbrytnings-förmåga att man ej kan iakttaga dem på detta sätt. Hängande droppe -preparaten lämpar sig så gott som enbart för observationer av bakteriernas rörelseförmåga och rörelsesätt. Det är ibland svårt att avgöra om den rörelse man iakttar verkligen är bakteriens egen rörelse och inte den s k Brownska rörelse, som uppstår hos mycket små droppar då de knuffas av vätske-molekylerna. Hos mycket snabbt rörliga bakterier kan rörelsen ibland iakttagas bättre om metylcellulosa sätts till suspensionen. Rörelsen bromsas av den ökade viskositeten. FIXERING I faskontrastmikroskop kan även form, storlek och vissa cellstrukturer iakttas hos den levande cellen. Metoden ger emellertid ingen uppfattning om den kemiska sammansättningen av de strukturer man observerar. Detta uppnås däremot genom färgning med selektiva färgämnen. Men eftersom celler avgränsas utåt av cellmembranen, ett permeabilitetshinder, som utestänger flertalet färgämnen - även inuti celler finns barriärer mot fri diffusion - kan färgämnesmolekylerna inte nå cellens inre förrän membranerna förstörts. Detta sker genom den s k fixeringen. Observationerna kommer alltså att göras på döda, eller i varje fall skadade, celler. Vid fixeringen fälls cellens proteiner ut in situ, så att respektive strukturer stabiliseras och fastläggs i cellen. Man kan använda värmefixering eller kemisk fixering. Jämfört med den kemiska fixeringen (t ex OsO 4, vid färgning av kärnekvivalenter) är värmefixeringen en ganska grov metod men snabb och fullt tillfredsställande vid rutinmässig bakteriefärgning. Fixering förbättrar även bildens upplösning vid användning av oljeimmersion. Utfällt protein har nämligen ett brytningsindex som är nästan lika stort som immersionsoljans brytningsindex (1.52) medan proteinlösningar (cytoplasma) har ett betydligt lägre brytningsindex (ca 1.35). Resultatet blir att fixerade celler syns mycket klarare i immersionen och möjliggör också en mera detaljerad observation av deras färgade delar (strukturer). 10

11 PREPARAT FRAMSTÄLLNING Preparatframställningen tillgår så: En liten del av en ytkoloni på ett agarsubstrat överförs med steril platinaögla till ett väl rengjort objektglas. Provet rörs ut i en droppe destillerat vatten. Det är viktigt, att denna bakterieuppslamning inte görs för tät, den bör endast vara svagt grumlig. Uppslamningen stryks ut som en tunn film över ett litet parti av objektglaset, får lufttorka. Bakterierna värmefixeras genom att glaset förs med preparatsidan uppåt genom ej sotande gaslåga, 2-3 gånger. Vill man förvara ett preparat en längre tid, bäddar man in cellerna i ett inbäddningsmedium t ex glycerolgelatin. Detta kan göras antingen cellerna är ofärgade eller färgade. FÄRGÄMNEN Många färgämnen utgörs av salter. De brukar indelas i s k "sura" och "basiska" färgämnen. De "basiska" har färgad katjon, anjonen är klorid, sulfat, acetat, oxalat o s v; "sura" färgämnen är salter av färgad anjon och metallkatjon (t ex natrium, kalium, kalcium och ammonium) Den färgade an- eller katjonen kan så bilda salt med olika cellkomponenter. I celler av högre organismer färgas kärnorna lättast av "basiska" färgämnen genom deras bindning till nukleinsyran. Cytoplasman färgas lättare av "sura" färgämnen. Bakterierna med mindre differentiering mellan kärna och cytoplasma färgas i allmänhet tämligen jämt av "basiska" färgämnen. I bakteriologin används företrädesvis "basiska" färgämnen. Det finns emellertid även icke salt-bildande färgämnen. Generellt kan varje färgad förening som reagerar med, adsorberas av, eller löses i en annan fas så att denna fas färgas, betecknas som färgämne. Vanligtvis är den fasen som färgas fast. Men de s k fettämnena, som används för att färga fettdroppar i biologiskt material, färgar såväl flytande som fast fas. Det fixerade preparatet övergjuts med den önskade färglösningen som får inverka en bestämd tid, varefter lösningen hälls av och preparatet sköljs fritt från överskottsfärg med vatten eller annan vätska, eventuellt kontrastfärgas, allt i enlighet med föreskrifterna för de olika färgningsmetoderna. 11

