Sluttentamen Bke2 26:e oktober 2000 09 00-16 00. Max poäng =78p. Gräns för godkänd = 42p (54%). Svara på varje fråga på separat papper! Ange tydligt frågans nummer längst upp på sidan! Glöm inte att ange din skrivningskod på varje papper! Glöm inte att skriva ner och spara din kod! Kod Fråga nr Lycka till! 1. a) Markera polära och icke-polära delar i nedanstående molekyl. Vilken typ av ämne är det, och vad heter molekylen? (2p) COO- +H 3 N C H CH 2 CH 2 CH 2 NH C NH 2 + NH 2 b) Arrangera molekylerna nedan så att de vätebinder med maximalt antal vätebindningar. Ange också avståndet mellan donor och acceptoratom i en typisk vätebinding. Vätebinding mellan bl.a. de här två molekylerna är grundläggande för hur en mycket viktig biomolekyl fungerar. Vilken molekyl, och varför? (2p) HN CH 3 N R R a) Amino, karboxyl och guanidiniumgrupperna är polära, kolkedjan är apolär (1p). Aminosyra (0.5p), arginin (0.5p). b) -NH 2 O=, N HN- (0.5p). Ca 3.1 Å (2.7-3.2Å) (0.5p). DNA (0.5p); håller ihop dubbelspiralens komplementära strängar genom basparning (här A - T) (0.5p).
2. Utan biologiska membran skulle inget liv kunna existera. Beskriv med en enkel skiss den kemiska strukturen av membranlipider, och uppbyggnaden av ett biologiskt membran. På vilket sätt fungerar biologiska membran annorlunda än icke-biologiska (t.ex. dialysmembran)? Ge två exempel på energialstrande processer där biologiska membran är av central betydelse. (2p) Enkel figur glycerol-(r1,r2,polär grupp) där R = fettsyra (0.5p). Membranfigur, dubbellager, hydrofobt in, hydrofilt ut, proteiner (0.5p). Biologiska membran innehåller proteiner som sköter om aktiv transport av olika substanser över membranet (0.5p). Oxidativ fosforylering, fotosyntesens ljusreaktioner (0.5p). 3. Aminosyrorna G och P är vanliga i beta-böjar. a) skriv de fullständiga namnen på G och P (0.5p) b) förklara vilka egenskaper var och en av dessa två aminosyror har som gör att de ofta förekommer i sådana böjar (1p) c) En av ovanstående aminosyror återfinns endast sällan i alfahelixstruktur. Vilken? Beskriv alfahelixstrukturen och förklara varför. (1.5p) d) Rita tripeptiden G-P-X där X är en valfri (men ej G eller P!) aminosyra, vid ph 7. Markera peptidbindningar och bindingar i huvudkedjan som kan roteras fritt. Ange peptidens laddning vid ph 7 (3p). (6p totalt frågan) a) Glycin (0.25p), Prolin (0.25p). b) Glycin saknar sidokedja och phi & psi-vinklarna kan därför anta i stort sett vilka värden som helst huvudkedjan kan böjas kraftigt (0.5p). Hos prolin binder sidokedjan tillbaks till huvudkedjan och gör därmed en knix på denna (0.5p). c) Prolin (0.25p). Alfahelix är en högervriden spiral med 3.6 aminosyror/varv (0.25). Stabiliseras av vätebindingar mellan C=O på aminosyra n och NH på aminosyra n+4 (0.5). Prolin saknar väte på peptidkvävet som därför inte kan delta i vätebinding. (0.5p) d) Figuren bör innehålla korrekt laddade terminaler (0.25p), sidokedjor (3 x 0.5p), huvudkedja (0.25p), peptidbinding (0.25p), och phi-, psi- vinklar (2 x 0.25p), laddning (0.25p) för full poäng. 4. Om vi har ett enzym som har subenhets-kompositionen α 4 β 4 γ 2 δ, och varje α-subenhet har två domäner, och δ subenheten har tre domäner, hur många N- respektive C- terminaler finns det? (1p) 11 st av varje (en N- och C-terminal per subenhet). (1p)
