Från byn Björbo taget bäck- och älvvattens tjänlighet som livsmedel

Från byn Björbo taget bäck- och älvvattens tjänlighet som livsmedel Gunnar Axelson Gymnasiearbete 100 poäng Naturvetenskapsprogrammet Läsåret 2014/2015 Handledare: Malgorzata Bergman

Abstract The purpose of this study is to determine if water from the river and streams in the village of Björbo is suited as drinking water when considering the microbiological aspects of the limits set by the Swedish National Food Agency in SLV 2001:30, as well as determining which factors could account for differences in bacteria levels between the watercourses. This have been done through membrane filtration followed by incubation of the filters after adding a substrate for coliform bacteria, allowing the number of total coliform bacteria and Escherichia coli to be counted. The study shows that all of the examined samples of river and stream water contain levels of total coliform bacteria and or Escherichia coli higher than the in drinking water allowed. The result gives reason to believe that the soil type as well as the flow rate is the most important factors associated with a high count of total coliforms, whereas the discharge of sewage are associated with high levels of Escherichia coli. Keywords: membrane filtration, water quality, coliform bacteria, Escherichia coli

Innehållsförteckning 1 Inledning... 3 2 Syfte... 3 3 Frågeställning... 3 4 Bakgrund... 3 4.1 Teori... 3 4.1.1 Dricksvatten... 3 4.1.2 Faktorer som bedöms för att avgöra vattenkvaliten... 4 4.1.3 Koliforma bakterier... 4 4.1.4 Värmetoleranta koliforma bakterier... 5 4.1.5 Escherichia coli... 5 4.1.6 Membranfiltrering som analysmetod... 6 4.1.7 Gränsvärden... 6 4.2 Begränsningar... 6 5 Materiel och material... 7 6 Riskanalys... 8 7 Utförande... 8 8 Resultat... 10 9 Diskussion och slutsats... 11 9.1 Metoddiskussion... 11 9.2 Resultatdiskussion... 13 10 Källkritik... 15 11 Källförteckning... 17 11.1 Textkällor... 17 11.2 Bildkällor... 18 Bilaga 1: Karta över provtagningsplatserna Bilaga 2: Tabell över samtliga erhållna värden Bilaga 3: Sterilteknikens grunder

1 Inledning Att vattnet i mindre skogsbäckar är drickbart, så länge det inte är stillastående eller rinner genom stugområden, var under min barndom lika självklart som att vattnet i älven inte var det. Men stämmer detta, och hur analyserar man vattenkvalitet? 2 Syfte Syftet med undersökningen är att, med hänseende till mikrobiologiska faktorer, genom membranfiltrering undersöka dricksvattenkvaliteten i ett antal vattendrag av olika typ i byn Björbo med ambitionen att dels göra ett uttalande om vattnets tjänlighet som livsmedel och dels att dra vissa generella slutsatser om vilka faktorer som kan tänkas påverka vattenkvaliten. 3 Frågeställning Undersökningarna ämnas besvara två frågeställningar: dels huruvida vattnet i vattendragen är tjänligt som livsmedel, och dels om faktorer såsom vattendragens uppsamlingsområde och längd, utsläpp av avloppsvatten och marktyp påverkar vattenkvaliteten. 4 Bakgrund 4.1 Teori 4.1.1 Dricksvatten Livsmedelsverket definierar med utgångspunkt i svensk lagstiftning dricksvatten som allt vatten som [ ] är avsett för dryck, matlagning, eller beredning av livsmedel oberoende av dess ursprung [ ] och allt vatten som används i ett livsmedelsproducerande företag [...] om inte företaget kan visa kontrollmyndigheten att vattnets kvalitet inte kan påverka de färdiga livsmedlens hälsosamhet. 1 1 SLVFS 2001:30. Livsmedelsverkets föreskrifter om dricksvatten, s 1. 3

