Toxicitetsidentifiering metoder för att ta reda på vad observerade toxiska effekter beror på Ann-Sofie Wernersson, Länsstyrelsen Västra Götaland ann-sofie.wernersson@lansstyrelsen.se Toxicitetsidentifiering, TIE, tre steg: I. Karaktärisering: vilka ungefärliga grupper ger upphov till toxiciteten? II. Identifiering: identifiering av misstänkta substanser III. Validering/Konfirmering: bekräftar att misstänkta substanser orsakar toxiciteten Länsstyrelsen Västra Götalands län 1
Exempel på manipulationer i steg 1: Kolonner SPE (Solid Phase Extraction), med C18 kolonn Påverkar opolära organiska ämnen (äv vissa metaller och tensider) Toxicitet minskar efter passage CM kolonn Påverkar katjoner Toxicitet minskar efter passage QMA kolonn Påverkar anjoner Toxicitet minskar efter passage Exempel på manipulationer i steg 1: Filtrering, luftning Filtrering Påverkar ämnen som binder till partiklar (äv vissa ytaktiva ämnen) Toxicitet minskar efter passage Luftning Påverkar flyktiga ämnen, ämnen som lätt oxideras, ytaktiva ämnen Toxicitet minskar efter behandling Länsstyrelsen Västra Götalands län 2
Exempel på manipulationer i steg 1: Tillsatser EDTA tillsätts Katjoniska metaller, framför allt t ex kadmium, koppar, bly, mangan, nickel och zink Toxicitet minskar efter tillsats Natriumtiosulfat tillsätts Tillsats av PBO (Piperonylbutoxid) Oxiderande ämnen såsom klor, brom, jod, klordioxid; vissa katjoniska metaller (ex kadmium, koppar, Hg2+, selenat, silver) Substanser som kräver metabolisk aktivering, t ex vissa organofosfatpesticider (såsom diazinon, malathion, parathion) Toxicitet minskar efter tillsats Toxicitet minskar efter tillsats Exempel på manipulationer i steg 1: Justering av ph ph sänkning (tillsats av HCl) Organiska syror (t ex fenoler), vissa metaller Ammoniak m fl basiska ämnen, vissa metaller Ökar Minskar ph ökning (tillsats av NaOH) Se ovan Tvärtom Länsstyrelsen Västra Götalands län 3
Steg II: Kemisk analys av delar (fraktioner) av provet, eller riktat mot misstänkta substanser Uppdelning av provet, exempel: Stegvis ökande koncentration av metanol tillsätts C18 kolonnen (25, 5, 75, 9, 95, 1%). Spädning av eluaten Upprepad toxicitetstestning på dessa De toxiska fraktionerna analyseras kemiskt Substanser med högre fettlöslighet kommer oftast ut senare EDA Effects Directed Analysis ~ TIE med fokus på steg II Kemisk analys av hydrofoba fraktioner men oftast mer omfattande fraktioneringar tills man hittar det man söker: ämnen som orsakar effekterna Utvecklats av analytiska kemister Europeisk tradition Parkurst et al 1979: föreslår kemisk fraktionering av prover för att identifiera toxiska komponenter i avloppsvatten Länsstyrelsen Västra Götalands län 4
Tester (in vivo resp in vitro) som bedömts lämpliga att använda vid EDA på vattenfas (recipientvatten), vid en första gallring (ref MODELKEY) Alger Daphnia magna Microtox Genetisk påverkan: Ames II, UMU C, Green screen Hormonell påverkan: YES, YAS, T4- TTR, AR-, ER-CALUX Dioxinliknande effekter: DR CALUX Antibiotika påverkan: ABC Assay Steg III Massbalans beräkningar Har all observerad toxicitet kunnat förklaras (för C18 elueringssteget) Korrelation Är toxiciteten högre när koncentrationen av misstänkt substans är högre? Symptomanalys symptom observerade som förknippas med misstänkt substans? Artkänslighet Skillnader i artkänslighet för misstänkt substans också bekräftats i försöket? Spiking Om misstänkt substans tillsätts provet, ökar toxiciteten i proportion till tillsatt mängd? Länsstyrelsen Västra Götalands län 5
Arbetsbördan (kostnaden) kan minskas genom att Begränsa antalet prover som analyseras till ett minimum! Välj toxicitetstest med omsorg! Snabba, billiga tester som ändå mäter relevant toxicitet Hur pass exakt behöver substansernas identitet vara känd för att kunna sätta in åtgärder? Vissa Steg I manipulationer kanske räcker för att bekräfta att misstänkt substansgrupp orsakar toxiciteten? Några fallstudier på industriella avloppsvatten: Holland, metallbearbetning Metallbearbetningsindustri Reningsmetod BAT Renat vatten akut toxiskt (för Daphnia magna, grönalger, zebrafisk; dock ej för Microtox). Uppvisad toxicitet berodde INTE på metaller såsom man först misstänkt. TIE steg 1 gav inte utslag efter EDTA tillsats eller ph justering. Däremot reducerades toxiciteten efter filtrering och luftning, troligen ytaktiva substanser. Länsstyrelsen Västra Götalands län 6
