SPOT-Light HER2 CISH-kit

SPOT-Light HER2 CISH-kit Art. nr 84-0150 20 tester med 24 mm x 30 mm täckglas Avsedd användning För diagnostisk användning in vitro SPOT-Light HER2 CISH-kiten är avsedd att kvantitativt bestämma förstärkning av HER2-genen i formalinfixerade, paraffinerade (FFPE) vävnadssnitt av bröstkarcinom med hjälp av kromogen in situ-hybridisering (CISH) och ljusfältsmikroskopi. Detta test bör utföras på ett histopatologiskt laboratorium. SPOT-Light HER2 CISH-kiten är avsedd att användas som ett hjälpmedel vid bedömningen av de patienter för vilka Herceptin -behandling (trastuzumab-behandling) övervägs. Analysresultaten är avsedda att användas som ett komplement till den klinisk-patologiska information som för närvarande utgör en del av behandlingen av bröstcancerpatienter. Tolkningen av resultaten måste göras inom ramen för patientens kliniska sjukdomshistoria av en utbildad patolog. Sammanfattning och beskrivning Den mänskliga genen HER2 eller c-erbb-2 och motsvarande råttgen, neu, har identifierats som proto-onkogener (1-3) vilka är homologa med den närbesläktade v-erbb-onkogenen. (1) HER2-genen är belägen på kromosom 17 (17q11.2-21) och kodar för ett membranreceptorliknande protein på 185 kda. HER2-proteinet har tyrosinkinasaktivitet och är homologt med, men är skilt från, den epidermala tillväxtfaktorn (även betecknad som EGFr, HER1, eller c-erbb-1). (2) HER2-genförstärkning eller överuttryck av HER2-protein har identifierats i 18 30 % av mänskliga bröstcancrar. (8-9) Fastställandet av HER2-genens förstärkningstillstånd har betydelse för att ställa prognosen för patienter som har diagnostiserats med invasiv bröstcancer, liksom för att välja ut patienter som är kvalificerade för behandling med trastuzumab (Herceptin, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Schweiz och Genentech, Inc., South San Francisco, CA). (4-6) Trastuzumab är en monoklonal antikropp som är specifik för HER2-proteinet. Det har påvisats att trastuzumab endast är effektivt vid behandling av patienter vars tumörer uppvisar HER2-genförstärkning och/eller överuttryck av HER2-protein. (7,11) Vid tidig bröstcancer visade sig en kort behandlingskur med trastuzumab, administrerad samtidigt med docetaxel eller vinorelbin, vara effektiv hos kvinnliga bröstcancerpatienter med en förstärkt HER2/neu gen. (12) Andra studier har även visat att HER2-tillstånd förutsåg känsligheten för eller resistensen mot vissa kemoterapiprogram. (13) Följaktligen har noggranna, reproducerbara och enkla metoder för utvärdering av HER2-genens och HER2-proteinets tillstånd blivit alltmer betydelsefulla. PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 1 av 25

Analysprinciper CISH teknikerna använder digoxigeninmärkta DNA-prober som är specifika för HER2-genlokuset på kromosom 17q11.2-21 för att hybridisera de komplementära nukleinsyror som finns i bröstcancerprovet. Den märkta HER2- proben tillverkas med hjälp av subtraktionsprobteknologi (SPT ), en äganderättsskyddad och patentskyddad teknik, som frambringar specifika prober genom att markant minska antalet upprepade sekvenser (t.ex. Alu- och LINEenheter) som finns i mänskliga nukleinsyror. Det har påvisats att proben innehåller HER2-genen med hjälp av PCR och att den binder specifikt till HER2-genlokuset på kromosom 17q11.2-21 med hjälp av metafas-fish i normala lymfocyter. Följaktligen är Invitrogens SPT -prober specifika i sig själva och kräver inte blockering av upprepade sekvenser, vilket krävs för sedvanliga cytogenetiska DNA-prober. CISH-tekniken möjliggör utvärdering av genetiska avvikelser under ett ljusfältsmikroskop med hjälp av kromogen detektion. CISH-färgningsresultat kan visualiseras tydligt med ett standardmässigt ljusfältsmikroskop och en 40X torr lins. HER2-genförstärkningstillstånd kan visualiseras i relation till den omgivande vävnadsmorfologin. Efter avlägsnande av paraffinet förbehandlas proverna med ett värmeinducerat återvinningssteg följt av spjälkning med enzym. Proverna dehydreras och lufttorkas före tillsats av HER2-proben. Efter att proben och täckglaset har lagts på provet denatureras och hybridiseras kombinationen under mer än 10 timmar eller över natt. Därefter tvättas provet för borttagning av ohybridiserade prober och signalen detekteras kromogent genom sekventiell tillsats av antikropp till digoxigenin och pepparrotsperoxidas-polymerkonjugat (HRP-konjugat). Färgen framkallas genom reaktion mellan bundet HRP och DAB-kromogen samt H 2 O 2 -substrat. Slutligen motfärgas provet med Mayers hematoxylin för bestämning av vävnadsmorfologin och förses med ett täckglas. HER2-gensignalen identifieras genom en enstaka, mörk brun fläck när den förekommer i få kopior eller bruna kluster när signalen förekommer i många kopior. Områden med tumörceller kan enkelt identifieras under ett ljusfältsmikroskops objektiv med liten förstoring och HER2-genkopiorna kvantifieras med hjälp av 40X objektivet. Med hjälp av ett ljusfältsmikroskop med ett 40X objektiv kan tumörcellerna lokaliseras och HER2-genkopiorna kvantifieras. DAB bildar en färgad fällning så att resultaten kan arkiveras och granskas på nytt vid ett senare tillfälle. Ingående material SPOT-Light HER2 CISH-kiten innehåller alla reagens som behövs för att CISH-proceduren ska kunna utföras på formalinfixerade, paraffinerade vävnader. De material som uppräknas nedan räcker till totalt 20 tester och upp till 2 körningar med de två kontrollobjektglasen och med användning av 24 mm x 30 mm vävnadsprover försedda med täckglas. Fler tester kan utföras om mindre täckglas används. SPOT-Light HER2 CISH-kiten transporteras på kyldynor. Kyldynorna bör fortfarande vara kalla vid mottagandet av godset för att säkerställa att förpackningen inte har utsatts för höga temperaturer. Vissa komponenter kan emellertid fortfarande förekomma i icke-nedfryst skick och det kommer inte att påverka satsens prestanda. Se Reagensförvaring med avseende på omedelbar förvaring vid mottagandet av dessa komponenter. Reagens A. Värmeförbehandlingslösning 1 l, innehållande Tris-EDTA-buffert (För direktbruk) Reagens B. Enzymförbehandlingsreagens 5 ml, innehållande pepsinlösning med 0,05 % natriumazid och detergent (För direktbruk) VAR FÖRSIKTIG: Skadlig Reagens C. HER2-prob 0,4 ml digoxigeninmärkt SPOT-Light HER2-prob i hybridiseringsbuffert innehållande formamid (För direktbruk) VAR FÖRSIKTIG: Skadlig Reagens D. SSC-buffert 500 ml, innehållande saltlösning-natriumcitrat (SSC) (För direktbruk) Reagens E1. PBS-pulver 3 förpackningar, var och en räcker till 1 l PBS Reagens E2. Tween 20 (50 %) 2 ml, Tween 20 i 50 % lösning PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 2 av 25