4.1.2 Faktorer som bedöms för att avgöra vattenkvaliten För att vatten ska få användas som livsmedel krävs att det är hälsosamt. Kontaminationen, som kan vara antingen kemisk eller mikrobiologisk, får inte överskrida av livsmedelsverket beslutade gränsvärden. Olika gränsvärden gäller beroende på om vattnet som undersöks är utgående dricksvatten, dricksvatten hos användaren eller förpackat dricksvatten. Vattnet kan bedömmas som tjänligt, tjänligt med anmärkning eller otjänligt. 2 Bland de kemiska faktorer som undersöks återfinns bland andra smak och lukt, samt koncentrationen av ämnen likt bly, cyanid, järn, koppar och radon. 3 Vid undersökning av de mikrobiologiska faktorerna läggs stor vikt vid att identifiera s.k. indikatororganismer. Koliforma bakterier, fekala koliforma bakterier, intestinala enterokocker, Clostridium perfringens och Escherichia coli är exempel på sådana. 4 Dessa är ofta inte patogener, men om de återfinns i vattnet tyder det på att en kontaminationskälla finns. Beroende på vilka indikatororganismer som återfinns kan typen av kontanimationskälla närmare bestämmas och en bedömning av vilka patogener som kan kontaminera vattnet från samma källa kan göras. Genom att testa för kontaminationskällor och inte specifika patogener blir processen därför mindre tidskrävande, billigare och inte lika komplex. 5 4.1.3 Koliforma bakterier Gruppen koliforma bakterier innehåller ett flertal stammar vilka alla utmärks av att de är aeroba eller fakultativt anaeroba, stavformade och kan bryta ned sockret laktos till syra och en aldehyd inom en tidsperiod om 24 timmar vid 35 37 C. Många av bakterierna tillhörande gruppen kan växa i såväl jord som vatten, och är därför inte användbara för att identifiera kontaminationskällor av fekal typ. 6 En hög koncentration av totalt antal koliforma bakterier kan 2 Ibid, s 4. 3 Ibid, ss 14-19. 4 WHO. Guidelines for drinking-water quality - 4 th ed., ss 294-300. 5 DOH 331-181. Coliform Bacteria and Drinking Water, s 1. 6 WHO. Guidelines for drinking-water quality - 4 th ed., ss 294-295. 4

dock indikera att vattnet påverkas av ytvatten, eller att en eventuell desinfektionsprocess inte fungerar, vilket i sin tur kan leda till en kontamination av patogen karaktär från samma källa. 7 4.1.4 Värmetoleranta koliforma bakterier De värmetoleranta (thermotolerant) koliforma bakterierna är en grupp underordnad de koliforma bakterierna som utmärks främst av att de likt de koliforma bakterierna kan bryta ner laktos. Processen sker dock endast mellan 44 och 44,5 C, 8 och gruppen kan på så vis särskiljas från de koliforma som utför samma process vid lägre temperaturer. I gruppen ingår huvudsakligen bakterier av fekalt ursprung, främst E. coli, varför gruppen kan godtas som en indikator för fekal kontamination. Värmetoleranta koliforma bakterier som inte är av fekalt ursprung förekommer dock, varför Escherichia coli (E. coli) anses ge ett bättre indikatorvärde. 9 Gruppen är även känd som fekala koliforma bakterier, en term som dock av WHO anses förlegad då den inte ger en fullständig bild av gruppen. 10 4.1.5 Escherichia coli Escherichia coli är en gramnegativ, 11 värmetolerant, koliform bakterie som används för att påvisa fekal kontamination då den utseslutande förekommer som en del av tarmfloran hos människor och andra djur och inte kan växa i vattenledningssystemen. E. coli producerar enzymet betaglukuronidas, vilket kan utnyttjas för att särskilja bakterien från andra värmetoleranta bakterier. 12 7 DOH 331-181. Coliform Bacteria and Drinking Water, s 1. 8 Ekenstierna, Linda. Mikrobiologi för gymnasieskolan, s 168. 9 WHO. Guidelines for drinking-water quality - 4 th ed., s 296. 10 Ballance, R. och Bartram, J. (red.). Water quality monitoring: A practical guide to the design and implementation of freshwater quality studies and monitoring programmes, s 230. 11 Ekenstierna, Linda. Mikrobiologi för gymnasieskolan, s 14. 12 WHO. Guidelines for drinking-water quality - 4 th ed., s 296. 5