12 TEORI GRAMFÄRGNING-PROKARYOTER Denna färgreaktion har fått sitt namn efter dansken Christian Gram, som 1884 upptäckte den av en ren slump, då han färgade bakteriekontaminerade vävnadssnitt med gentianaviolett. Reaktionen möjliggör en indelning av bakterier i två grupper. Dels de s k Grampositiva, och dels de s k Gramnegativa organismerna. Att så är fallet beror på att kristallviolett, som ingår i gentianaviolett, inuti celler komplexbinds till I 2 då Lugol s lösning (KI-I 2 ) tillsättes. När sedan cellerna sköljs med alkohol (eller aceton) spolas i vissa celler detta komplex bort, medan det i andra inte gör det. De förra kallas Gramnegativa och är, efter kontrastfärgning med karbolfusin eller saffranin, röda. De senare kallas följaktligen Grampositiva och är, eftersom kristallviolett-i 2 -komplexet är kvar i cellen, violetta. Orsaken till fenomenet är inte klarlagt men de olika resultaten antas bero på skillnader i bakteriernas cellväggar. Hos de Grampositiva cellerna antas väggarnas porer vara så små att färgkomplexet, sedan det bildats i cellen, ej kan sköljas ut. Många anser att dessa porer till och med krymper vid alkoholbehandling. De Gramnegativa bakterierna har däremot visat sig ha ett betydligt glesare peptidoglukanskelett. Dessutom innehåller de både lipoproteiner och lipopolysackarider, som lätt löses och spolas bort under inverkan av alkoholen, så att "luckor" bildas i väggen, genom vilka färgkomplexmolekylerna sedan kan sköljas ut. För att ej förlora det diagnostiska värdet av Gram-reaktionen bör den alltid utföras på unga celler (vanligen odlade över natten) eftersom äldre celler nästan genomgående är Gramnegativa oavsett om bakteriearten ifråga är det eller inte. Till sist skall påpekas att denna färgreaktion inte är typen "antingen eller". En organism kan således vara mer eller mindre Grampositiv eller Gramnegativ. Andra åter kan stå på gränsen mellan positiv eller negativ reaktion (Gram-variabla). MATERIAL: Övernattkultur av Macrococcus carouselicus på agarplattor Övernattkultur av Escherichia coli på agarplattor Kristallviolettlösning (färdigberedd) Lugol s lösning (färdigberedd) Saffranin (färdigberedd) Alkohol/aceton 70% /30% Beredning av färglösningar (finns färdigberedda): Kristallviolett: 5 ml 10%-ig lösning av kristallviolett i 96%-ig alkohol blandas med 100 ml 5%-ig fenollösning i vatten. Lugol s lösning: 1 g I 2 och 2 g KI löses i 5-10 ml dest vatten, som därefter spädes till 300 ml med dest vatten. Saffranin: 5 g Saffranin löses i 1000 ml dest vatten. (Lösningarna finns färdigberedda) 12

13 UTFÖRANDE: 1. Fixerade preparat görs av de bägge organismerna tillsammans på samma objektsglas enligt moment a-d, på så vis kan infärgningen av de två organismerna lätt observeras och särskiljas. a. Sätt en liten droppe dest. vatten m.h.a en pasteurpipett på ett rent objektglas b: Tag med steril platinaögla försiktigt litet cellmassa först från den ena agarplattan och sedan från den andra och slamma upp i droppen. OBS BRÄNN AV ÖGLAN MELLAN SÅ ATT DUINTE BLANDAR BAKTERIERNA PÅ PLATTORNA!! Bred, med öglan, ut droppen över en yta av ca 1 x 2 cm så att en vätskefilm snarare än en droppe erhålls c: Låt preparatet lufttorka d: Värmefixera genom att föra objektglaset, med preparatsidan upp, 3-4 gånger genom brännarens låga 2. Droppa på kristallviolett, som får verka 1 min 3. Färgen sköljs av under rinnande vatten 4. Täck med Lugol s lösning och låt den verka i 2 min 5. Skaka av lösningarna 6. Låt alkohol-aceton rinna över preparatet tills det ej längre avger någon färg 7. Skölj under rinnande vatten 8. Kontrastfärga, dvs låt saffranin verka på preparatet i 1 min 9. Skölj under rinnande vatten 10. Torka av undersidan av objektglaset 11. Låt preparatet lufttorka en del. 12. Vid behov, förse preparatet med en droppe olja och täck med ett täckglas och observera i mikroskop 13

