Cellodling Laborationskompendium Sammanställd av Birgitta Sundström
Material och lösningar: Odlingsmedium 50 ml Falconrör (blå skruvkort) Finns färdigt. DMEM:F12 1:1 med tillsats av 10% (v/v) fetalt kalvserum och antibiotika i lämpligmängd (PEST). Odlingsmedium innehåller dessutom 15 mm Hepes för att stabilisera ph. Finns i kylskåp, ska rumstempereras föra användandet. Odlingsflaskor T25 Odling sker i flaska med 25 cm 2 bottenyta. Flaskorna har förbehandlad plast för att cellerna ska fästa bättre. Sterila pipetter 10 ml, individuellt förpackade Finns i cellodlingslokalen 70% denaturerad etanol för desinficering i sprayfalska En flaska placerad i rummet utanför. Används för att desinficera odlingsmediumrör och rullbordet som ska vara placerat där. En flaska finns i cellodlingslokalen. Används för desinfektion av LAF-bänk och material och utrustning som tas in i LAF-bänk. Pipetteringsutrustning Används vid pipetteringar. Tvättlapp/trasa Används vid desinficering av ytor. Finns i rummet utanför cellodlingslokalen. Bürker räknekammare Används för bestämning av antalet celler i odlingsmediet efter att de lossats från underlaget via försiktig skakning. Kan också användas för bestämning av antalet döda / levande celler i odlingen. Inverterat mikroskop Finns i cellodlingslokalen Mikroskop Finns i rummet utanför cellodlingsrummet. Kristallviolett-lösning Används för bestämning av totalantal celler i kulturen Trypanblå-lösning Används för bestämning av antal döda celler i kulturen.
Denna laboration syftar till att ge kunskap om sterilteknik, odling av animalieceller och vad odlade celler kan användas till. Mediet som produceras ska användas i en senare laboration under kursen för separation / rening av monoklonal antikropp. Laborationen är upplagd på följande sätt: 1. En T25 flaska med celler erhålls från handledaren. Dag 1 splittas cellerna 1:5. De följande två veckorna tillsätts nytt medium, alternativt byts 60% av det gamla mediet mot nytt. Mediet som tas från cellerna centrifugeras, hälls över till nytt rör /flaska och förvaras i kylskåp. Märk dina rör och flaskor så att du vet vilka som tillhör dig. 2. Från en cellsuspensionen som erhålls från handledaren tas ett prov ut för bestämning av totalantal celler. Från suspensionen tas sedan 5 x 10 4 levande celler ut och överförs till ny flaska. Mediet tillsätts så att volymen blir 8 ml. Tillväxtkurva. 3. Denna flaska används för att bestämma cellinjens tillväxtkurva. T.ex de dagar då medium tillsätts/byts görs på de övriga 5 flaskorna så tas prov ut från denna flaska för cellräkning, totalantal och antal döda celler. Antal döda celler.
Utförande: Dag 1: En T25 flaska ska delas (splittas) 1:5. Se fig. nedan. Titta på cellerna i flaskan med hjälp av det inverterade mikroskopet. Om cellerna mår bra ska de vara lite bulliga och glänsa. Celler som ser granulerade ut mår inte så bra. Skaka försiktigt loss cellerna från flaskans botten. Överför suspensionen i ett Falconrör och tillsätt ytterligare 20 ml nytt medium. Blanda cellsuspensionen och överför 5 ml suspension till varje falska (5 st). Fördela cellerna så lika som möjligt pipettera endast 5 ml åt gången eftersom cellerna sedimenterar i pipetten. Märk flaskorna med signatur och passagenummer. Titta på cellerna i flaskorna med hjälp av inverterade mikroskopet. Placera flaskorna i koldioxid inkubatorn med öppnad kork.
Tillväxtkurva: Varannan till var tredje dag: Titta på cellerna med hjälp av det inverterade mikroskopet. Om mediet blivit gult tillsätts ytterligare 5 ml medium. I övriga fall får de stå kvar i inkubatorn. Om flaskorna inkuberats med 10 ml medium i 2-3 dagar så byts ca 60% av medium mot nytt medium. Titta på cellerna i flaska med inv. mikroskopet Ta ut flaskorna, ställ dem i LAF-bänken efter desinficering. Överför med pipett 8 ml medium från varje falska till ett rent Falconrör. Tillsätt nytt medium, 3 ml i varje falska. Placera flaskorna i inkubatorn Mediet centrifugeras vid ca 300xg under 10 min, Mediet överförs till ett nytt rör eller flaska. Du ska räkna celler vid olika tidpunkter för att konstruera en tillväxtkurva för cellen. Från en flaska som fås av handledaren tas ett prov av cellsuspensionen för räkning av antal celler. I en ny T25 flaska sätts 5x10 4 celler. Tillsätt medium så att totala volymen blir 8 ml. Placera flaskan i inkubatorn Minst tre gånger varje vecka (t.ex när du byter medium på dina övriga flaskor) skakas cellerna loss från botten och räknas med både totala antalet och antalet döda celler mha Bürker räknekammare. Försök notera tiden så exakt som möjligt. Det är en fördel att räkna ofta när cellerna växer som snabbast (tidigt). Ta ut prov på cellsuspensionen 0,5 ml som överförs till ett litet rör Blanda lika delar suspension och färglösning ex 0,1 ml + 0,1 ml av respektive. Placera i Bürker räknekammare och räkna antalet celler se teorikompendium. Rita en tillväxtkurva med ln (naturliga logaritmen) för totala antalet celler på y-axeln mot tid i timmar på x-axeln (lin-lin papper). Från kurvan beräknas fördubblingstiden enligt formeln i teorikompendiet. Bestämning av kvoten döda/levande celler Uppskattning av ph Från samma cellsuspension som ovan tas prov ut för att bestämma antalet döda celler. Rita ett diagram där andelen döda celler av totalantalet celler sätts mot tid i timmar. Bestämning av mängd monoklonal antikropp enligt ELISA