4.1.6 Membranfiltrering som analysmetod Två metoder för att bestämma koncentrationen av E. coli och koliforma bakterier är godkända av Livsmedelsverket. 13 Metoderna beskrivs av två standarder, SS-EN ISO 9308-1 och SS 028167, vilka båda bygger på principen med membranfiltrering, 14 15 alltså att bakterier kan skiljas från vätska genom att pumpas igenom ett filter med porer mindre än bakterierna, ett så kallat membran. Membranet tillförs sedan näring i form av substrat och inkuberas, varvid antalet kolonier kan räknas. 16 4.1.7 Gränsvärden Livsmedelsverket föreskriver att ett flertal faktorer ska undersökas för att bedöma vattnets tjänlighet som livsmedel. Bland dessa återfinns gränsvärden för koliforma bakterier och Escherichia coli. Sett endast till dessa två faktorer gäller att vattnet bedöms som otjänligt om 10 eller fler koliforma bakterier påvisas i 100 ml av det från vattenverket utgående vattnet, eller i det fall E. coli kan påvisas i 100 ml av vattnet. 17 För att vattnet ska bedömmas som tjänligt (utan anmärkning) krävs dock att inga koliforma bakterier kan påvisas; påvisas koliforma bakterier (men antalet understiger 10 i 100 ml vatten) bedöms vattnet istället som tjänligt med anmärkning. 18 4.2 Begränsningar Försöken är endast utförda vid ett tillfälle, tar endast hänsyn till ett av kriterierna antalet koliforma bakterier tillämpade vid bestämning av vattenkvaliteten, försöksplatserna är till antalet relativt få och metoden är inte heller godkänd av livsmedelsverket. Samantaget leder detta till att inga generella slutsatser om vattenkvalitet kan dras utifrån resultaten erhållna från den i försöket använda metoden. 13 SLVFS 2001:30. Livsmedelsverkets föreskrifter om dricksvatten, s 31. 14 Swedish Standards Institute. Vattenundersökningar - Kvantifiering av Escherichia coli och koliforma bakterier - Del 1: Membranfiltermetod för vatten med låg bakteriologisk bakgrundsflora (ISO 9308-1:2014). 15 Swedish Standards Institute. Vattenundersökningar - Koliforma bakterier, termotoleranta koliforma bakterier och Escherichia coli i vatten - Bestämning med membranfiltermetod (MF). 16 Ekenstierna, Linda. Mikrobiologi för gymnasieskolan, s 75. 17 SLVFS 2001:30. Livsmedelsverkets föreskrifter om dricksvatten, s 11. 18 Ibid, s 18. 6

5 Materiel och material Nedan listas i fallande ordning efter betydelse det materiel och material som används under utförandet av undersökningen. Milliporapparat (ink. nedre uppsamlingskärl, övre del, filterhållare och luftutsug i form av slang och spruta) Milliporfilter (mönstrat; indelat i 144 kvadrater) 10 petriskålar med tillhörande substratkudde Substrat (för koliforma bakterier) Värmeskåp 10 sterila mätglas med aluminiumfoliehatt 10 glasflaskor med kork Stereolupp (x2 och x4 förstoring) Handdesinfektion Ytdesinfektion Bägare med t-röd 2 pincetter Kokplatta Vatten för kokning Spis Kylskåp Gryta (5 liter) Gryta (10 liter) Kamera Avfallsbägare Degeltång Grytlapp Gaffel Märkpenna Maskeringstejp 7