Reagens F. CAS-Block TM 3 ml, innehållande buffert, stabilisator och 0,1 % natriumazid (För direktbruk) VAR FÖRSIKTIG: Skadlig Reagens G. Anti-digoxigeninantikropp från mus 3 ml, innehållande BSA, buffert och 0,1 % natriumazid (För direktbruk) VAR FÖRSIKTIG: Skadlig Reagens H. Anti-mus-HRP-polymerkonjugat från get 3 ml, innehållande stabilisator, buffert, 0,005 % gentamycinsulfat och 0,1 % Proclin 300. (För direktbruk) Reagens I1. DAB-substratbuffert (20x) 1 ml, koncentrat innehållande buffert Reagens I2. DAB-lösning (20x) 1 ml, koncentrat innehållande 85 % w/v metanol VAR FÖRSIKTIG: Brandfarlig och giftig Reagens I3. Väteperoxid (20x) 1 ml, 0,6 % H 2 O 2 Reagens J. Mayers hematoxylin 100 ml (För direktbruk) Reagens K. Histomount TM -monteringslösning 4 ml (För direktbruk) VAR FÖRSIKTIG: Mycket brandfarlig och skadlig Kontrollobjektglas L. Objektglas för metodkontrollceller 2 objektglas, vart och ett med 2 formalinfixerade paraffinerade (FFPE) cellinjer, placerade sida vid sida: A) HER2 icke-förstärkt (MCF-7) och B) HER2 förstärkt (SK-OV-3) [En icke-förstärkt cellinje med räknebara resultat rekommenderas för optimal analyskontroll.] REAGENS/MATERIAL OCH UTRUSTNING SOM KRÄVS MEN INTE TILLHANDAHÅLLS Extra reagens/material Invitrogen Art. nr 1. SuperFrost Plus-objektglas ELLER Histogrip TM -objektglaslim 00-8050 2. Positiv vävnadskontroll: vävnadssnitt av FFPE-bröstkarcinom (av duktal, tubulär, lobular eller blandad typ) med HER2- genförstärkning som tidigare bekräftats med CISH eller FISH 3. Negativ vävnadskontroll: vävnadssnitt av FFPE-bröstkarcinom (av duktal, tubulär, lobular eller blandad typ) utan HER2- genförstärkning som tidigare bekräftats med CISH eller FISH 4. Avjoniserat eller destillerat vatten (dh 2 O) 5. Xylen 6. 70 %, 85 %, 95 % och 100 % etanol (EtOH) 7. Täckglas, gummicement, 18G ½ nål och 5 ml spruta ELLER 8. UnderCover TM -täckglas (18 x 18 mm) 00-8403 9. UnderCover TM -täckglas (22 x 22 mm) 00-8404 10. 30 % väteperoxid (H 2 O 2 ) 11. 100 % metanol PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 3 av 25

Utrustning 1. Tidtagarur 2. Pipett (20 µl, 1000 µl) 3. Pipettspetsar 4. Objektglasställ 5. Värmeplatta, aluminiumfolie och 1 l bägare 6. Objektglasvärmare 7. 37 C inkubator 8. PCR-maskin med ett objektglasblock ELLER Värmeblock med digital termometer och 37 C inkubator (± 1 C) och fuktighets kammare för objektglas 9. Vattenbad (som klarar ett temperaturintervall på 70 80 C) med en kalibrerad termometer 10. Coplin-kyvetter och färgkyvetter 11. Ljusfältsmikroskop med 20X och 40X objektiv Försiktighetsåtgärder För diagnostisk användning in vitro. Endast för utbildade fackmän. Använd inte kiten efter det utgångsdatum som anges på etiketten. Om produkten förvaras under andra betingelser än dem som anges på bipacksedeln måste dessa förvaringsbetingelser bekräftas av användaren. Intag av föda eller dryck, rökning eller sminkning bör ej utföras i anslutning till hanteringen av kitmaterial. Allmän god laboratoriesed (GLP) bör iakttagas. Det finns för närvarande ingen testmetod som helt kan säkerställa eliminering av eventuella biologiska risker. Hantera alla material vid biosäkerhetsnivå 2, som rekommenderas för allt potentiellt smittsamt mänskligt material i handboken från Centers for Disease Control/National Institutes for Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4 :e upplagan, april 1999. Munpipettera inte reagens och låt inte prov och reagens komma i kontakt med hud och slemhinna. Om reagens kommer i kontakt med hud eller slemhinna, skölj de utsatta områdena med rikliga mängder vatten. Reagensen B, F och G innehåller 0,1 % natriumazid, reagens H innehåller 0,005 % gentamycinsulfat och 0,1 % proclin, reagens I2 innehåller 85 % w/v metanol och reagens I3 innehåller 0,6 % väteperoxid. Vid produktkoncentrationer krävs ingen riskmärkning av reagensen. Se de materialsäkerhetsdatablad som åtföljer substansen för att få närmare information Reagens B innehåller pepsin och detta enzym kan ge allergiska reaktioner vid hudkontakt. Använd temperaturkalibrerade vattenbad, värmeblock och hybridiseringsugn för att få bästa möjliga resultat. Vissa av reagensen i denna kit innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Natriumazid kan reagera med bly- eller kopparrör och bilda explosiva metallazider, särskilt om den ackumuleras. Vid avyttring av reagens med natriumazid spola med rikliga mängder vatten för att undvika ackumulering av kemiskt riskavfall i avloppsrören. Vissa reagens i denna kit innehåller proclin, natriumazid eller väteperoxid. Dessa reagens är klassificerade som skadliga eftersom de irriterar hud och slemhinna. Dessa substanser levereras i utspädd form när de förekommer som komponenter i denna kit, vilket därför minskar riskerna för exponering avsevärt, men inte fullständigt. Undvik kontakt med hud, ögon och kläder. Se de materialsäkerhetsdatablad som åtföljer substansen för att få närmare information. 3,3 -diaminobenzidintetraklorid (DAB) kan vara farlig vid förtäring, inandning eller upptag genom huden och kan irritera ögon, hud, slemhinna och övre andningsvägarna. DAB är ett misstänkt cancerframkallande medel; rådfråga landsomfattande, regionala eller lokala regulationsmyndigheter för rekommendationer avseende avyttring. Undvik avdunstning av reagens I2. Metanol avdunstar lätt. Vidtag åtgärder för att undvika avdunstning som att försluta behållaren och stänga locket omedelbart efter användning. Avdunstningen av metanol kan orsaka utfällning av DAB, vilket kan påverka färgningsresultaten. Undvik avdunstning under hybridisering genom att säkerställa att objektglasen är ordentligt tillslutna och att fuktigheten är tillräckligt hög i hybridiseringskammaren. Förbehandlingen med enzym kan variera beroende på fixering och vävnadstjocklek. För de flesta vävnadssnitt gäller att (4 5 µm) fixerat med 10 % neutralbuffrat formalin, 5 minuters förbehandling med enzym är optimal. För vävnader med okänd fixering bör en enzymtitrering (t.ex. 2 min., 5 min. och 10 min.) utföras där den optimala spjälkningstiden ställs in med utgångspunkt från de initiala resultaten. PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 4 av 25

Reagens C Märkt HER2-prob innehåller formamid som är skadlig. R21 Farligt vid hudkontakt R22 Farligt vid förtäring R61 Kan ge fosterskador S24 Undvik kontakt med huden S36 Använd lämpliga skyddskläder S37 Använd lämpliga skyddshandskar S39 Använd skyddsglasögon eller ansiktsskydd Reagens I2 DAB-lösning innehåller metanol som är brandfarlig och giftig. Se de materialsäkerhetsdatablad som åtföljer substansen för att få närmare information. R10 Brandfarlig R23/24/25 Giftigt vid inandning, hudkontakt och förtäring S45 Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart läkare S36 Använd lämpliga skyddskläder S37 Använd lämpliga skyddshandskar Reagens K Histomount-monteringslösning innehåller toluen som är mycket brandfarligt och skadligt vid inandning. Se materialsäkerhetsdatabladet för närmare information. R11 Mycket brandfarlig R20 Farligt vid inandning S2 Förvaras oåtkomligt för barn S16 Förvaras åtskilt från antändningskällor Rökning förbjuden S25 Undvik kontakt med huden S29 Töm ej i avloppet S33 Vidtag åtgärder mot statisk elektricitet Alla reagens som har framställts för direktbruk har spätts ut optimalt. Ytterligare spädning kan påverka analysresultaten negativt. Inkubationstider, reagens och temperaturer är optimerade. Användning av andra inkubationstider, reagens eller temperaturer kan påverka analysresultaten negativt. Användning av andra vävnadsfixativ eller vävnadstjocklekar rekommenderas inte och kan påverka analysresultaten negativt. Rådfråga lokala regulationsmyndigheter för avyttring av potentiellt giftiga komponenter. Minimera mikrobiell kontaminering för att undvika icke-specifik färgning. Använd omfattande försiktighetsåtgärder vid hantering av reagens. Använd skyddshandskar, skyddsrock och skyddsglasögon vid hantering av misstänkta cancerframkallande medel. Förvaring av reagens Förvaring av SPOT-Light HER2 CISH-kit bör förvaras vid 2 8 C. Förvara reagens J vid rumstemperatur (15 30 C). OBS!: Reagens B kan påverkas negativt om det exponeras för hög temperatur. Förvara detta reagens vid 2 8 C omedelbart efter användning. Förvara inte detta reagens vid rumstemperatur. Förvara en PBS Tween 20 bruksbuffert vid rumstemperatur (15 30 C) under upp till en 1 vecka. Använd inte kiten efter det utgångsdatum som anges på etiketten. Om produkten förvaras under andra betingelser än dem som anges på bipacksedeln måste dessa förvaringsbetingelser bekräftas av användaren. Även om det inte finns några synliga tecken som tyder på instabilitet hos produkten är det viktigt att utvärdera kontrollobjektglasen. Ta kontakt med vår tekniska supportavdelning om det finns misstanke om att det är något problem med kiten. PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 5 av 25