14 TEORI SPORFÄRGNING-PROKARYOTER Bakteriernas endosporer är extremt inerta i sitt förhållande till omgivningen vad gäller faktorer som temperatur, torka och strålning. Till detta kommer en hög motståndskraft mot antibiotika och kemisk påverkan. Framförallt den senare egenskapen, och det faktum att sporens vägg är så gott som ogenomtränglig för vatten, gör att betydligt kraftigare medel måste tillgripas för att färga den, än de metoder som används vid färgning av vegetativa celler. Det är således vanligt att preparat för sporfärgning fixeras hårdare och utsätts för påverkan av färgämnet inte bara för längre tid, utan också vid högre temperatur än preparat av vegetativa celler. Här skall det basiska färgämnet malakitgrönt (egentligen dess klorid) användas, varvid också de celldelar, som eventuellt omger sporen, liksom andra vegetativa celler utan sporer, färgas. Men dessa strukturer avfärgas, i motsats till sporer, lätt då preparatet sköljs i vatten och kan kontrastfärgas med t ex saffranin, varvid sporer framstår som gröna mot övriga strukturer, som då är röda. MATERIAL: Bacillus subtilis på agarplattor Malakitgröntlösning (färdigberedd) Saffraninlösning (färdigberedd) Finns färdigberedd(malakitgröntlösning: Lös 5 g malakitgrönt i 100 ml dest vatten) UTFÖRANDE: 1. Sätt en liten droppe dest. vatten på ett rent objektglas 2. Tag med steril platinaögla litet cellmassa från agarplattan och slamma upp i droppen. Bred, med öglan, ut droppen över en yta av ca 1 x 2 cm så att en vätskefilm snarare än en droppe erhålls 3. Låt preparatet lufttorka 4. Fixera kraftigt genom att föra objektglaset 5-10 gånger genom brännarens låga 5. Lägg en liten bit läskpapper (1x2 cm) på preparatet och dränk in med malakitgröntlösningen. Obs! Använd bänkpapper. Malakitgrönt är mycket svårt att få bort 6. Värm över brännaren i 5 min så att ånga utvecklas. Vätskan får emellertid inte koka, och för att hindra uttorkning av preparatet ersätts då och då dunstad vätska genom pådroppning av ny färglösning 7. Tag bort läskpappret med en pincett från preparatet. Skölj i rinnande vatten i ca 30 sek så att överskottsfärg försvinner. Tvätta därefter bort alla färgstänk med 70 % EtOH på bänkar mm. 14

15 8. Kontrastfärga med 0.5%-ig saffraninlösning i 1 min. 9. Skölj försiktigt under rinnande vatten 10. Låt preparatet lufttorka en del. 11. Torka av undersidan av objektglaset 12. Förse preparatet en droppe olja och täck med ett täckglas och observera i mikroskop TEORI NEGATIVFÄRGNING-PROKARYOTER Cellerna blandas med ett färgämne som ej eller endast långsamt tränger in i cellerna. Omgivningen kommer att färgas gråsvart medan cellerna förblir ofärgade. Fördelen med negativ färgning är att cellerna påverkas i liten utsträckning - de förblir levande - och bakteriernas morfologi förblir således intakt. Även kapsel kan lätt påvisas. Kapsel förekommer hos en del bakterier men uttrycks endast under speciella betingelser. Några vanliga kapsel bildande bakterier är patogena och man tror att detta ger bakterierna ett skydd mot immunförsvaret. MATERIAL: 10%-ig nigrosinlösning i droppflaska Bacillus megaterium och Macrococcus carouselicus på agarplattor UTFÖRANDE: 1. En droppe vatten blandas med bakterierna, som sedan blandas med en droppe nigrosinlösning på ett objektglas. Blandningen stryks ut till ett tunt skikt. Blanda gärna båda bakterierna på samma objektsglas 2. Luta preparatet och låt det lufttorka 3. Sätt på en droppe olja där färgen ej är för tjock och studera preparatet med 100x-objektivet. Cellerna syns i relief som ofärgade mot en mörkgrå bakgrund 15