Hushållspapper Metallbricka Potatisstamp 6 Riskanalys På de inkuberade odlingsplattorna kommer olika typer av, potentiellt patogena, koliforma bakterier finnas i hög koncentration, varför det är viktigt att alla arbetsytor och verktyg desinficeras efter användning; det samma gäller för händerna. Det är även viktigt att samtliga inkuberade odlingsplattor destrueras, lämpligen genom autoklavering, efter laborationen för att minimera risken för smittspridning. Vattenproverna som inte inkuberats är emellertid relativt ofarliga då bakteriekoncentrationerna är låga; vattnet kan kasseras utan risk för vidare smittspridning. Under laborationen används såväl bägare med etanol som desinfektionsmedel och spritbrännare, varför det är viktigt att de två hålls väl åtskilda för att undvika brandrisken. Vid arbete med varmt vatten förligger en viss risk för brännskador, varför en viss försiktighet bör vidtas. 7 Utförande Provtagningsställena bestämdes genom studier av Lantmäteriets topografiska karta (se bilaga 1). Totalt valdes nio provtagningsställen samt en referens i form av kranvatten från det kommunala vattenledningsnätet. Glasflaskorna med tillhörande kokar steriliserades innan provtagningstillfället genom att kokas helt nedsänkta i vatten under approximativt tre minuter i grytan rymmande 10 liter. Flaskorna togs upp hur vattnet m.h.a. potatisstampen och grytlappen, och korkarna m.h.a. gaffeln, varvid flaskorna förslöts med korken. Såväl gaffeln som potatisstampen steriliserades genom att hållas nedsänkta i vattnet innan flaskorna togs upp för att undvika att kontaminera flaskorna. Med hjälp 8

av märkpennan och maskeringstejpen märktes sedan falskorna så att provtagningsstället framgick. Proverna togs alla, förutom prov 7 som var det första som togs, med flaskans mynnings riktad nedströms. Samtliga prover togs med flaskans mynning nedsänkt under vattenytan för att inte endast få med ytvatten. Flaskorna återförslöts efter provtagningstillfället och placerades i kylskåp efter mellan två timmar och ett fåtal minuter efter att först ha förvarats i en förhållandevis sval bilkupé under provtagningsturen. Referensprovet (nr. 10, kommunalt dricksvatten) togs från kranen i det egna hemmet och var kallvatten. För att analysera vattenkvaliteten i vattenproven tillämpades membranfiltrering (se nedan), något som av schematekniska skäl genomfördes vid två olika tillfällen. Samtliga prover förutom prov nr. 3, 4 och 10 filtrerades 2 dygn efter att proverna tagits; resterande prov filtrerades 3 dygn efter provtagningstillfället. Vattenproverna förvarades under den mellanliggande tiden i kylskåp. Membranfiltreringen genomfördes på samma sätt för samtliga prov och utfördes under tillämpande av sterilteknik (se bilaga 3), och inleddes med att milliporapparatens övre del och filerhållaren steriliserades genom att kokas i vatten. Filterhållaren togs sedan från vattenbadet med en degeltång som först steriliserats genom att hållas nedsänkt i det kokande vattnet och tillfogades milliporapparatens nedre del. Ett sterilt milliporfiler placerades sedan på filterhållaren med en avbränd pincett varvid även överdelen påskruvades. 100 cm 3 av det från vattendragen tidigare erhållna vattnet mättes sedan upp m.h.a. ett sterilt 100 cm 3 -mätglas och hälldes i apparatens övre del varvid det m.h.a. sprutan sögs genom filtret som sedan med hjälp av en avbränd pincett placerades i en petrisskål efter att den till petrisskålen tillhörande substratskudden först tillförts substratet. Petrisskålen märktes sedan. Proceduren upprepades sedan för resterande prover, varvid petrisskålarna inkuberades vid 37 C under 24 timmar respektive 23 timmar (prov nr. 3, 4 och 10) i värmeskåp. 9