Bruksanvisning A. Provberedning Paraffinerade vävnadssnitt: Lämpliga att använda är vävnader fixerade i neutralbuffrat formalin under 6 48 timmar före paraffinering. Andra fixativ än 10 % neutralbuffrat formalin har inte optimerats för detta protokoll och är inte lämpliga att använda. Vävnadssnitt (4 5 µm tjocka) måste monteras på HistoGrip -behandlade objektglas eller Superfrost Plusmikroskopobjektglas. Använd alltid vävnadssnitt av standardtjocklek när det är möjligt för att säkerställa jämn färgning med CISH-detektions- och motfärgningsreagens 28 Lufttorka objektglasen eller torka vid 37 C och ugnstorka därefter under 2 4 timmar vid 60 C. Ordentligt fixerade och paraffinerade vävnader håller under obegränsad tid före snittning och montering på objektglas om de förvaras på en kall torr plats (15 30 C). 26,27 Vävnadssnitt som är 2 3 µm tjocka kan ge falskt låga värden för antalet genkopior. B. Standardmässig CISH-procedur för FFPE-vävnadssnitt Kommentarer till proceduren Alla reagens utom reagens C (HER2-prob) bör jämviktas till rumstemperatur (15 30 C) före användning. HER2-proben kan användas kall utan jämviktning till rumstemperatur. Varje inkubation bör utföras vid rumstemperatur (15 30 C), om ej annat anges. Genom hela proceduren är det viktigt att vävnadssnittet inte torkar ut mellan stegen, om ej annat anges. Genom hela proceduren behövs flera tvättningar. Vid varje tvättning måste en nyberedd lösning användas. Kontrollobjektglasen ska köras i anslutning till patientobjektglasen på samma sätt som testproverna under alla steg. Om ej annat anges utförs alla steg vid rumstemperatur (15 30 C). Det tar mer än åtta timmar att genomföra hela proceduren: en bekväm uppdelning presenteras nedan, med start på dag 1 med borttagning av paraffinet via denaturering och hybridisering (över natt) samt med fortsättning på dag 2 med den omfattande tvättningen fram till ljusfältsmikroskopi. De Invitrogen-reagens som levereras tillsammans med kiten är nödvändiga för CISH-proceduren. Om andra reagens används kan det leda till hög bakgrund eller en minskning eller förlust av CISH-signal. Utbyte av något av de reagens som levereras tillsammans med kiten kan göra att analysresultaten blir ogiltiga. Procedur dag 1 1. Beredning av reagens Xylen (2 objektglasbehållare), 100 % EtOH (3 objektglasbehållare) o Tillslut ordentligt och förvara upp till en vecka vid rumstemperatur (15 30 C) eller tills 100 objektglas behandlats. Serier med etanol (EtOH) o Förbered separata behållare med 70 %, 85 %, 95 % och 100 % EtOH. o Tillslut ordentligt och förvara upp till en vecka vid rumstemperatur (15 30 C) eller tills 100 objektglas har behandlats. Märk varje tvättreagens på lämpligt sätt och anteckna i vilken turordning de används i proceduren och behåll denna turordning. PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 6 av 25

2. Borttagning av paraffinet Obs!: Bered tillräckligt med reagens för varje objektglasbehållare som behövs för antalet objektglas i körningen. För varje tvättning behövs en separat reagensvolym. Om nästa steg inte kan utföras omedelbart ska objektglasen lufttorkas efter indränkning i 100 % EtOH tre gånger istället för att tvätta objektglasen i dh2o tre gånger. a) Nedsänkning i xylen 2 gånger, 5 min. vardera b) Indränkning i 100 % EtOH 3 gånger, 3 min. vardera c) Tvättning i dh2o 3 gånger, 2 min. vardera För att få optimala och reproducerbara resultat krävs fullständig borttagning av paraffinet. 3. Värmeförbehandling Obs!: Objektglasen måste kokas eller värmas upp vid en temperatur 98 C under 15 min. i värmeförbehandlingslösning (reagens A). Objektglasen bör inte överhettas vilket säkerställs genom upprätthållande av en temperatur på 98 C till 100 C. Vi rekommenderar att värmeplattan används för detta steg. (För protokoll som innebär användning av en tryckkokare med en tryckmätare eller temperaturmätare eller mikrovågsugn med temperaturmätare, kontakta Invitrogens tekniska supportavdelning på techsupport@invitrogen.com. Värmeförbehandlingslösningen (reagens A) kan användas upp till två gånger före avyttring. a) Placera objektglasen i objektglasstället. b) Värm värmeförbehandlingslösningen (reagens A) i en bägare på en värmeplatta till konstant kokning och temperaturregistreringar på 98 C. Bägaren bör täckas med antingen ett urglas eller aluminiumfolie för att förhindra avdunstning av buffert. c) Placera objektglasen i den kokande lösningen, täck bägaren, slå på tidtagaruret när temperaturen uppnår 98 C eller när det på nytt uppstår bubblor vid kokningen och koka under 15 min. Säkerställ att temperaturen upprätthålls vid 98 C till 100 C. d) Överför omedelbart objektglasen till dh2o vid rumstemperatur (15 30 C). e) Tvätta tre gånger i dh2o, 2 min. vardera 4. Spjälkning med enzym Obs!: För de flesta bröstvävnader gäller, 5 min. spjälkning med enzym vid rumstemperatur (15 30 C) åstadkommer optimala CISH-resultat. Spjälkningstiden bör justeras med utgångspunkt från de initiala resultaten med 5 min. spjälkningstid. En annan enzyminkuberingstid kan eventuellt behövas beroende på vävnadstjocklek och fixeringsmetod. En enzymspjälkningsundersökning tyder på att enzymspjälkningstiden kan vara i intervallet 2 20 min. och kommer att ge en CISH-signal som är lämplig för HER2-utvärdering i en uppsättning arkiverade bröstvävnadsprover. I en överensstämmande undersökning som är avsedd att stödja användningen av CISH i jämförelse med FISH, vilken använde sig av kliniska prover av bröstcancervävnad som hade behandlats inom 12 månader från studiedatumet, gav enzymspjälkningstiden på 5 min. optimala CISH-signaler för utvärdering av HER2-genen. (28) a) Jämvikta enzymförbehandlingslösningen (reagens B) till rumstemperatur (15 30 C). b) Tillsätt en tillräcklig volym av reagens B för att täcka vävnadssnittet och inkubera under 5 min. vid rumstemperatur (15 30 C). c) Tvättning i dho 3 gånger, 2 min. vardera. 5. Dehydrering i etanolkoncentrationsserier: a) 70 % EtOH 2 min. b) 85 % EtOH 2 min. c) 95 % EtOH 2 min. d) 100 % EtOH 2 min. e) 100 % EtOH 2 min. 6. Lufttorka objektglasen 20 min. eller tills de torkat. Märk objektglasen med en märkpenna vid behov. 7. Denaturering och hybridisering Obs!: Använd en PCR-maskin med objektglasblock eller ett värmeblock med en bildskärm som visar digital temperatur och en fuktkammare med 37 C inkubator för objektglas eller liknande instrumentering. Kontrollera att fuktigheten i fuktkamrarna upprätthålls. Om hybridisering utförts under kortare tidsperioder kan det leda till en svagare signal. Probdenaturering vid en lägre temperatur än rekommenderat i protokollet kan leda till en PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 7 av 25