5. I figuren nedan visas resultatet av ett försök att separarera en blandning av fyra proteiner, A-D, på DEAE-Sepharose vilken har en positivt laddad ligand. Varje topp anses motsvara ett protein. Protein A eluerar direkt efter tillsats av bara buffert d.v.s. 25 mm Tris-HCl ph 7.5. Protein B eluerar vid 0.1 M NaCl och protein C vid 0.3 M NaCl. Du vet att de fyra proteinerna har följande isoelektriska punkter (pi): 5.2, 6.0, 6.9 samt 9.0. Jonbyteskromatografi på DEAE-Sepharose 1 Abs280 0.8 0.6 0.4 A B C 0.2 0 0 10 20 30 40 Fraktionsnummer a) Beskriv korfattat principen för jonbyteskromatografi (2p) b) Para ihop respektive protein med troligt pi-värde (2p) c) Protein D har tydligen inte lossnat från kolonnen. Hur kan man få ut det? (1p) a) Jonbyteskromatografi bygger på principen att molekyler kan binda reversibelt till laddade grupper vilka immobiliserats på en bärarsubstans (1p). De molekyler, i vårt fall proteiner, som binder kan fås att lossna från liganden igen genom att jonstyrkan höjs antingen i steg eller kontinuerligt med en s.k. gradient. (1p) b) A- pi 9.0 B- pi 6.9 C- pi 6.0 D- pi 5.2 (0.5p för varje rätt svar) c) Protein D kan troligen fås att eluera genom att jonstyrkan höjs ytterligare t.ex. till 0.5 M. (1p) 6. Jämför interaktionerna (vätebindingar, van der Waals o.s.v.) mellan en oveckad polypeptid och vatten å ena sidan, och inom ett korrekt veckat globulärt protein å
andra sidan. Vilken faktor är viktigast för veckning och stabilisering av 3Dstrukturen? (5p) Interaktion Oveckad polypeptid (0.5p/svar) Veckat protein (0.5p/svar) Vätebindingar polära grupper - vatten sekundärstruktur; mellan polära sidokedjor; polära sidokedjor-vatten van der Waalsinteraktioner relativt få & svaga många Elektrostatiska interaktioner få, skärmas av vatten mellan motsatt laddade sidokedjor nära varandra Hydrofoba Hydrofoba grupper minskar vattnets entropi Hydrofoba grupper tätt packade i kärnan många vdw-interaktioner Den hydrofoba effekten är viktigast för veckning och stabilisering av 3D-strukturen. (1p) 7. a) Varför används heme-bindande proteiner för transport och lagring av syre i stället för att syre transporteras löst i blodet, eller bundet till en fri heme-grupp? (1p) b) Syretransport och lagring av syre i musklerna ställer olika krav på syrebindningsegenskaperna hos de inblandade proteinerna. Beskriv hur syrebindningsegenskaperna hos myoglobin och hemoglobin skiljer sig åt och ange den strukturella bakgrunden till skillnaderna! Vad kallas den egenskap som gör att hemoglobin kan fungera som syretransportör? (3p) c) Beskriv kortfattat en heterotrop alloster effekt hos hemoglobin. (1p) (5p totalt) a) Syre löser sig dåligt i blod och måste bindas till något (t.ex. heme) för att ge tillräcklig löslighet (0.25p). Järnet i en fri heme-grupp i lösning oxideras till Fe 3+ och kan inte släppa bundet syre (0.25p). Den hydrofoba miljön runt hemegruppen i hemoglobin och myoglobin gör att järnet förblir reducerat och kan då både binda och avge syre under de syretryck som råder i lunga respektive muskelvävnad (0.5p). b) Transportproteinet hemoglobin måste binda syre vid höga syrgastryck (lunga) och släppa det infrån sig vid låga syretryck (muskel) (0.25p).