16 TEORI METYLENBLÅ-FÄRGNING-PROKARYOTER Metylenblått (ett tiazinderivat) hör till de basiska färgämnena, varför det således är dess katjon som är färgad. Sedan färgämnet trängt in i cellen, binds det lätt till strukturer med negativa laddningar, t ex DNA och RNA. Då dessa substanser, vid arbete med bakterier, förekommer fördelade i hela cytoplasman, blir också cellen blå. Vid det förfarande som beskrivs nedan, med fixerade och membranskadade bakterier, färgas givetvis samtliga celler likadant. Men det faktum att celler med intakta membran ej tar upp färg utnyttjas ibland för att skilja levande och döda celler åt, varvid endast de senare färgas. MATERIAL: Övernattskultur av Bacillus megaterium eller annan bakterie på agarplattor Metylenblålösning (färdigberedd) Beredning av färglösning (finns färdigberedd): 30 ml av en mättad metylenblålösning (1,6 g/100 ml 96% alkohol) blandas med 100 ml 0, 01% KOH-lösning i vatten. UTFÖRANDE: 1. Sätt en liten droppe dest. vatten m.h.a en pasteurpipett på ett rent objektglas 2. Tag med steril platinaögla litet cellmassa från agarplattan och slamma upp i droppen. Bred, med öglan, ut droppen över en yta av ca 1 x 2 cm så att en vätskefilm snarare än en droppe erhålls 3. Låt preparatet lufttorka 4. Värmefixera genom att föra objektglaset, med preparatsidan upp, 3-4 gånger genom brännarens låga 5. Täck preparatet med färglösning och låt den verka i (ca) 3 min 6. Skölj försiktigt bort överskottsfärgen i rinnande destillerat vatten 7. Låt preparatet lufttorka en del. 8. Torka av undersidan av objektglaset 9. Vid behov förse preparatet med en droppe olja och täck med ett täckglas och observera i mikroskop (Se figur) (Oljedroppe till 100x förstoring) oljedroppe preparat täckglas objektsglas 16