Några fallstudier på industriella avloppsvatten: USA, kemikalietillverkning Kemikalietillverkare av organiska specialkemikalier Ej toxiskt för fathead minnow, ibland toxiskt för C dubia. Toxicitetskriterium i utsläppsvillkoret: LC5 63% avloppsvatten Känt att halterna av Ca, Cl, F, K, Na och sulfater höga. TDS upp till 4 mg/l (till 85% pga Ca o Cl) I avloppsvattnet fanns även metaller (t ex As, Cd, Ag, Zn, Ni, Hg, Pb, Cu), cyanid och produktionsspecifika kemikalier Litteraturdata för misstänkta ämnens toxicitet jämfördes med halter i avloppsvattnet Korrelation mellan befintliga data (halter och effekter): R2>,8 för C dubia toxicitet och hårdhet, konduktivitet och TDS. Men inte mellan de andra möjligen misstänkta substanserna Artkänslighets-studie: Känt att känslighet för TDS (total dissolved solids) är C dubia>d magna>fathead minnow så man la till även D magna till analyserna Konstruerade artificiellt avloppsvatten med blandning av de misstänkta substanserna Halter av Ca och Cl reducerades framöver och därmed toxiciteten Några fallstudier på industriella avloppsvatten: USA, Reningsverk som tar emot industriavloppsvatten Sporadisk kronisk toxicitet observerades på två testorganismer (kräftdjur och fisk) men kräftdjuret alltid mer känsligt Marin fas I TIE: ingen påverkan på toxiciteten efter t ex luftning, tiosulfat-tillsats, EDTA tillsats, ph justering, filtrering, C18 SPE. Bred kemisk screeninganalys (GC/MS scan): många organiska substanser kunde identifieras men ingen som kunde relateras till observerad toxicitet Främst effekt vintertid; sammanföll med sämre nitrifikationsprocess Nitritjoner började analyseras, korrelerade med observerad toxicitet, TIE fas III (spiking av syntetiskt havsvatten) bekräftade att större delen av toxiciteten berodde på nitritjoner Länsstyrelsen Västra Götalands län 7
Några fallstudier på industriella avloppsvatten: USA, Kylvatten Kemikalier som tillsattes kylvattnet: korossionsinhibitorer, ytaktiva ämnen, biocider Akuttoxiskt Man misstänkte tillsatserna eller metaller Fisk mer känslig än D magna TIE fas I gav en fas I signatur för hela blandningen: högre toxicitet vid lägre ph, toxicitet försvann efter anjoner tagits bort med kolonn, även efter passage genom C18 kolonn Med hjälp av fas I signaturen kunde man identifiera att en blandning av tre av substanserna gav samma signatur och det visade sig att toxiciteten främst berodde på reaktionsprodukter mellan två biocider och en korrosionsinhibitor De substanser som användes kunde substitueras Några fallstudier på industriella avloppsvatten: Kanada, Massafabrik Sporadisk toxicitet för fisk men ej toxisk för D magna Kemisk analys: misstänkta substanser (ammoniak, vätesulfid) kunde uteslutas (låga halter) Zink förekom i höga halter men kunde uteslutas pga D magna mer känslig än fisk TIE fas I: Tillsats av bl a zeolit och aktivt kol samt hårdhetsjustering gav respons TIE fas II: C18 + eluering och HPLC analys: pekade ut några opolära organiska substanser, halter jämfördes med deras inneboende toxicitet och en tensid kunde identifieras som trolig orsak, visade sig också ingå i en av de produkter man använt under toxiska episoder Modifierad process som åtgärd Länsstyrelsen Västra Götalands län 8