svag eller obefintlig CISH-signal. Om inkubationstiderna ändras kan det antingen leda till en svag signal eller bakgrundsfärgning. a) Tillsätt 15 µl HER2-prob (reagens C) till mittpunkten av 22 x 22 mm täckglaset. Beroende på vävnadsstorleken kan en större eller mindre probvolym behövas. Använd följande probvolym som är baserad på täckglasets storlek: 18 mm x 18 mm 10 µl 22 mm x 22 mm 15 µl 24 mm x 30 mm 20 µl b) Placera täckglaset, probsidan ned, på ett lämpligt område på det vävnadsprov som finns på objektglaset. Invitrogens CISH UnderCover -täckglas kan användas i stället för ett standardtäckglas. Vid användning av CISH UnderCover -täckglas ska pappersbaksidan skalas av varefter det exponerade täckglaset (varifrån papperet precis avlägsnats) placeras på ett lämpligt område på objektglaset för att täcka vävnadsprovet. Tryck ner tejpkanterna så att täckglaset tillsluts och avdunstning förhindras. TRYCK INTE MOT TÄCKGLASETS MITT. c) Vid användning av ett standardtäckglas måste täckglaset tillslutas så att avdunstning förhindras under inkubation. Tillslutning av täckglaset kan åstadkommas med hjälp av en 5 ml spruta och en 18G ½ nål. Fyll sprutan med gummicement och applicera ett tunt skikt på täckglasets kanter, med en lätt överlappning på objektglaset. d) Låt gummicementet torka (~10 min.) för att förhindra att täckglaset glider av objektglaset. e) Denaturering och hybridisering kan utföras med hjälp av en PCR-maskin med objektglasblock eller ett värmeblock med en bildskärm som visar digital temperatur tillsammans med en fuktkammare för objektglas och 37 C inkubator. 1) Vid användning av en PCR-maskin med objektglasblock: Denaturera vid 95 C (± 1 C) under 5 min., följt av inkubation över natt (10 18 timmar) vid 37 C (± 1 C). 2) Vid användning av ett värmeblock och en fuktighetskammare med 37 C inkubator: Denaturera vid 95 C (± 1 C) under 5 min., följt av inkubation över natt (10 18 timmar) vid 37 C (± 1 C) i en fuktkammare. Procedur dag 2 8. Beredning av reagens PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning) o Tillsätt en förpackning PBS-pulver (reagens E1) till 1 l dh 2 O. Blanda. PBS/Tween 20-buffert (0,01 % Tween) o Tillsätt 10 droppar 50 % Tween 20 (reagens E2) till 1 l PBS (från ovan). Blanda. o Förvara vid rumstemperatur (15 30 C) under upp till 1 vecka. Substrat-kromogenlösning (DAB) o Bered denna lösning omedelbart före användning. o Tillsätt 1 droppe av varje reagens (I1, I2, I3) till 1 ml dh 2 O. Blanda väl. 3 % H 2 O 2 i absolut metanol o Tillsätt 1 del 30 % H 2 O 2 till 9 delar metanol. o Tillslut ordentligt och förvara upp till en vecka vid rumstemperatur (15 30 C) eller tills 100 objektglas har behandlats. Xylen (2 objektglasställ) o Tillslut ordentligt och förvara upp till en vecka vid rumstemperatur (15 30 C) eller tills 100 objektglas har behandlats. 9. Omfattande tvättning Obs!: Om högre temperaturer än de som anges i proceduren används kan det leda till en minskning eller total förlust av CISH-signalen. Tvättningar vid en alltför låg temperatur kan leda till en hög bakgrund. En kalibrerad termometer måste användas för att säkerställa att värmebadet uppnår och upprätthåller rätt temperatur. a) Sätt på 70 C (±1 C)-vattenbadet och se till att det kommer upp i temperatur. b) Bered två Coplin-kyvetter innehållande SSC-buffert (reagens D), en vid rumstemperatur, den andra uppvärmd till 70 C. c) Skala av gummicementet eller UnderCover -täckglaset. Låt inte vävnadssnittet torka ut. PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 8 av 25

d) För att avlägsna täckglaset utan slitage på vävnaden: Dränk in objektglasen i rumstempererad SSC i förväg under ~2 3 min. tills täckglasen enkelt glider av. Fortsätt sedan med nästa steg. e) Skölj objektglasen snabbt i kyvetten innehållande rumstempererad (15 30 C) SSC, sänk därefter ned objektglasen under 5 min. i Coplin-kyvetten innehållande SSC i 70 C (±1 C)-vattenbadet. f) Tvätta objektglasen i dh2o 3 gånger, 2 min. vardera. 10. Immundetektion a) Sänk ned objektglasen i 3 % H2O2 i 100 % metanol under 10 min. b) Tvätta i PBS/Tween 20 (0,01 %) 3 gånger, 2 min. vardera. c) Tillsätt CAS-Block TM (reagens F): 2 3 droppar/objektglas i en tillräcklig volym för att täcka vävnaden och inkubera under 10 min. vid rumstemperatur (15 30 C). d) Sug upp reagens F med en labbservett. Skölj inte. e) Tillsätt anti-digoxigeninantikropp från mus (reagens G): 2 3 droppar/objektglas, eller en tillräcklig volym för att täcka vävnaden, och inkubera under 30 min. vid rumstemperatur (15 30 C). f) Tvätta i PBS/Tween 20 (0,01 %) 3 gånger, 2 min. vardera. g) Tillsätt anti-mus-hrp-polymerkonjugat från get (reagens H): 2 3 droppar/objektglas, eller en tillräcklig volym för att täcka vävnaden och inkubera under 30 min. vid rumstemperatur (15 30 C) i en fuktkammare. h) Tvätta i PBS/Tween 20 (0,01 %) 3 gånger, 2 min. vardera. i) Under tvättningen ska DAB-substrat-kromogenlösningen beredas: tillsätt en droppe av varje reagens (reagens I1, I2, I3) till 1 ml dh 2 O. j) Tillsätt substrat-kromogenlösning (DAB): 2 3 droppar/objektglas, eller en tillräcklig volym för att täcka vävnaden, och inkubera under 30 min. vid rumstemperatur (15 30 C) i en fuktkammare. k) Placera objektglasen i objektglasstället. l) Tvätta under rinnande kranvatten under 2 min. 11. Motfärgning och montering Obs!: Motfärga snabbt under 3 5 s. och undersök vävnaden under mikroskop utan täckglaset. Motfärga under ytterligare 3 5 s. om det finns önskemål om starkare färgning av kärnan. Motfärgningstiden är beroende av de vävnader som används. Mörk motfärgning rekommenderas inte eftersom det kan skymma positiva färgningssignaler. a) Motfärga vävnad med hematoxylin (reagens J): 3 5 s. b) Tvätta under rinnande kranvatten under 2 min. c) Dehydrera i EtOH-koncentrationsserier under 2 min. i varje koncentration. (70 %, 85 %, 95 %, 100 %, 100 %, sparade från dag 1 och använda i samma ordning.) d) Nedsänkning i xylen 2 gånger, 2 min. vardera. Denna xylentvättlösning måste vara en annan än den som användes dag 1. Den kan återanvändas i detta steg under 1 vecka eller till upp till 100 objektglas. e) Täckglas med Histomount -monteringslösning (reagens K). f) Förvara objektglas vid rumstemperatur (15 30 C) för senare analys av resultaten. Procedurens begränsningar SPOT-Light HER2 CISH-kiten kan inte detektera de 5 % (10) rapporterade bröstcancrar som är positiva med avseende på immunohistokemi (IHC), men negativa med avseende på HER2-genförstärkning. CISH är ett flerstegsförfarande som kräver särskild övning med avseende på att använda passande reagens, välja ut vävnader, fixera, behandla, preparera CISH-objektglasen och tolka färgningsresultaten. Vävnadsfärgning är beroende av hanteringen och behandlingen av vävnadsproverna före färgning. Alltför stark eller ofullständig motfärgning kan äventyra en riktig tolkning av resultaten. Varje avvikelse från den rekommenderade testproceduren kan göra att rapporterade förmodade resultat blir ogiltiga, vilket betyder att lämpliga kontroller måste användas och dokumenteras. Användare som avviker från den rekommenderade testproceduren måste ansvara för tolkningen av provresultaten under dessa omständigheter. SPOT-Light HER2 CISH-kiten har endast optimerats för identifiering och kvantifiering av HER2/neu genen i interfaskärnor i formalinfixerade, paraffinerade vävnadsprov av mänskliga bröstcancrar. Andra typer av prover eller fixativ har inte validerats. Den kliniska tolkningen av varje testresultat bör fastställas inom ramen för patientens sjukdomshistoria och andra diagnostiska laboratorietestresultat. PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 9 av 25