Lagringsproteinet myoglobin måste kunna binda syre vid låga syretryck (muskel) (0.25p). Hemoglobin består av fyra Mb-liknande subenheter (0.25p) och kan existera i två olika former (0.25p): R och T. R och T står i jämvikt med varandra (0.25p). T (deoxyhb) binder syre svagt (0.25p); R (oxyhb) binder syre starkt (0.25p). Binding av syre förskjuter jämvikten mot R-formen så att mer R-Hb finns i lungorna; vid låga syretryck förskjuts jämvikten mot T-formen och mer syre kan avges (0.5p). Detta beror på att olika Hb-subenheter kommunicerar med varandra genom konformations-förändringar orsakade av syrebinding (0.5p) och kallas för kooperativ binding eller (homotrop) allosteri (0.25p). c) Bohreffekten = sur miljö (H + ) och CO 2 "sköljer ut" O 2 från Hb genom at stabilisera deoxyhb (heteroptrop alloster effekt). BPG stabiliserar deoxyhb så att mer syre kan avges till muklerna. I syrefattig miljö ökas produktionen av BPG. (1p för ett korrekt exempel). 8. a) Att enzymer är så effektiva katalysatorer beror främst på att de är utformade för att binda reagerande ämnen på ett speciellt sätt. Aktiva ytan är formad för att åstadkomma två viktiga effekter som snabbar upp kemiska reaktioner. Vilka är dessa effekter? Hur mycket påskyndar de reaktionshastigheten? (2p) b) Serinproteaser som trypsin, chymotrypsin, och elastas har likartade aktiva ytor och använder samma mekanism för att klyva polypeptidkedjor. Vilka tre sidokedjor förekommer alltid hos serinproteaser? Reaktiva grupper i aktiva ytan hos enzymer kan delta direkt i kemisk reaktion med substratet vilket kallas kemisk katalys.ge ett exempel på två olika typer av kemisk katalys hos serinproteaser. (3p) c) Då man undersöker aktiviteten hos serinproteaset chymotrypsin som funktion av ph finner man att aktiviteten har ett optimum kring ph 7.8, och att aktivitet i stort sett saknas vid ph under 4.0. Varför? (1p) (6p totalt) a) Närhetseffekten gör att reaktiva grupper kommer nära varandra, och i rätt orientering, vilket ökar sannolikheten för reaktion (0.75p). Ökningen uppskattas till 10 4-10 5 gånger (0.25p). Enzymet stabiliserar övergångstillståndet ("transition state") och minskar därigenom aktiveringsenergin (0.75p). Ökningen uppskattas till minst 10 4-10 5 gånger (0.25p). b) Alla serinproteaser har en s.k. katalytisk triad bestående av Asp - His - Ser (1p).
Syra-bas-katalys innebär att protoner ges till eller tas från substratet (0.5p). His tar upp en proton från serin så att den blir en negativt laddad nukleofil (0.5p). Kovalent katalys innebär att en reaktiv grupp på enzymet reagerar direkt med substratet och bildar en kovalent binding till en del av eller hela substratet (0.5p), ett s.k. kovalent reaktionsintermediat där en del av eller hela substratet sedan överförs till ett annat substrat. Den aktiverade serinen attakerar karbonylkolet i peptidbindingen som skall klyvas och bildar ett tetraediskt intermediat (0.5p). c) Vid ph 7.8 är Asp negativt laddad och kan stabilisera His+; His kan lätt protoneras och deprotoneras eftersom ph är nära pka för His (0.5p). Vid ph 4 är Asp företrädesvis protonerad och neutral; His fungerar inte som bas och enzymet är "dött" (0.5p). 9. a) Hur påverkar ett enzyms Km respektive kcat förhållandet mellan koncentration av substrat och produkt vid jämvikt? (1p) b) Ange i reaktionsschemat E+S <-> ES --> E+P de hastighetskonstanter som styr reaktionen. I Km ingår samtliga dessa hastighetskonstanter. Skriv uttrycket. (1p) c) Km kan ha samma värde som dissociationskonstanten (Ks) för sönderfall av ESkomplexet, och är då ett mått på hur hårt substratet binds, men bara under en viss förutsättning. Vilken? (1p) (3p totalt) a) Inte alls (1p). Jämvikten beror på den termodynamiska skillnaden i fri energi, medan Km och kcat är uttryck för förhållanden mellan hastighetskonstanter. b) Om så är Km = (k -1 +k cat )/k 1 (1p) k 1 k cat E + S < -- > ES -- > E + P k -1 c) Gäller när k -1 är mycket större än k cat ( då blir Km = k -1 /k 1 = Ks (1p) 10. Rita Lineweaver-Burke-plotten för a) ett enzym i frånvaro och i närvaro av en kompetitiv inhibitor och b) ett enzym i frånvaro och i närvaro av en icke-kompetitiv (non-competitive) inhibitor, och förklara kortfattat hur dessa två typer av inhibitorer fungerar, och hur Vmax och Km påverkas av inhibitorerna.
