2008-08-06 Kortfattade svar till tenta CMB vt08 samt omtenta MCB OBS svaren nedan är kortfattade men indikerar vilken typ av svar som åsyftas men är ej fullständiga. Det kan finnas andra svar som ger helt eller delvis rätt på frågorna. Omtenta MCB - Molekylär cellbiologi Fråga 1: Vid ph 1 är argininets sidokedja positivt laddad liksom den N-terminala aminogruppen. Vid ph 7 är argininets och glutaminsyrans sidokedjor positivt resp negativt laddade; dessutom är den N-terminala aminogruppen och den C-terminala karboxylgruppen positivt resp negativt laddade. Fråga 2, 3, 4 och 5 motsvarar fråga 1, 2, 5 resp 16 för Cellbiologi med biokemi nedan. Cellbiologi med biokemi (CMB vt08) DEL 1 Fråga 1: a) Reaktionshastigheten v definieras som v= c/ t där c är ändringen i produktens koncentration under tiden t. c kan beräknas från lösningens absorbans A genom sambandet A= c ε l, där ε är produktens absorptionskoefficient och l kyvettens bredd. Ur detta fås c/ t= A/ ε l t. b) Enzymaktivitet anger hur många mol produkt som har bildats per tidsenhet. Detta fås från a) genom att multiplicera v med volymen på reaktionsblandningen dvs 1000 µl. c) Nivån på enzymaktiviteten i serumet får man genom att dividera den beräknade enzymaktiviteten med volymen på den tillsatta serummängden dvs 10 µl. Fråga 2: a) Det första steget i glykolysen är fosforylering av glukos till glukos-6-fosfat; båda föreningarna har 6 kol. Det sista steget är omvandlingen av fosfoenolpyruvat till pyruvat; båda innehåller 3 kol. Det första (och sista steget) i citronsyracykeln är kondensation av oxaloacetat med acetyl-coa ( 4 resp 2 kol) till citrat (6 kol). b) Glykolysen sker i cytoplasman medan citronsyracykeln sker i mitokondriernas matris. c) I glykolysen bildas pyruvat, NADH och ATP från glukos. Vid frånvaro av syre kan inte den NADH som produceras i glykolysen oxideras genom oxidativ fosforylering. I stället används NADH för att reducera pyruvat till laktat. På det sättet återbildas NAD+, som behövs för att glykolysen ska kunna fortsätta. Därigenom upprätthålls ATP-bildningen. Fråga 3: Genom enzymet alaninaminotransferas förs aminogruppen i alanin över till alfaketoglutarat, vilket leder till att pyruvat resp glutamat bildas. Pyruvatet kan sedan gå in i citronsyracykeln och bilda ATP.
Fråga 4: a) 1. Läckage av elektroner i elektrontransportkedjan, särskilt från CoQH. Elektronerna tas upp av syre och superoxid bildas. 2. Syre bundet till hemoglobin tar upp en elektron från Fe 2+ i hemoglobinet och superoxid bildas. b) NADPH används av glutationreduktas för att bilda reducerat glutation (GSH). GSH används av glutationperoxidas för att oskadliggöra väteperoxid. c) Alfa-tokoferol (Obs vitamin E, inte K) skyddar mot ROS genom att avge en väteatom (med en oparad elektron) som oskadliggör radikaler, särskilt i den hydrofoba delen av membraner. d) NADPH kan i erytrocyter bara bildas genom pentosfosfatshunten. Den reaktionsvägen används också för bildning av sackarider med fem kol (ribos), som används i nukleinsyror. Fråga 5: a) Glycerolipider, sfingolipider och steroler. Alt fosfolipider och glykolipider b) I en uniport går en specifik substans igenom membranet. I en symport går två substanser samtidigt igenom. I en antiport går två olika substanser igenom i olika riktning. I samtliga fall drivs transporten av en koncentrationsgradient. c) En bärare släpper igenom en