Antalet colony-forming units (cfu) av koliforma bakterier räknades sedan i stereolupp. I de fall där antalet cfu uppenbart var större än ungefär 500 valdes för varje platta 5 godtyckliga rutor för vilka medelvärdet av antalet cfu multiplicerades med det totala antalet rutor (144). För att kontrollera stickprovsmetodens noggrannhet räknades samtliga cfu på en platta, varvid stickprovsmetoden tillämpades på samma platta. För att ytterligare undersöka metodens exakthet tillämpades på en platta metoden fem gånger, varvid fem olika medelvärden erhölls. Antalet colony-forming units av E. coli räknades också, dock utan sterolupp då den för E. coli med substratet karakteristiska metalglansen då tydligare framträdde. För att kontrollera skillnaden i det observerade antalet E. coli vid räknande i stereolupp kontra utan sterolupp tillämpades båda metoderna på platta 7. 8 Resultat Samtliga undersökta prover förutom referensen från det kommunala vattenledningsnätet uppvisar bakteriehalter långt över de tillåtna gränsvärdena; från 300 gånger fler koliforma bakterier i 100 ml vatten än det tillåtna värdet för dricksvatten i prov nr. 1 (Byn, övre) till endast 30 gånger högre än de tillåtna värdena i prov nr. 4 (Drickbäcken). I samtliga prover förutom referensen och prov nr. 8 (Flintgruvv.) har dessutom E. coli påvisats, varför vattnet i dessa fall också därav måste anses som otjänligt som livsmedel i enlighet med Livsmedelsverkets gränsvärden. Prov nr. Provplatsens namn Totalt antal koliforma (cfu) 1 Byn, övre 3000 ±1200 10 2 Byn, nedre 2000 ±850 10 E. coli (cfu) 3 Älven, nedre 700 ±270 >100 4 Drickbäcken 300 ±120 2 5 Björnbäcken 730 30 6 Petm. avr.b. nedre 600 ±250 40 7 Petm. avr.b. övre 600 20 8 Flintgruvv. 600 ±230 0 9 Älven, övre 460 >100 10 Kranvatten 0 0 Tabell 1: Antal colony-forming units med koliforma bakterier och Escherichia coli (som också ingår i värdena för Totalt antal koliforma ) i 100 ml vatten från de olika provtagningsplatserna. För de värden som erhållits genom stickprovsmetoden anges ett konfidensintervall inom vilket 95 % av värdena erhållna från metoden förväntas återfinnas. Värden för vilka inget konfidensintervall anges har räknats och avrundats till en värdesiffra. 10

Den kontroll av stickprovsmetodens tillförlitlighet som genomfördes på prov nr. 3 (Älven, nedre) med multipla medelvärden visar att metoden i det fallet gav värden med en standardavvikelse motsvarande 20 procent av medelvärdenas medelvärde (samtliga erhållna värden återfinns i bilaga 2). Ett konfidensintervall innefattande 95 % av de möjliga variationerna om ±40% av värdet (två standardavvikelser) ges därför (se tabell 1). Figur 1: Provtagningsställe nr. 1 (Byn, övre). Även antalet E. coli bakterier är i de undersökta proven klart högre än de i dricksvatten tillåtna; proverna tagna i älven (prov nr. 3 och 9) uppvisar de klart största antalen med över 100 cfu per prov, men även proverna från Petmyrans avrinningsbäck (prov nr. 6 och 7) innehåller ett stort antal E. coli-bakterier: 20 vid det övre provtagningsstället (prov nr. 7) och 40 vid det nedre (prov nr. 6). När antalet E. coli-cfu räknas i stereolupp uppgår dock antalet vid det övre provstagningsstället till 58 (se bilaga 2); en avsevärd skillnad gentemot de 17 (i tabell 1 avrundat till 20) som ses utan stereolupp. 9 Diskussion och slutsats 9.1.1 Metoddiskussion En svaghet i metoden, som i stor grad inverkar på det i denna rapport redovisade resultatet, är sättet på vilket bakteriekolonierna räknas. Att räkna varje koloni är förstås att föredra då det eliminerar osäkerheter till följd av små urval, men förutsätter att antalet kolonier är förhållandevis litet. När antalet överstiger två, eller tre, tusen som i fallet med prov 2 och 1 är det dock inte möjligt att göra så inom rimlig tid. Om ambitionen endast är att avgöra om vattnet är tjänligt, med anmärkning tjänligt eller otjänligt är detta förstås inget problem eftersom det är uppenbart att bakteriekoncentrationen vida överskrider gränsen om 10 koliforma bakterier i 100 ml vatten för att vara tjänligt som livsmedel. Är syftet däremot att, som i detta fall, göra jämförelser mellan olika vattendrag eller olika provtagningsplatser i samma vattendrag och det därför är nödvändigt att med stor noggrannhet bestämma bakteriekoncentrationen krävs att metoden förändras. En möjlig sådan förändring är att späda de prover som misstänks innehålla höga bakteriekoncentrationer så att antalet cfu lättare kan räknas, varvid antalet sedan kan multipliceras med spädningsgraden för att få den ursprungliga koncentrationen. Problemet med oprecisa medelvärden undanröjs därmed, även om en viss osäkerhet föreligger också i denna 11