Kvalitetskontroll Positiva och negativa kontroller på ett enstaka objektglas Kontrollobjektglas L. A B Bild 1. Kontrollobjektglas L innehåller icke-förstärkt cellinje A (MCF-7) och förstärkt cellinje B (SK-OV-3). Obs!: cellinjerna är inte ritade skalenligt och är mindre än vad som anges i diagrammet. CISH-signalen bör vara brun, tydlig och lätt att utvärdera. De ingående kontrollobjektglasen (objektglas L) innehåller två 4 µm snitt skurna från FFPE-cellblock som preparerats från två olika cellinjer. Dessa objektglas bör användas som metodkontroller. Cellinje A (MCF-7) är icke-förstärkt och kommer att uppvisa 5 signaler eller fläckar per kärna. Cellinje B (SK-OV-3) är förstärkt och kommer att uppträda som små-till-stora DAB-kluster i kärnan. Kontrollcellinjens objektglas ska köras tillsammans med varje körning av patientobjektglasen och bör behandlas på samma sätt som vävnadssnitten. Om kontrollobjektglaset (objektglas L) är negativt för både A-cellinjen och B-cellinjen är detta ett tecken på att ett fel uppstått under CISH-proceduren. Den positiva kontrollcellinjen (B), som är känd för att uppvisa HER2-förstärkning bör först undersökas för att säkerställa att alla reagens fungerar ordentligt. Förekomsten av genkluster, eller >5 individuella signaler eller fläckar, inom kärnan hos en enstaka cell är ett tecken på förmodad positiv reaktivitet. Om den positiva kontrollen inte lyckas visa förekomsten av kluster eller >5 signaler per kärna i en majoritet (>50 %) av karcinomcellerna bör de resultat som erhålls för patientproverna ogiltigförklaras. Den negativa eller normala kontrollcellinjen (A), som är känd för att uppvisa HER2-icke-förstärkning bör innehålla 5 fläckar i cellkärnan hos varje cell. Om det förekommer icke-specifik färgning i kärnorna hos normalkontrollen (A), bör de resultat som erhålls för patientproverna ogiltigförklaras. Om det förekommer icke-specifik färgning framträder vanligen en diffus färgningsyta. Då och då kan sporadisk brunfärgning utanför kärnan observeras i de vävnadssnitt som har genomgått en alltför stark formalinfixering. I dessa fall bör resultaten tolkas med försiktighet. Icke-specifik färgning bör inte sammanblandas med positiva CISH-signaler. En positiv vävnadskontroll som består av en bröstcancervävnad med bekräftad HER2-förstärkning bör, om den används, uppvisa förekomsten av genkluster eller >5 individuella signaler eller fläckar per kärna i en majoritet (>50 %) av karcinomcellerna, vilket tyder på förväntad positiv reaktivitet. Om den positiva kontrollen inte lyckas visa förekomsten av kluster eller >5 signaler per kärna i >50 % av tumörcellerna bör de resultat som erhållits för patientproverna ogiltigförklaras. En negativ vävnadskontroll som består av en bröstcancervävnad med bekräftad icke-förstärkning av HER2 bör, om den används, innehålla <5 signaler per kärna i en majoritet (>50 %) av karcinomcellerna. I allmänhet bekräftar förekomsten av högst två signaler eller fläckar i kärnan hos normalvävnadens (normala epitelceller eller stromaceller i tumören) andel av den positiva vävnadskontrollen att proben och immundetektionsreagensen inte korsreagerar med cell- eller vävnadskomponenter. Om det förekommer icke-specifik färgning i kärnan hos den normala vävnadsandelen av den positiva vävnadskontrollen bör de resultat som erhålls för patientproverna ogiltigförklaras. Variationer i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium måste valideras eftersom de kan ge betydande skillnader i resultat, vilket erfordrar regelbundna internkontroller förutom de följande procedurerna. Tolkning Bedömning av objektglasens lämplighet HER2 CISH-fläckarna (signalerna) bör vara små men klart urskiljbara vid användning av ett 20X 40X objektiv. Fläckarna framträder som bruna fläckar jämfört med motfärgningen. Om det inte framträder några fläckar i provet måste analysen upprepas. Ring vår tekniska supportavdelning på 1-800-955-6288 (endast Förenta Staterna) för att diskutera orsakerna till problemet. PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 10 av 25

CISH-signalutseende se Appendix A, Riktlinjer för tolkning av HER2 CISH-test HER2 CISH-fläckar framträder som: En enstaka fläck (Figur G). En enstaka fläck har en jämn, rund kant i normala celler eller karcinomceller. En enstaka fläck representerar en enstaka HER2-genkopia. En dublett (Figur H). Fläckar framträder som par och representerar inte ett egentligt litet kluster. Om två signaler är separerade med mindre än en signals diameter, bör dessa signaler räknas som en enstaka fläck. Dubbletten är resultatet av kromosomdelning, där varje signal tillhör paret med systerkromatider 29 Ett litet kluster (Figur E). Ett litet kluster är en oregelbundet formad grupp av signaler med en diameter som är 3 5 gånger så stor som den hos en enstaka fläck. En enstaka fläck från karcinomceller eller normala epitelceller från samma objektglas kan användas som referens. Ett stort kluster (Figur A). Ett stort kluster är en oregelbundet formad grupp av signaler med en diameter som är 5 gånger så stor som den hos en enstaka fläck. En enstaka fläck från karcinomceller eller normala epitelceller från samma objektglas bör användas som referens. Förstoring 10X 20X 40X 60X eller 100X CISH-signal Enstaka fläckar är knappt synliga och förbises lätt. Enstaka fläckar är små, men klart urskiljbara. Enstaka fläckar identifieras lätt. Ej nödvändig. Val av målfält för räkning av HER2 CISH-signaler: Scanna CISH-färgade prover med hjälp av 4X 20X-objektiv för att identifiera de histopatologiskt mest representativa områdena av invasivt karcinom. Undvik områden med nekros, överlappande signaler som beror på överlappande kärnor och kärnor med svag signalintensitet. Undvik komponenter från intraduktalt karcinom (DCIS) i invasiva karcinom. Utvärdera HER2-genens tillstånd med avseende på möjlig intratumoral heterogenitet före CISH-räkning. Om provet är homogent ska ett vävnadsområde med starka CISH-signaler väljas ut för signalräkning. Fortsätt med signalräkning. Om HER2-gentillståndet i den invasiva karcinomkomponenten i provet har intratumoral heterogenitet ska områden väljas som representerar varje HER2-gentillstånd för signalräkning. Ett vävnadsprov är heterogent om HER2-gentillståndet (förstärkta och icke-förstärkta celler) varierar i olika områden i samma snitt av en primär bröstcancer. Celler i varje heterogenitetsområde behöver utvärderas för att göra det möjligt att bestämma vilket HER2-tillstånd (förstärkt eller icke-förstärkt) som dominerar i mer än 50 % av tumörsnittet. Fortsätt med signalräkning av det område där HER2-tillståndet är dominerande för denna tumör. Signalräkning Använd ett 40X objektiv. Ett större objektiv kan användas vid behov, men oljeimmersion är inte nödvändig. Se Appendix A, Riktlinjer för tolkning av HER2 CISH-test. En individuell HER2-gen framträder som en liten, rund, enstaka fläck (Figur G). Räkna inte kärnor som överlappar varandra eller alla områden i vilka kärnor inte är synliga. Räkna endast den CISH-signal som finns inuti en kärna. Uteslut udda, sporadiska signaler som kan orsakas av spill av HER2 DNA från omsättning av cancerceller, utanför kärnorna. Icke-förstärkning o Definieras som 1 5 enstaka fläckar i majoriteten (>50 %) av karcinomcellerna i det utvalda vävnadsområdet. o Det är inte nödvändigt att räkna fläckarna i 30 celler. Valfritt: använd arbetsbladet i Appendix B, HER2 CISH-graderingsblad för cellräkning. Rapportera resultaten som medeltalet från räkning av totalt 30 celler, för att erhålla en klar diagnos av icke-förstärkning. Förstärkning o Definieras som: o >5 fläckar i majoriteten (>50 %) av karcinomcellerna i det utvalda vävnadsområdet, eller o Stora kluster i majoriteten (>50 %) av karcinomcellerna i det utvalda vävnadsområdet, eller o En blandning av flera fläckar och stora kluster i majoriteten (>50 %) av karcinomcellerna i det utvalda vävnadsområdet, eller PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 11 av 25