partikel (jon eller molekyl) i taget genom att bäraren binder partikeln och förändrar sin konformation. En kanal däremot ändrar inte sin konformation (när den är öppen) och kan därför släppa igenom partiklar mycket snabbare än en bärare. d) Lipiderna i ett membran är i princip i flytande form. Ett membranprotein kan därför röra sig fritt i membranets plan. Men vissa membranproteiner är bundna till cytoskelettet vilket hindrar deras rörelse. Andra membranproteiner kan vara mindre rörliga genom att de ingår i membranflottar som består av lipider i fast form. Fråga 6. Replikationen RITA! a) Kap 4.5 Lodish. Repl sker i kärnan och startar med att helicaser snurrar upp dubbelhelixen vid sk ORI på kromosomerna. RNA polymeraset - primas syntetiserar en primer som behövs för att DNA pol skall kunna starta DNA-syntesen. Detta sker bidirektionellt och det bildas en replikations-bubbla med två sk replikations gafflar. Kontinuerlig DNA syntes (5 ->3 ) sker på leading strand. Den andra strängen replikeras bitvis lagging strand En primer måste syntetiseras för varje ny bit => Okazaki fragment. Topoisoneraser löser upp torsion i DNA molekylen och löser ev trassel i DNAt. enkelstängs bindande proteins stabiliserar korta bitar av esdna. De olika DNA polymerasen har olika roller vilket skall nämnas. Riktningen på DNA syntesen i förhållande till polariteten på dubbelhelixen skall vara korrekt (5 lagging strand, 3 leading starnd). Se fig 4-30 RNA primers ersätts med DNA av DNA pol och DNA-ligas sammanfogar DNA fragmenten. b) Replikationen sker under S-fas i cellcykeln c) Proof reading. DNA pol (delta epsilon) som sköter den mesta replikationen har exonukleas aktivitet och tar bort ev fekinsatta baser.
Fråga 7. PCR Produkten skall innehålla primers och SKALL vara 200 250 bp Primers skall markeras i figuren så att produkten får korrekt längd! En produkt som är 200 bp och startar på 1 har primersekvenserna: 5 CCGCGGCCAG CTCCGGCGGG 3 (5 / uppströms / forward primer) 5 TTGGCACCTC CAAGGGACAC 3 (3 /nedströms / reverse primer) OBS att DNA sekvens alltid skrivs med 5 änden till VÄ (har tidigare stått hö dvs fel här!). Nedströms primern skall vara reverse komplementär! VIKTIGT: smältpunkten Tm OK, Inga interna 2 strukturer, ej interna komplementaritet som kan ge primer-dimer, att de är specifika dvs bara känner igen den unika sekvensen (testas mot data bas) b) Templat, 2 primers, Taq DNA pol, buffert inkl Mg2+ och NaCl, dntp, PCR-apparat c) Denaturering av templat (94C) Annealing, hybridisering av primers till es templat (37 60C) Elongering dvs DNA syntes, (72C) d) Storleksmarkör för att bestämma fragmentets storlek Negativ kontroll utan templat skall vara tom Positiv kontroll med rätt templat Ditt prov skall vara av samma storlek som pos kontrollen och STRLK markören Fråga 8. sekvensning Sanger sekvensering chain termination method / dideoxy metoden. Principen förklaras i Lodish s. 186! Fluorescence detektion: varje ddntp har en specifik fluorofor. Sekvensreaktionen körs med Taq DNA polymeras som DNA polymeras och upprepas flera gånger så att det blir mycket sekvens produkter, tillräckligt mycket för att sedan analysera/storleksfraktionera esekvensprodukterna med kapillärelektrofores. OBS förväxla ej detta med PCR reaktionen) I slutet på kapillären bestäms fluorescensen och därmed sekvensen. Resultatet visas i ett electrofluorogram (electropherogram).