Ange i figurerna hur man får ut Vmax och Km, och glöm inte att namnge axlarna! (3p) a) korrekt figur (samma skärningspunkt 1/V-axeln; samma Vmax) (1p); konkurerar om aktiva ytan (0.5p) b) korrekt figur (samma skärningspunkt 1/[S]-axeln; samma Km) (1p); binder till regulatorisk yta och påverkar aktiva ytan genom konformations-förändringar (=heterotrop alloster effekt) (0.5p) 11. Enzymatiska processer är reglerade för att de ska ske vid rätt tid och på rätt plats. Regleringen sker i allmänhet genom att på olika sätt påverka aktiviteten för enzym som katalyserar metaboliskt irreversibla steg. Ibland regleras ett enzym av en produkt längre fram i en metabolisk reaktionskedja (feedback); ibland kan produkten av ett tidigare steg fungera som regulator (feed forward). Förutom att det reglerande ämnet kan fungera som en kompetitiv inhibitor finns också andra sätt att påverka ett enzyms aktivitet. Beskriv kortfattat tre sådana mekanismer för att reglera ett enzym, och ange om mekanismen är reversibel eller ej. (3p) Alloster reglering: den reglerande molekylen binder på särskild regulatorisk plats i enzymet och påverkar aktiviteten genom konformationsförändringar i aktiva ytan. Oftast oligomera proteiner. Reversibel. (1p) Fosforylering: genom att reversibelt sätta på (kinaser) och plocka bort (fosfataser) fosfatgrupper kan enzymets aktivitet påverkas. (1p) Proteolytisk aktivering: en propeptid klyvs bort för aktivera enzymet. Irreversibel. (1p) 12. Serinproteaser utsöndras som zymogener från bukspottkörteln. Efter aktivering i tarmen klyver de peptidkedjor med en gemensam katalytisk process, men varje serinproteas har olika specificitet och klyver peptidbindingar efter olika aminosyror. T. ex. klyver chymotrypsin peptidkedjor efter aminosyrarester med aromatiska eller andra stora sidokedjor, medan trypsin klyver efter positivt laddade sidokedjor. Förklara med en figur hur denna substratspecifictet uppkommer. (2p) 2p för figur enl s 171 i boken eller liknande (olika fickor för binding av olika typer av sidokedjor).
13. Idisslare som har drabbats av akut acetonemi behandlas ibland genom att veterinären injicerar kortisol. Kortisol är ett kataboliskt hormon som stimulerar nedbrytningen av proteiner. Förklara kortfattat hur en sådan behandling kan resultera i att akut acetonemi hos idisslare kan hävas. (2p) Kortisol bryter ner proteiner vilket leder till att levern kan utnyttja dessa till glukoneogenes och därmed höja blodglukos-nivån. (2p) 14. Vid en partiell svält tillförs ingen näring utifrån. Beskriv kortfattat vad som händer i levern (i biokemiska termer) efter flera timmars frånvaro av föda och ange varifrån respektive metabolit härstammar (max 1 sida). (6p) Glukos bildas från Leverglykogen. (1p) Glukos bildas från laktat, från skelettmuskler. (1p) Glukos bildas från glycerol, från lipolys i fettväven där glycerol och fria fettsyror bildas triacylglycerol. (1p) Glukos bildas från glukogena aminosyror som kommer huvudsakligen från musklerna. (1p) Fettsyra förbränningen (β-oxidationen) ökar, fettsyror från fettväven. (1p) Brist på glukos leder till brist på oxalacetat vilket resulterar i en ökad ketonkroppsproduktion. (1p) 15. Enzymet citratlyas katalyserar spjälkningen av citrat i cytosolen. Nötkreatur har ingen (eller mycket låg) aktivitet av detta enzym. Vilka är spjälkningprodukterna? Vilken roll i fettsyrasyntesen spelar detta enzym? Varför behöver kon inte detta enzym? (3p) Citrat som transporterats ut i cytosolen spjälkas till oxalacetat och acetyl-coa. (1p) Acetyl-CoA utgör substrat för fettysrasyntesen. (1p) Idisslarna får stora mängder acetat från förjäsningen av kolhydrater i vommen och utnyttjar cytosoliskt acetat som kopplas ihop med CoA. (1p) 16. Vid hårt muskelarbete ackumuleras huvudsakligen en metabolit från kolhydratnedbrytningen (glykolysen) i skelettmusklerna. Vilken? Hur hanterar kroppen omhändertagandet av denna metabolit? (3p) Laktat (1p). Laktat från musklerna transporteras via blodet till levern, där sker glukoneogenes, d.v.s. glukos bildas som sedan transporteras tillbaka till muskeln, Cori-cykeln (2p).