17 Laboration: Cellskellett INLEDNING CELLODLING Cellodling är idag en standardmetod med vidsträckt användning. Det är möjligt att odla många olika typer av celler, men långt ifrån alla. Så är t ex fibroblastlika celler lättodlade, medan vissa typer av högt differentierade celler - t ex nervceller - i princip är omöjliga att hålla i kultur. När en cellkultur etableras kommer cellerna att anpassa sig till en artificiell miljö, och de kommer att förlora många egenskaper som de har i en normal vävnad. Man måste därför hela tiden hålla i minnet att en odlad cell inte är en normal cell. Den kan tjäna som en modell för en normal cell, men det är en modell som kanske inte alltid går att använda. I laborationerna används fibroblaster ifrån Afrikansk klogroda Xenopus laevis. Cellerna har hållits länge i odling och kan betraktas som i princip odödliga. Celler odlas i ett näringsmedium innehållande salter, aminosyror, kolhydrater, vitaminer, buffertsystem och ph-indikator (fenolrött, ger den röda färgen). Detta räcker normalt inte, utan mediet kompletteras med 5-20% blodserum som innehåller både kända och okända hormoner och tillväxtfaktorer. I laborationen används standardmediet Leibovitz L-15 (L-15) kompletterat med 10% blodserum från fetal kalv (Fetal Calf Serum, FCS), samt penicillin och streptomycin för att förebygga bakteriekontamination. CELLSKELETTET I de kärnförsedda (eukaryota) cellerna finns ett cytoplasmatiskt nätverk bestående av fibrillära proteiner, som med ett gemensamt namn kallas cytoskelett. Detta cytoskelett består huvudsakligen av mikrotubuli, intermediära filament och mikrofilament. Mikrotubuli består av: Tubulin och mikrotubuliassocierade proteiner (MAP's). Mikrotubuli finns i alla celler i kroppen. Den välkända kärnspolen som förflyttar kromosomerna till vardera dottercellen vid celldelning är uppbyggd av mikrotubuli. Transporten i ett axon sker med hjälp av mikrotubuli. Det karaktäristiska 9+2-mönstret i cilier och flageller består av mikrotubuli. Många fiskar har s.k. melanoforer, det vill säga celler som innehåller svarta pigmentkorn. Dessa pigmentkorn transporteras m.h.a. mikrotubuli inom cellen, vilket gör att färgförändringar av fisken kan ske. När alla pigmentkorn transporterats in till cellcentrum (aggregerar) ges ett ljust intryck och när pigmenten sprides i hela cellen (dispergerar) ser fisken mörkare ut. Intermediära filament är ett samlingsnamn på fibrillära proteiner som är något tunnare än mikrotubuli. Vad de består av beror på vilken slags cell det gäller. Grovt uttryckt kan man säga att i epitelceller består de av keratin, gäller det muskelceller är det desmin, i mesenkymala celler (inre organ och bindväv) är det främst vimentin och i nervceller neurofilament. Men eftersom verkligheten är väldigt komplicerad kan två 17

18 eller flera typer av intermediära filament förekomma i samma cell. Vad man vet i dag så är det mest en stödjande struktur i cellen. Mikrofilament (alt. stressfilament, aktinfilament, tunna filament m.m.) består framförallt av proteinet aktin, som bildar långa tunna "trådar" i cellen. Aktin har bindningsställen för ett flertal olika proteiner, mest känt är bindningen till myosin i muskelceller. Mikrofilament kan också vara sammanbundna inbördes till ett tredimensionellt nätverk vilket ger cytoplasman en gelartad konsistens. HUR KAN CYTOSKELETTET UNDERSÖKAS? Skall man studera levande material kan man i princip bara använda ljusmikroskopi, men eftersom cellen i levande tillstånd nästan alltid är transparent måste man använda optiska tekniker för att se cellen, t.ex. faskontrast eller differential interferenskontrast. Dessa tekniker ger emellertid inte den kontrast och upplösning som krävs för att studera alla cellkomponenter. Vill man studera inre strukturer måste cellen fixeras och färgas med lämplig metod som förstärker intrycket av den aktuella strukturen. Man kan använda en färglösning som bara färgar speciella strukturer t.ex. DNA, kärnmembran etc. En vanlig metod numera är att använda antikroppar mot den strukturen man är intresserad av. I laborationen används fibroblast celler ifrån Xenopus och CHSE-celler som är epitellika embryonala celler från en Stillahavslax, "Chinook salmon" (Oncorhynchus tshawytschka). Cellernas mikrotubuli skall detekteras med antikroppar riktade mot tubulin. Mikrotubuli-antikropp komplexet visualiseras med hjälp av ett antikroppskonjugerat enzym som ger en färgad fällning. Vidare göres en ospecifik proteininfärgning med Coomassie Brilliant Blue som jämföres med antikroppsfärgningen. Vill man betrakta ofärgade preparat som inte absorberar ljus speciellt bra, d.v.s. det är genomskinligt, kan man utnyttja s.k. faskontrast. Detta fenomen baserar sig på att ljusvågorna fördröjs något på sin väg genom preparatet, mera ju större brytningsindex och tjocklek preparatet har, jämfört med omgivningen. Denna fasskillnad kan man dock inte uppfatta med ögat. Med hjälp av en fasring i kondensorn och en fasplatta i objektivet kan man emellertid omvandla den uppkomna fasförskjutningen till en intensitetsskillnad i ljusstyrkan, som ögat sedan kan uppfatta. Från fasringen strömmar ljuset till objektivet där det sitter en ringformad fasplatta som motsvarar fasringen. Dessa två är centrerade till varandra så att det direkta ljuset avskärmas. Endast lite svagare "ströljus" lyser igenom till okularen. Preparat som är placerat mellan kondensorn och objektivet böjer av ljuset olika mycket beroende på dess brytningsindex. När det är frågan om ofärgade celler kan man utgå från att ju tjockare cellen är ju kraftigare böjs ljuset av. Detta gör att runda celler klarar av att böja av det direkta ljuset tillräckligt mycket för att det skall passera fasplattan, vilket gör att de cellerna kommer att verka ljusa mot bakgrunden. Mycket platta delar av cellen (t.ex. lamellopodier) kommer inte att kunna böja det starka direkta ljuset utan endast det svagare ströljuset, vilket medför att de blir mörkare än bakgrunden. 18