Sammanställning av identifierade substanser från 84 amerikanska fallstudier Toxicants Identified Effluent Category Ammonia Misc Organic s Pesticides Metals TDS 1 (major ions) Other Municipal (n = 3) 16 1 2 2 1 Residual chlorine (3) Refinery/Chemical (n = 2) 7 14 7 Residual chlorine (1) Mining (n = 13) 8 4 Treatment polymer (1) Manufacturing (n = 8) 1 2 4 2 Fluoride (1), nitrate (1) Pulp and Paper (n = 6) 3 6 -- Oil/Gas Co-Produced Water (n = 8) 8 Sulfide (1) Ref Dave Mount, USEPA personl. kom., (bok på gång att publiceras) Vill du veta mer? USEPA 1991. Methods for Aquatic Toxicity Identification Evaluations: Phase I Toxicity Characterization Procedures. Second Edition. EPA/6/6-91/3. Environmental Research Laboratory, Duluth, MN. USEPA 1992. Toxicity Identification Evaluation: Characterization of Chronically Toxic Effluents, Phase I. EPA/6/6-91/5F May, 1992. http://www.epa.gov/region8/water/wet/pdf/phase%2i%2characterization%2of%2chronically%2toxic%2effluents.pdf USEPA 1993. Methods for Aquatic Toxicity Identification Evaluations Phase II Toxicity Identification Procedures for Samples Exhibiting Acute and Chronic Toxicity. EPA/6/R-92/8. September1993. http://www.epa.gov/region8/water/wet/pdf/phase%2ii%2tie%2acute%2and%2chronic%2toxicity.pdf USEPA 1993. Methods for Aquatic Toxicity Identification Evaluations Phase III Toxicity Confirmation Procedures for Samples Exhibiting Acute and Chronic Toxicity. EPA, 6/R-92/8 1. September 1993. http://www.epa.gov/region8/water/wet/pdf/phase%2iii%2toxicity%2confirmation%2acute%2and%2chronic.pdf USEPA 27. Sediment Toxicity Identification Evaluation (TIE) Phases I, II, and III Guidance Document. EPA/6/R-7/8. September 27. http://www.epa.gov/nheerl/publications/files/sediment%2tie%2guidance%2document.pdf Norberg King T.J. et al. (eds). 25. Toxicity reduction and toxicity identification evaluations for effluents, ambient waters and other aqueous media. Proceedings from the workshop on Toxicity Identification Evaluation: What works, what doesn t and developments for effluents, ambient waters and other aqueous media. SETAC. Hecker Hollert. 29. Effect-directed analysis (EDA) in aquatic ecotoxicology: state of the art and future challenges. http://www.springerlink.com/content/g2424g85p52211u/fulltext.pdf Thomas KV, Brack W, Schymanski E, Streck G, Schulze T, Balaam J, Hamers T, Leonards P, Weiss J, Lamoree M, Hermans J, Brix R. 21. Integrated KEYTOX toolbox of EDA assessment tools for compound analysis and identification and bioeffect analysis and identification. MODELKEY Models for Assessing and Forecasting the Impact of Environmental Key Pollutants on Marine and Freshwater Ecosystems and Biodiversity. KD1.32. January 21 Bakker JF, Belzunce-Segarra MJ, Castro R, van de Heuvel-Greve M, Klamer HJC, Brack W, Altenburger R, Poulsen V, Thomas KV, Leonards PEG. 27. Effect Directed Analysis and Toxicity Identification Evaluation. Kap 5 i rapporten: http://www.harbasins.org/fileadmin/inhoud/pdf/final_products/wp3/wp3_cited_references/bakker_et_al 27 - _Effect_Directed_Analysis_and_Toxicity_Identification_Evaluation.pdf Länsstyrelsen Västra Götalands län 9
Ytterligare några exempel Renat avloppsvatten från kommunalt reningsverk (Indien) Lakvatten från plastartiklar Lakvatten från bildäck Sediment Exempel Patencheru Beakers pair nr Treatment Sample Conc. (%) Untreated a/b Treated c/d OR 95%CI 2 square P value p<.5 1 EDTA 23-nov 1. 41/ 18/1 UND.16*.3167** No 2 EDTA 23-nov.1 9/31 5/15.87.5.829 No 3 EDTA 8-dec.4 3/37 2/8.32.35*.258** No 4 AIR 23-nov.1 9/31 /21 UND 3.9*.215** Yes 5 AIR 8-dec.16 33/12 /2 UND 26.93*.** Yes 6 AIR 8-dec.4 3/37 /21 UND.44*.545** No 7 C18 8-dec.16 33/12 /2 UND 26.93*.** Yes 8 C18 8-dec 1.32 4/ 12/8 UND 15.16*.** Yes a and c = immobile, b and d = mobile,* Yates correction, **Fisher, UND Undefined May, 26. Ecotoxicological evaluation of treated industrial wastewater in south India. Cecilia de Pedro; honour thesis Länsstyrelsen Västra Götalands län 1
Natrium tiosulfat-tillsats identifierade silver som orsak till toxicitet hos en produkt, övriga berodde på non polar organics (C18) Toxicitet berodde på non polar organics; icke filtrerade prover var fototoxiska: PAH påverkan Länsstyrelsen Västra Götalands län 11
...även zink orsakar toxiciteten Tungmetalltoxicitet hos sediment i sjön Molnbyggen (toxicitet minskade efter EDTA tillsats) Länsstyrelsen Västra Götalands län 12