17. Vilket påstående är rätt? (1p) Pentosfosfat-shunten a) består av en serie reaktioner som inte har något samband med någon annan metabolisk reaktionsväg. b) genererar NADH som reducerande ämne i biosyntes-reaktioner. c) producerar ribos-5-fosfat (1p) d) kräver arabinos-5-fosfat 18. Vilket påstående är rätt? (1p) Om pyruvat skall oxideras vidare i citronsyracykeln a) måste pyruvat omvandlas till oxalacetat b) måste pyruvat omvandlas till acetyl-coa genom oxidativ dekarboxylering. (1p) c) måste pyruvat binda kovalent till ett litet enzym som katalyserar reaktionen. 19. Vad är finessen med en signalöverförings-kaskad? Ge ett exempel på en sådan! (2p) En signalöverföringskaskad är en kedjereaktion som förstäker en signal i flera olika steg (1p). (Initialbindningen av t.ex. ett hormon till en receptor kan t.ex. ge upphov till aktivering av ett antal G-proteiner som aktiverar t.ex. adenylatcyklas som ger många camp molekyler som aktiverar ännu fler kinaser som aktiverar eller stänger av ännu fler enzymer. Signalen förstärks genom kedjan.) Ett exempel som behandlats på kursen är hur ett hormon (glucagon, epinefrin) aktiverar glykogen-nedbrytning. (1p) 20. a) Beskriv huvudkomponenterna i fotosyntesens ljusreaktion. Illustrera gärna med en enkel skiss. (2.5p) Besvara sedan följande frågor: b) Var sker fotosyntesens ljusreaktion? (0.5p) c) Vad heter den vanligaste ljusinfångande komponenten hos växter? (0.5p) d) Vilken allmän fysikalisk egenskap hos molekylerna som ingår i ljusreaktionen utnyttjas för att transportera elektroner? (0.5p) e) Varifrån tas elektronerna? (0.5p) f) Vilken är den slutliga elektron-mottagaren? (0.5p)
a) Ett (biologiskt) membran (0.25p) en elektronkälla (H 2 O) (0.25p) ljusinfångande pigment (klorofyll) (0.25p) elektrontransporterande kofaktorer (redox-centra) (0.25p) protein (reaktionscenter (0.25p), cytokrom bf-komplex (0.25p)) vattenlösliga elektronbärare (cytokrom c (0.25p), plastocyanin (0.25p)) elektron-mottagare (NADP + ) (0.25p) ljus (0.25p). See t.ex. Fig 16.7 i Horton. b) I kloroplasternas tylakoidmembran. (0.5p) c) Klorofyll (a) (0.5p) d) Reduktionspotentialen (redox-potentialen). (0.5p) e) H 2 O (0.5p) f) NADP + (0.5p) 21. DNA-polymeras I från E. coli består av ett enda protein och är inblandat i både replikation och lagning av DNA. Beskriv detta enzyms uppgifter i dessa två processer. (2p) Replikation: degraderar RNA-primern i Okasaki-fragmenten och byter ut dessa mot DNA. (1p) Lagning: fyller igen den lucka i DNAt som uppstått då cellens lagningssystem har identifierat och degraderat ett fel i den ena DNA-strängen. (1p) 22. a) Generna (proteinkodande regioner i DNAt) i E. coli är ofta ordnade i operon. Vad är fördelen med ett sådant arrangemang? (1p) b) Vad är en exon? (1p) c) Vad är ett "anticodon" och vad har det för uppgift under translationen? (1p) a) Alla gener i operonet styrs av en gemensam promotor. (1p) b) Sekvens (i DNA eller RNA) som finns kvar i det processade (splicade) RNAtranskriptet. (1p) c) Den triplett av nukleotider på trna-molekyler som basparar mot mrnat under translationen. (1p) 23. a) Vad innebär transformering av bakterier? Hur utfördes transformeringen på DNAlabben? (2p)
b) Varför växte det blåa bakteriekolonier på vissa plattor innehållande ampicillin, X- gal och IPTG? (2p) c) Varför tillsattes ethidiumbromid till agarosgelen där vi separerade våra DNAfragment? (1p) a) Transformering = Ett sätt att stoppa in en plasmid i en bakterie (1p). På labben gjordes detta genom elektrotransformering/elchock/1500v av plasmid/bakterieblandningen.(1p) b) Blå kolonier därför att bakterier som plockat upp en plasmid med intakt lacz-gen uttrycker beta-galaktosidas som kan bryta ned X-gal till ett blått färgämne. (2p) IPTG förklaring ger inget extra. Namn på gen och enzym bra men inte nödvändigt. c) Etidiumbromid binder till DNA och fluorescerar i UV-ljus. Annars skulle vi inte se våra DNA-fragment (1p)