19 UTFÖRANDE A. Infärgning av proteiner med Coomassie Brilliant Blue R 1. Hämta en cellodlingsskål med Xenopus fibroblaster på täckglas. Cellerna växer på glasets översida. 2. Sug bort mediet med pasteurpipett. 3. Fixering: Fyll på ett par ml kall metanol ( C) i 6 min. Sug bort metanolen med pasteurpipett Skölj därefter i PBS (Phosphate Buffered Saline) minst 2x2 min. 4. Färgning: Sug bort PBS-lösningen. Häll på så mycket Coomassie färglösning att det täcker glaset. Låt stå 2-3 minuter inte mer. 5. Sug bort färglösningen och skölj i PBS 3 x 5 min. 6. Skölj i kranvatten i skålen 7. Montera på objektsglas med en droppe vatten. Montera på samma sätt ett rent täckglas ovanpå täckglaset med celler. Torka mycket försiktigt bort överskott av vätska. Identifiera cellerna i mikroskopet. B. Mikroskopi Monterade preparat erhålles av assistenten. Dessa celler är infärgade med antikroppar mot tubulin enligt metoden på nästa sida. Jämför med preparatet som färgats med Coomassie Blue enligt ovan. Notera vilka skillnader som finns mellan preparaten. * Studera preparaten under mikroskopet, börja med 10x förstoring och öka efterhand förstoringsgraden. När man ändrar förstoringen kan man behöva justera ljustyrkan och aperturbländaren. Ser alla celler likadana ut? Kan du se några organeller? Några mitoser? * Vilka strukturer i cellen kan du se / inte se med ljusmikroskop? Hur ser cellkärnan ut? Har cellerna utskott? Ser du någon mitos? C. Egna celler 1. Skrapa med en tandpetare någonstans i munepitelet, smeta ut avskrapet på ett objektglas. Lägg på en droppe PBS och ett täckglas. Studera med 19

20 faskontrastmikroskopi (20x). Titta på cellerna med och utan fasbländaren (experimentera med fasbländarens läge och försök få en sidobelysning som gör att du kan urskilja cellerna). D. Faskontrastmikroskopi 1. Hämta en cellodlingsskål med Xenopus fibroblaster på ett täckglas. Cellerna växer på ovansidan av täckglaset. Plocka försiktigt upp täckglaset med en pincett och lägg det med cellsidan nedåt på ett objektsglas i en droppe PBS. Lägg sedan ett rent täckglas (ev. med en droppe PBS) ovanpå det första för att förhindra att salterna från cellodlingsmediet kristalliserar. Torka mycket försiktigt bort överskott av vätska. 2. Studera med och utan faskontrastmikroskopi, jämför med moment C. Färdiga preparat är färgade enligt nedan: Cellodlingsskålar med RTG2 eller CHSE-celler som växer på täckglas används för infärgningarna. 1. Fixering: Placera täckglaset med celler i C metanol i 6 min. Skölj därefter i PBS minst 2x2 min. 2. Färgning: Inkubera täckglaset i % H 2 O 2 i 15 min i mörker, detta för att reducera eventuell endogen peroxidasaktivitet. 3. Skölj i PBS, 3 x 5 min i petriskål. 4. Inkubera med primär antikropp (mus-anti-β-tubulin kyckling ) genom att lägga 1-2 droppar i odlingsskålens lock. Lyft försiktigt upp täckglaset med en pincett och håll det mot en Kleenex-duk så att överskottsvätska sugs av. Placera täckglaset på droppen med cellsidan nedåt. Töm skålen och använd den som lock, så att man får en liten fuktkammare. Låt stå minst 60 minuter. 5. Skölj i enligt punkt Inkubera med sek. antikropp (får-anti-mus) 30 min. Samma förfarande som punkt Skölj enl. punkt Blanda till färsk reagenslösning (väteperoxid + substrat DAB i buffertlösning). 9. Sug av PBS-lösningen och häll på reagenslösning och inkubera ca. 30 min. i mörker. 10. Skölj försiktigt i en petriskål med vatten. 20