DEL 2 Fråga 9. Fråga 10. a) Man använder en kvantitativ RNA analysmetod: ex qrt PCR eller northern blot analys. Först prepararer man RNA från proverna och sedan analyserar och jämför man dessa RNA med ec. qrt PCR. Hur qrt PCR fungerar hänvisas till Lab10! b) Specifika transkriptions faktorer / aktivatorer för genen ADRBK2 kan finnas i olika nivåer i de olika hjärnregionerna. Där de finns i hög nivå kommer de att binda in och stimulera transkriptionen av genen genom att hjälpa initieringskomplexet att dra igång RNA pol II..
Alternativt: i vissa hjärnregioner finns det repressorer som påverkar tex kromatinstrukturen till en mer kompakt / kondenserad struktur. Detta kan ske genom histon de-acetylering eller påverkan av histon-metylering. Fråga 11. mrna Transkriptionsinitiering 5 Caping Olika mrna bindande protein binder till pre mrnat Splicing 3 klyvning vid poly A signal 3 polyadenylering mrna editing Export ut fr kärnan Binding av protein till mrnat Cytoplasmatisk Post transkriptionell reglering o mi RNA - translations inhibering o sirna reglerad degradation av mrna Translationen Degradation Fråga 12 Diploid cell med n=2. Det finns 4 st koromosomer: 2 st Chr1, 2st Chr2. Före mitos replikeras dessa så att det finns sammanlagt 8 st kromatider. Det skall framgå hur dessa fördelas i de två dottercellerna så att mankan se hur kromatiderna från resp. maternell, paternell Chr1 o. 2 fördelas.. Hur fördelningen sker se sid: 782-783 Lodish Fråga 13 a) S. 382 Lodish. En fluorofor-specifik exciterande våglängd används för att belysa cellen/preparatet i ett fluorescensmikroskop. Fluoroforer kan vara t ex GFP eller Hoechst. Det specifika emitterade ljuset studeras. Excitations- och emissionsljuset filtreras för att bara dessa våglängder skall finnas. b) Man kopplar ex GFP till ett protein och följer detta i cellen. Ex är hur NLS fungerar se lab. c) En förklaring är att man kopplat GFP till ett protein eller organell som transporteras på MT systemet. Det vandrar från cellcentrum (MTOC) mot periferin och är alltså kinesindriven transport. Fråga 14 Cycliner / Cdks (cyklin kinaser) Kap 20 Lodish Cykliner är den reglerande subenheten och påverkar det cyklinberoende kinasets förmåga att sätta på fosg fatgrupper på proteiner av vikt i celldelningen. APC är ett ubikvitinligas E3 vilken dels sätter på ubikvitinenheter på anafasinhibitor sekurin som därmed degraderas (då tillåts separas att klyva cohesin vilket gör systerkromatiderna fria att vandra till varsinn dottercell). En senare effekt av APC är ubikvitinering av cyklin B (MPF inaktiveras därmed), dess nedbrytning i proteasomer och därmed avslut av M-fasen.
Fråga 15 Stamceller har många olika receptorer. Viktigt är att koppla samman receptor med signalväg på rätt sätt. EX. FGF (fibroblast Growth Factor) FGF receptorer som är RTKs och aktiverar Ras/Raf MAPkinas kaskaden, även PI3Kinas vägen eller PLCgamma och IP3/DAG Ca2+ Signalöverföring sker så att olika transkriptionsfaktorer i kärnan på stamcellen aktiveras t ex CREB, TCF-SRF vilket regerlar gener bl a c-fos och andra immediateearly gener (early response genes) som i sin tur aktiverar E2F, cyklin D och Cdk4 och 6 som är delayed-response genes. Fråga 16: a) Ytreceptorer som ska internaliseras samlas på inbuktningar av plasmamembranet. Den cytoplasmatiska delen av receptorerna binder specifikt till adaptorproteinkomplex som i sin tur binder till klatrin. Inbuktningen övergår till en vesikel varefter beklädnanden av klatrin- och adaptorproteinkomplex stöts av. b) 1. Endosom -> cellytan (återanvändning). 2. Endsom -> lysosom (nedbrytning) 3. Endosom -> andra sidan av cellen (transcytos).