o o En blandning av flera fläckar och små kluster i majoriteten (>50 %) av karcinomcellerna i det utvalda vävnadsområdet, eller o Små kluster i majoriteten (>50 %) av karcinomcellerna i det utvalda vävnadsområdet För samtliga ovanstående fall är det inte nödvändigt att räkna fläckarna i 30 celler. Valfritt: använd arbetsbladet i Appendix B, HER2 CISH-graderingsblad för cellräkning. Rapportera resultaten som medeltalet från räkning av totalt 30 celler, för att erhålla en klar diagnos av förstärkningen. För räkningsändamål ska ett litet kluster räknas som 5 fläckar och ett stort kluster som 10 fläckar. o Kort förklaring: Tilldelandet av särskilda fläckantal till små eller stora kluster är godtyckligt för kvantifieringsändamål. Normalt har celler två HER2-genkopior. Celler som har replikerat sitt DNA, men ännu inte delat sig har 4 genkopior. Därför är ett litet kluster ett tecken på förstärkning och kommer att ha ett lägsta antal på 5 genkopior. Ett stort kluster, som är minst dubbelt så stort som ett litet kluster kommer att ha ett lägsta antal på 10 genkopior. Oklara fall av förstärkning eller icke-förstärkning Var försiktig med tolkningen av prover som inte klart tillhör förstärknings- eller ickeförstärkningsgruppen. Dessa prover uppvisar 4 6 fläckar i majoriteten (>50 %) av karcinomcellerna i det utvalda målfältet. När medeltalet för antalet fläckar är mellan 4 och 6 efter att 30 karcinomceller har räknats bör ytterligare 30 celler räknas vilket motsvarar totalt 60 celler. Om tveksamhet fortfarande råder bör analysen upprepas med ett nytt provobjektglas. Rapportera resultatet med hjälp av arbetsbladet i Appendix B, HER2 CISH-graderingsblad. 1. Räkna fläckarna i 30 tumörceller i det utvalda vävnadsområdet. Se nr 4 nedan om det förekommer små kluster. 2. Summera antalet fläckar i de 30 cellerna och beräkna medeltalet. 3. Registrera resultatet baserat på medeltalet för 60 celler 4. Om en blandning av enstaka fläckar och små kluster (beroende på klusterbildning av enstaka fläckar) observeras eller om endast små kluster observeras: Räkna ett litet kluster som 5 fläckar. En enstaka fläck från karcinomcellerna eller de normala epitelcellerna från samma objektglas kan användas som referens vid bedömning av vad som motsvarar ett litet kluster. 5. Rapportera resultaten som medeltalet från räkning av totalt 60 celler för att erhålla en diagnos på antingen förstärkning eller icke-förstärkning enligt Invitrogens riktlinjer. Rapportering av resultat Resultaten kan rapporteras med hjälp av arbetsbladet i Appendix B, HER2 CISH-graderingsblad. HER2- tillståndsrapporten måste registreras enligt Invitrogens riktlinjer, särskilt vid oklara fall av förstärkning eller icke-förstärkning. PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 12 av 25

Sammanfattning av tolkningen Förstärkning Ickeförstärkning >5 fläckar eller stora kluster eller en blandning av flera fläckar och stora kluster eller en blandning av flera fläckar och små kluster eller små kluster med den HER2-gen som förekommer per kärna i en majoritet (>50 %) karcinomceller i det vävnadsområde som valts ut för räkning. Se figurerna A, B, C, D och E i Appendix A, Riktlinjer för tolkning av HER2 CISH-test. Ett stort kluster är en oregelbundet formad grupp av signaler med en diameter som är 5 gånger så stor som den hos en enstaka fläck. En enstaka fläck från karcinomceller eller normala epitelceller från samma objektglas bör användas som referens. Se Appendix A, Figur A. Ett litet kluster är en oregelbundet formad grupp av signaler med en diameter som är 3 5 gånger så stor som den hos en enstaka fläck. En enstaka fläck från karcinomceller eller normala epitelceller från samma objektglas bör användas som referens. Se Appendix A, Figur E. 1 5 fläckar med den HER2-gen som förekommer per kärna i en majoritet (>50 %) karcinomceller i det vävnadsområde som valts ut för räkning. Se Appendix A, Figur F, Figur G och Figur H. En enstaka fläck har en jämn, rund kant och förekommer i normala celler och karcinomceller. PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 13 av 25

Förväntade värden Förekomsten av förstärkt HER2-gen i den allmänna populationen av kvinnor med bröstcancer är 18 30 %. (8, 9) I undersökningar där HER2-genförstärkning har jämförts med överuttryck av HER2-protein har det påvisats att upp till 5 % av bröstcancerpatienterna är positiva för överuttryck av proteinet när de testas med hjälp av immunohistokemi (IHC), men är negativa för HER2-genförstärkning. (10) Särskilda prestandaegenskaper Klinisk prestanda Säkerheten och effektiviteten hos SPOT-Light HER2 CISH-kit utvärderades i en jämförande undersökning innefattande tre testförfaranden: SPOT-Light HER2 CISH-kit, PathVysion FISH och Hercep-test. Undersökningen omfattade två grupper av fall: 226 konsekutiva fall och 60 kompletterande fall. De konsekutiva fallen valdes ut bland konsekutiva bröstcancerfall som undersökts inför patientomvårdnad på två prövningsplatser (prövningsplats A och B). De kompletterande fallen var fall som hade graderats med 2+ med hjälp av immunohistokemi (IHC) (med antikropp AB8) under patientomvårdnad på prövningsplats A. A. Konsekutiva fall I följande tabell sammanfattas fördelningen av CISH- och FISH-resultat jämfört med HercepTest -graderingen. Ett test ansågs giltigt när det erhållna färgade objektglaset var godtagbart för utvärdering. Tabell 1: Resultat från IHC, FISH och CISH Proteinuttryck, HercepTest -gradering 0 1 2 3 Totalt IHC-fall (N) 141 19 21 40 221 (%) 1 63,8 % 8,6 % 9,5 % 18,1 % 100 % Genkvot med FISH HER2-tillstånd Antal giltiga FISH-fall 2 140 19 21 38 218 Förstärkt n (%) 3 1 (0,5) 0 (0,0) 5 (2,3) 31 (14,2) 37 Icke-förstärkt n (%) 3 139 (63,8) 19 (8,7) 16 (7,3) 7 (3,2) 181 Genkopior med CISH HER2-tillstånd Antal giltiga CISH-fall 2 132 17 19 38 206 Förstärkt n (%) 3 1 (0,5) 0 (0,0) 3 (1,5) 32 (15,5) 36 Icke-förstärkt n (%) 3 131 (63,6) 17 (8,3) 16 (7,8) 6 (2,9) 170 1 % = N Totalt N 100 % 2 Antal giltiga FISH-fall (eller CISH-fall) med motsvarande IHC-gradering. 3 % = n Totalt antal giltiga FISH-fall (eller CISH-fall) 100 % CISH-resultat Tabell 2: Överensstämmelse mellan CISH och IHC IHC-resultat Positivt (3+) Negativt (<3+) Totalt Förstärkt 32 4 36 Icke-förstärkt 6 164 170 Totalt 38 168 206 För 20 fall rapporterades att de antingen saknade IHC- eller CISH-testresultat eller hade ogiltiga sådana, varför de exkluderades från tabellen. Positiv överensstämmelse = 32/38 = 84,2 % (95 % CI: 68,8 %, 94,0 %) Negativ överensstämmelse = 164/168 = 97,6 % (95 % CI: 94,0 %, 99,4 %) Total procentuell överensstämmelse = (32+164)/206 = 95,1 % (95 % CI: 91,3 %, 97,7 %) Resultaten uppvisade en konkordans på 95,1 % (95 % CI: 91,3 % 97,7 %), vilket tyder på en stark överensstämmelse mellan SPOT-Light HER2 CISH-kiten och HerceptTest. PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 14 av 25