21 Genöverföring hos Escherichia coli TEORI Bakterier kan erhålla nya egenskaper genom slumpvisa mutationer eller genom överföring av genetiskt material. Överföringen av det genetiska materialet kan i sin tur ske via tre olika mekanismer: Konjugation, överföring genom direkt kontakt mellan bakterier. Transformation, upptag av fritt DNA från omgivningen. Transduktion, överföring med hjälp av bakteriofager. Dessa tre mekanismer förekommer naturligt, om än inte hos alla typer av bakterier, och används på laboratoriet bland annat för att genetiskt modifiera bakterier. Vi kommer att undersöka konjugation. KONJUGATION Konjugation hos bakterier innebär att genetiskt material överförs från en bakterie till en annan via fysisk kontakt. För att konjugation skall vara möjlig krävs cell till cell kontakt mellan en donatorbakterie och en mottagarbakterie. Donatorbakterien har en F-plasmid som innehåller informationen för genöverföring. F-plasmiden öppnas i orit (origin of transfer) och den ena DNA-strängen överförs linjärt till mottagarbakterien samtidigt som den replikeras. Om hela F-plasmiden överförs blir mottagaren F +. F-plasmiden kan inkorporeras i kromosomen. Vid konjugation från en sådan stam, en såkallad Hfr-stam (Hfr= High frequency of recombination), kan gener ur kromosomen överföras till mottagaren. Eftersom konjugationen är en ömtålig process sker ofta spontana avbrott av kromosomöverföringen innan hela kromosomen är överförd till mottagarbakterien. Tabell 1. De bakteriestammar, faglysat och plasmider som används i laborationen. Delmoment Beteckning För laborationen relevant genotyp Stam # Konjugation E.coli MC4100 F -, strep r, tet s, cam s, 1 E.coli BW7620 Hfr, tet r, strep s 2 E.coli LM129 F +, cam r, strep s 3 De förändrade mottagarbakterierna som uppkommer vid genöverföring påvisas med selektiva plattor. De selektiva plattor som används innehåller antibiotika i olika kombinationer. Den kombination av egenskaper som ger växt på de selektiva plattorna kan endast förekomma hos de bakterier som fått nya egenskaper. 21

22 MATERIAL Till en labgrupp för alla dagar. E.coli F - (MC4100) på LB (strep) platta E.coli Hfr (BW7620) på LB (tet) platta E.coli F + (LM129) på LB (cam) platta 1 rör med 10 ml LB 1 st LB platta utan antibiotika 1 st LB plattor med Streptomycin +Tetracyklin 1 st LB platta med Streptomycin + Kloramfenikol 6 eppendorfrör Medium och plattor (dessa finns färdigframstälda) LB-medium Trypton 10 g Jästextrakt5 g NaCl 10 g H 2 O 1 liter LB plattor Samma som ovan och: Agar 12,5 g/liter Tabell 2. Antibiotikakoncentrationer i stamlösningar och odlingsmedier (dessa finns färdigframställda). Antibiotika Stock konc. Medium konc. ml/l Tetracyklin (tet) 3 mg/ml 12 µg/ml 4 Kanamycin (kan) 20 mg/ml 50 µg/ml 2,5 Kloramfenikol (cam) 20 mg/ml 30 µg/ml 1,5 Streptomycin (strep) 50 mg/ml 100 µg/ml 2 UTFÖRANDE Dag 1 1. Märk 1 LB platta (utan antibiotika) med cirklar enligt fig Stryk ut de olika paren och enskilda stammarna (enligt fig 1) på plattan och blanda de två stammarna i varje par noga. 3. Inkubera plattan vid 37 C i 3,5 timmar. 4. Stryk ut bakterier från de olika korsningarna på selektiva plattor enligt figur Inkubera plattorna upp och ner vid 37 C över natt. 22