CISH-resultat Tabell 3: Överensstämmelse mellan CISH och FISH FISH-resultat Förstärkt Icke-förstärkt Totalt Förstärkt 34 0 34 Icke-förstärkt 2 169 171 Totalt 36 169 205 För 21 fall rapporterades att de antingen saknade FISH- eller CISH-testresultat eller hade ogiltiga sådana, varför de exkluderades från tabellen. Positiv överensstämmelse = 34/36 = 94,4 % (95 % CI: 81,3 %, 99,3 %) Negativ överensstämmelse = 169/169 = 100,0 % (95 % CI: 97,8 %, 100,0 %) Total procentuell överensstämmelse = (34+169)/205 = 99,0 % (95 % CI: 96,5 %, 99,9 %) Resultaten uppvisade en konkordans på 99,0 % (95 % CI: 96,5 % 99,9 %), vilket tyder på en stark överensstämmelse mellan SPOT-Light HER2 CISH-kiten och PathVysion HER2-testet. Således tyder graden av överensstämmelse på att resultaten från SPOT-Light HER2 CISH-kit-testet var likvärdiga med PathVysion HER2-testet. En sammanfattning av de 2 fall som uppvisade diskordans mellan SPOT-Light HER2-probtestet och PathVysion HER2-probtestet visas nedan. CISH- och FISH-data presenteras i form av medeltal och intervall och IHC-kolumnen visar HercepTest -graderingen. HER2 CISH (Pos)/FISH (Neg) Tabell 4: Fall med diskordans mellan FISH och CISH HER2 CISH (Neg)/FISH (Pos) Antal fall CISH FISH IHC Antal fall CISH FISH IHC (2, 0,98 %) 1 A-095-01 4,07 (1,00 10,00) 2,81 (1,67 5,00) 2+ B-008 2,77 (2,00 4,00) 2,65 (1,00 6,00) 2+ 1 % = antal fall med diskordans dividerat med totalt antal fall med giltigt FISH och CISH från motsvarande plats 100 % B. Kompletterande IHC 2+ fall Ytterligare 60 IHC 2+ kompletterande fall tillhandahölls av prövningsplats A och testades på prövningsställena A och B. Resultaten från varje prövningsplats visade att SPOT-Light HER2 CISH-kittestet erhöll resultat som var likvärdiga med PathVysion HER2-testet. De korrelerande resultaten sammanfattas i tabellerna 5 och 6. Tabell 5: Överensstämmelse mellan CISH och FISH på prövningsplats A för IHC 2+ fall CISH-resultat FISH-resultat Förstärkt Icke-förstärkt Totalt Förstärkt 6 0 6 Icke-förstärkt 2 46 48 Totalt 8 46 54 6 fall rapporterades antingen sakna resultat eller ha ogiltiga sådana Positiv överensstämmelse = 6/8 = 75,0 % (95 % CI: 34,9 %, 96,8 %) Negativ överensstämmelse = 46/46 = 100,0 % (95 % CI: 92,3 %, 100,0 %) Total procentuell överensstämmelse = (6+46)/54 = 96,3 % (95 % CI: 87,3 %, 99,6 %) Tabell 6: Överensstämmelse mellan CISH och FISH på prövningsplats B för IHC 2+ fall CISH-resultat FISH-resultat Förstärkt Icke-förstärkt Totalt Förstärkt 7 2 9 Icke-förstärkt 2 45 47 Totalt 9 47 56 4 fall rapporterades antingen sakna resultat eller ha ogiltiga sådana Positiv överensstämmelse = 7/9 = 77,8 % (95 % CI: 40,0 %, 97,2 %) Negativ överensstämmelse = 45/47 = 95,7 % (95 % CI: 85,5 %, 99,5 %) Total procentuell överensstämmelse = (7+45)/56 = 92,9 % (95 % CI: 82,7 %, 98,0 %) PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 15 av 25

Antal fall Tabell 7: IHC 2+ fall med diskordans mellan CISH och FISH HER2 CISH (Pos)/FISH (Neg) HER2 CISH (Neg)/FISH (Pos) CISH FISH IHC Antal fall CISH FISH IHC Plats A (2, 3,70 %) 1 S-156-01 2,77 (1,00 5,00) 2,48 (0,50 5,00) 2+ S-173-01 3,67 (1,00 7,00) 2,34 (0,50 8,00) 2+ Plats B (4, 7,14 %) 1 S-171 5,20 (2,00 8,00) 1,08 (0,50 2,00) 3+ S-156 5,00 (1,00 9,00) 2,23 (1,00 5,00) 3+ S-178 20,00 (20,00 20,00) 1,25 (0,50 2,00) 0 S-183 4,13 (3,00 6,00) 2,73 (1,00 6,00) 0 1 % = antal fall med diskordans dividerat med totalt antal fall med giltigt FISH och CISH från motsvarande plats 100 % C. HercepTest 2+ fall Alla konsekutiva och kompletterande fall testades med HercepTest. Fall som gav HercepTest 2+ - gradering kombinerades och testades på båda prövningsplatserna. Resultaten från varje prövningsplats visade att SPOT-Light HER2 CISH-kitet erhöll resultat som var likvärdiga med PathVysion HER2-testet. De korrelerande resultaten sammanfattas i tabellerna 8 och 9. Tabell 8: Överensstämmelse mellan CISH och FISH för HercepTest 2+ fall på prövningsplats A CISH-resultat FISH-resultat Förstärkt Icke-förstärkt Totalt Förstärkt 3 0 3 Icke-förstärkt 4 27 31 Totalt 7 27 34 För 2 fall rapporterades att de antingen saknade FISH- eller CISH-testresultat eller hade ogiltiga sådana, varför de exkluderades från tabellen. Positiv överensstämmelse = 3/7 = 42,9 % (95 % CI: 9.9 %, 81,6 %) Negativ överensstämmelse = 27/27 = 100,0 % (95 % CI: 87,2 %, 100,0 %) Total procentuell överensstämmelse = (3+27)/34 = 88,2 % (95 % CI: 72,6 %, 96,7 %) Tabell 9: Överensstämmelse mellan CISH och FISH för HercepTest 2+ fall på prövningsplats B CISH-resultat FISH-resultat Förstärkt Icke-förstärkt Totalt Förstärkt 4 1 5 Icke-förstärkt 1 35 36 Totalt 5 36 41 För 2 fall rapporterades att de antingen saknade FISH- eller CISH-testresultat eller hade ogiltiga sådana, varför de exkluderades från tabellen. Positiv överensstämmelse = 4/5 = 80,0 % (95 % CI: 28,4 %, 99,5 %) Negativ överensstämmelse = 35/36 = 97,2 % (95 % CI: 85,5 %, 99,5 %) Total procentuell överensstämmelse = (4+35)/41 = 95,1 % (95 % CI: 83,5 %, 99,4 %) Tabell 10: HercepTest 2+ fall med diskordans mellan CISH och FISH HER2 CISH (Pos)/FISH (Neg) HER2 CISH (Neg)/FISH (Pos) Antal fall CISH FISH IHC Antal fall CISH FISH IHC Plats A (4, 11,76 %) 1 A-095-01 4,07 (1,00 10,00) 2,81 (1,67 5,00) 2+ B-008-08 1,77 (1,00 4,00) 2,45 (1,00 5,00) 2+ S-156-01 2,77 (1,00 5,00) 2,48 (0,50 5,00) 2+ S-173-01 3,67 (1,00 7,00) 2,34 (0,50 8,00) 2+ Plats B (2, 4,88 %) 1 A-023 5,20 (2,00 8,00) 1,49 (0,67 3,50) 2+ B-008 2,77 (2,00 4,00) 2,65 (1,00 6,00) 2+ 1 % = antal fall med diskordans dividerat med totalt antal fall med giltigt FISH och CISH från motsvarande plats 100 % PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 16 av 25

D. Polysomifall Två prövningsplatser utvärderade de polysomifall som var baserade på den kliniska praxis som utövas på respektive sjukhus. På prövningsplats A definierades polysomi hos kromosom 17 som förekomst av 3 CEP17-signaler hos minst 10 % av tumörcellerna, medan kriterierna på prövningsplats B var förekomst av 3 CEP17-signaler hos minst 30 % av tumörcellerna. Frekvensen av tumörer med polysomi hos kromosom 17 var 18,68 % på prövningsplats A och 7,91 % på prövningsplats B. Detektionsfrekvensen för polysomi på samma tumöruppsättning varierade väsentligt mellan de två prövningsplatserna beroende på skillnader mellan de polysomidefinitioner som användes på varje prövningsplats. Den överensstämmelsegrad som erhölls på varje prövningsplats, oberoende av varandra, visar att SPOT-Light HER2 CISH-kiten gav resultat som var likvärdiga med PathVysion HER2-testet. Resultaten sammanfattas i tabellerna 11 och 12. Tabell 11: Överensstämmelse mellan CISH och FISH för polysomifall på prövningsplats A CISH-resultat FISH-resultat Förstärkt Icke-förstärkt Totalt Förstärkt 12 0 12 Icke-förstärkt 2 34 36 Totalt 14 34 48 För 3 fall rapporterades att de antingen saknade FISH- eller CISH-testresultat eller hade ogiltiga sådana, varför de exkluderades från tabellen. Positiv överensstämmelse = 12/14 = 85,7 % (95 % CI: 57,2 %, 98,2 %) Negativ överensstämmelse = 34/34 = 100,0 % (95 % CI: 89,7 %, 100,0 %) Total procentuell överensstämmelse = (12+34)/48 = 95,8 % (95 % CI: 85,8 %, 99,5 %) Tabell 12: Överensstämmelse mellan CISH och FISH för polysomifall på prövningsplats B CISH-resultat FISH-resultat Förstärkt Icke-förstärkt Totalt Förstärkt 12 1 13 Icke-förstärkt 0 9 9 Totalt 12 10 22 För 0 fall rapporterades att de antingen saknade FISH- eller CISH-testresultat eller hade ogiltiga sådana, varför de exkluderades från tabellen. Positiv överensstämmelse = 12/12 = 100,0 % (95 % CI: 73,5 %, 100,0 %) Negativ överensstämmelse = 9/10 = 90,0 % (95 % CI: 55,5 %, 99,8 %) Total procentuell överensstämmelse = (12+9)/22 = 95,5 % (95 % CI: 77,2 %, 99,9 %) Antal fall Tabell 13: Polysomifall med diskordans mellan CISH och FISH HER2 CISH (Pos)/FISH (Neg) HER2 CISH (Neg)/FISH (Pos) CISH FISH IHC Antal fall CISH FISH IHC Plats A (2, 4,17 %) 1 A-095-01 4,07 (1,00 10,00) 2,81 (1,67 5,00) 2+ S-156-01 2,77 (1,00 5,00) 2,48 (0,50 5,00) 2+ Plats B (1, 4,55 %) 1 A-023 5,20 (2,00 8,00) 1,49 (0,67 3,50) 2+ 1 % = antal fall med diskordans dividerat med totalt antal fall med giltigt FISH och CISH från motsvarande plats 100 % PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 17 av 25

E. Sammanfattning av resultat från en jämförelse mellan SPOT-Light HER2 CISH-kiten och PathVysion HER2-DNA-probkiten Tabell 14: Sammanfattning av SPOT-Light HER2 CISH-kit och PathVysion HER2-DNA-probkit Typ av fall Konsekutiva fall Kompletterande fall Osäkra fall Polysomifall Plats A Plats B Plats A Plats B Plats A Plats B Antal prover 205 54 56 34 41 48 22 Positiv överensstämmelse i % Negativ överensstämmelse i % Total överensstämmelse i % 94,4 % 75,0 % 77,8 % 42,9 % 80,0 % 85,7 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 95,7 % 100,0 % 97,2 % 100,0 % 90,0 % 99,0 % 96,3 % 92,9 % 88,2 % 95,1 % 95,8 % 95,5 % Analyskänslighet Känsligheten hos SPOT-Light HER2 CISH-kiten testades med hjälp av FFPE-bröstcancervävnadssnitt med ickeförstärkt och förstärkt HER2-tillstånd, såväl som de FFPE-cellinjer som användes i kontrollobjektglasen. HER2- genen detekterades som en enstaka fläck på vävnadssnittet och cellblocksnittet med normal HER2-gen. Varje förstärkt och icke-förstärkt prov uppvisade färgning med 3+ intensitet och god vävnadsmorfologi. Hybridiseringseffektivitet Hybridiseringseffektiviteten fastställdes genom test av 2 vävnadsprover (1 förstärkt, 1 icke-förstärkt, 10 snitt vardera) och 4 cellinjeprover (2 förstärkta, 2 icke-förstärkta). Varje prov analyserades med avseende på antalet celler med HER2-signaler av det totala antalet analyserade celler (100 300 celler). Hybridiseringseffektiviteten fastställdes till 94,7 100 %. För CISH-färgning av 226 kliniska prover från 3 laboratorier var felfrekvensen på varje prövningsplats 8,4 % (19), 1,3 % (3) och 0,9 % (2). (28) Analysspecificitet För att bestämma specificiteten utfördes metafasstudier på cytogenetiskt preparerade objektglas, varvid PCR utfördes med användning av ett HER2-genspecifikt primerpar till HER2 DNA-probtemplatet och DNAsekvensering utfördes för båda ändarna av de BAC-kloner som användes i HER2-DNA-proben. SPOT-Light CISH HER2-proben påvisades binda specifikt till HER2-genlokuset på kromosomband 17q11.2-21. Kromosomens lokalisering fastställdes med hjälp av metafas-fish i normala lymfocyter; PCR-testning påvisade det önskade DNA-bandet och DNA-sekvensering påvisade den rätta kromosomlokaliseringen och omfattningen av HER2-genen. Metodgränser SPOT-Light HER2 CISH-metoden testades vid följande parametrars extremvärden: vävnadstjocklek, förbehandling, denaturering, hybridisering, omfattande tvättning, immundetektion och motfärgning. Det observerades inga signifikanta skillnader i CISH-resultat under följande betingelser: PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 18 av 25

Tabell 15: Metodgränser Godtagbara intervall för analysparametrar Vävnadstjocklek 4 6 µm Värmeförbehandling 99 100 C 10 20 min. Spjälkning med enzym 4-14 min. Denaturering PCR-maskin 93 98 C 2-8 min. Hybridisering 30 39 C 10 18 h Omfattande tvättning 60 78 C 2 8 min. Immundetektion HRP-polymerkonjugat 25v60 min. DAB-kromogen 15 60 min. Motfärgning 3 30 s. Reproducerbarhet Tre separata satser av SPOT-Light HER2 CISH-kiten testades på 3 bröstcancervävnader och 4 cellinjeprover, med olika nivåer av HER2-gen. Det fanns ingen skillnad i analysprestanda mellan de 3 satser som testades. Reproducerbarhet mellan körningar (dag-till-dag) I undersökningen bestämdes reproducerbarheten mellan körningar på tre olika dagar vid CISH-test av bröstcancerprover med tre olika typer av HER2-tillstånd med 3 prover av varje typ. Sammanfattningen är enligt följande: Tabell 16: Reproducerbarhet mellan körningar (dag-till-dag) Genkopia N Icke-förstärkt Icke-förstärkt, polysomi Förstärkt Medeltal N = 9 1,79 3,45 20,22 Standardavvikelse 9 0,05 0,12 1,72 CV 9 3 % 4 % 8 % Observatör-till-observatör-undersökning Tre patologer utbildades i att avläsa objektglas som preparerats och färgats med SPOT-Light HER2 CISH-kiten. För att validera färdigheten erhöll varje patolog åtta färdigfärgade objektglas (6 icke-förstärkta och 2 förstärkta) tillhandahållna av Invitrogen. För båda typerna av fall (icke-förstärkta och förstärkta) tolkades samtliga prover (100 %) korrekt. PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 19 av 25

Tabell 17: Reproducerbarhet mellan observatörer CISH-signal, Medeltal av HER2 CISH-fläckar/cell och HER2-gentillstånd Objektglasidentitet Objektglas nr Observatör 1 Observatör 2 Observatör 3 1 Prov 1 () 2 fläckar 1-5 fläckar 1-2 2 Prov 2 (AM) 3 Prov 3 () Stort kluster + flera fläckar AM 2-5 Stort kluster + flera fläckar AM 1-5 >10 AM 3-5 4 Prov 4 () 2-4 2,8 3-5 5 Prov 5 () 2 1-5 1-2 6 Prov 6 () 2-5 1-5 4 7 Prov 7 (AM) Stort kluster + flera fläckar AM Stort kluster AM Stort kluster + flera fläckar AM 8 Prov 8 () 2-5 3,4 4,3 Reproducerbarhet mellan prövningsplatser Undersökningen av CISH-reproducerbarhet mellan prövningsplatser baserades på 226 konsekutiva fall som upprepades på tre prövningsplatser. Total överensstämmelse i procent för CISH-reproducerbarhet med >5 som gräns för positivitet var 99,0 %, 98,6 % och 98,1 %, vilket påvisade hög reproducerbarhet för testning med SPOT-Light HER2 CISH-kiten. Tabell 18: CISH-reproducerbarhet för alla konsekutiva fall Undersökta av plats A och B Plats A Plats B: CISH-resultat CISH-resultat Förstärkt Icke-förstärkt Totalt Förstärkt 34 0 34 Icke-förstärkt 2 170 172 Totalt 36 170 206 För 20 fall rapporterades att de antingen saknade CISH-testresultat eller hade ogiltiga sådana, varför de exkluderades från tabellen. Total procentuell överensstämmelse = (34+170)/206 99,0 % (95 % CI: 96,5 %, 99,9 %) Tabell 19: CISH-reproducerbarhet för alla konsekutiva fall Undersökta av plats C och plats B Plats C Plats B: CISH-resultat CISH-resultat Förstärkt Icke-förstärkt Totalt Förstärkt 35 0 35 Icke-förstärkt 3 184 187 Totalt 38 184 222 PI84-0150 Rev 0.0 Sidan 20 av 25