23 Stam 1+ Stam 2 Stam1+ Stam 3 Stam 3 Stam 1 Stam 2 Figur 1: Märkning av plattan för bildning av konjugationspar. Stam 1, 2 och 3 anges i tabell 1. Stam 1 Stam 1+2 Stam 2 Stam 3 Stam 1+3 Figur 2: Märkning av plattorna för renstrykning efter konjugation. Observera att det är två olika plattor som skall märkas på detta sätt. En med streptomycin + tetracyklin samt en med streptomycin + kloramfenikol. Dag 2 Avläsning och beräkning av konjugation Konjugation Avläs plattorna genom att kontrollera var växt har skett och anteckna resultatet. Var noga med att anteckna alla resultat! RESULTAT Fundera på följande punkter och diskutera med assistenterna: 1. Skillnaderna mellan en F -, F + och Hfr-stam. 2. Vad ni gjort i laborationen och förklara, kortfattat, varför ni gör de olika stegen. 3. Eventuella avvikelser från labkompendiet. 4. Diskutera alla resultaten med assistenterna och dra slutsatser 23

24 Renodling genom utstryk- FYRSTRYK TEORI I det närmaste allt arbete med mikroorganismer utförs med renkulturer. Med en renkultur menar man en kultur i vilken samtliga celler härstammar från en enda bakterie. Genom uttunning av ett ympmaterial, t. ex. genom utstrykning, kan i en heterogen bakteriepopulation varje cell ges möjlighet att utvecklas till en koloni, varifrån en homogen bakteriekultur kan erhållas. UTFÖRANDE: 1. Torka bordet med 70% alkohol. Tänd gasbrännaren och sätt fram behövligt material: ympnål (platinanål med en 2-3 mm stor ögla i spetsen), ympkultur och det som skall ympas, dvs NA-plattan 2. Tag odlingen med vänster hand. Fatta ympnålen som en penna i höger hand och glödga nålen genom att hålla den vertikalt i lågans ytterkant 3. För ned nålen i agarn och ta en koloni. 4. Stryk vågformiga streck över sektor 1 enl. figur nedan 5. Ympnålen glödgas i lågan och kyls försiktigt i agarn 6. Stryk nya streck över sektor 2 så att material hämtas från sektor 1 (se Fig: fyrstryk) 7. Glödga nålen som tidigare och stryk nya streck från sektor 2 till sektor 3. Upprepa proceduren till sektor 4 8. Inkubera minst ett dygn i 37 C. KOMMENTAR: Detta, eller liknande arbetsschema skall alltid användas då kolvar eller rör öppnas eller försluts under aseptiska förhållanden, d.v.s. när man önskar bevara innehållet sterilt (eller kulturerna rena). Det minsta slarv medför omedelbart stora kontaminationsrisker och en infektion i ett försök medför så gott som alltid att försöket misslyckas. Ingenting som legat eller stått öppet och oskyddat för nedfall från luften, kan betraktas som sterilt. Ingenting som inte steriliserats, t. ex. i autoklav, värmeskåp eller öppen låga, är sterilt. Observera att enbart alkoholbehandling ej är steriliserande. När bordet torkas av med 70%-ig etanol, passiviseras och minskas antalet bakterier på bordsytan, men långt ifrån alla oskadliggörs, och nya kommer ständigt till. 24

25 Figur: fyrstryk 25