metod; inte minst då varje koloni, och därmed också ett eventuellt bortfall av densamma, har en större inverkan på resultatet (kolonin är representativ för ett flertal andra i den ursprungliga koncentrationen samtidigt som antalet kolonier är lägre). En annan möjlighet är att modifiera stickprovsmetoden så att konfidensintervallet kan minskas. I försöket räknades antalet cfu endast i fem godtyckliga rutor utifrån vilka medelvärdet för antalet bakteriekolonier per ruta beräknades och därmed också antalet bakteriekolonier på hela provplattan. Som tydligt i försöket varierar dock den uppgift som på detta sätt fås om den totala populationens storlek avsevärt till följd av att de valda rutorna inte verkar vara representativa för resterande rutor. Detta beror troligen på en kombination av två faktorer: antalet valda rutor är allt för litet och slumpvisa variationer får därför stort genomslag, och vissa rutor väljs, medvetet eller omedvetet, framför andra i tron att de är mer representativa för populationen i stort än vad som är fallet. Att dels öka antalet rutor, och dels göra urvalet mindre godtyckligt och mer slumpartat, torde därför vara önskevärt. I detta fall är antalet rutor 144: 12 på höjden och lika många på bredden i mitten av det cirkulära filtret. Vilka rutor som ska räknas skulle därför lätt kunna slumpas fram genom kast med två tärningar. Första kastet ger raden (2-12) och andra kolumnen (2-12). På så vis görs urvalet mer slumpartat, och resultatet blir med det förhoppningsvis säkrare. En viss risk finns dock för att allt för höga värden erhålls då kolumn 1, som ligger i utkanten av filtret där antalet cfu generellt varit lägre, aldrig kan erhållas genom metoden. Antalet rutor i kolumnen är dock mycket litet och inverkan torde därav vara liten. Om problemet önskas kommas runt kan dock någon annan typ av slumpgenerator användas istället för tärningarna. Även de redovisade koncentrationerna av E. coli är mycket osäkra då E. coli-cfu varit svåra att särskilja från de övriga. Det använda substratet ska förvisso ge de förstnämnda en viss metallglans som ska saknas hos de senare, något som också låter kolonierna särskiljas när de räknas utan stereolupp. När de räknas i stereolupp är dock skillnaderna, åtminstone för ett otränat öga, långt ifrån uppenbara och risken för felklassifikation är överhängande. Antalet E. coli-cfu har därför räknats utan stereolupp, med risken att mindre kolonier missats. Om ett substrat på vilket skillnaderna mellan de olika släktenas respektive cfu också i stereolupp tydligare framträdde borde ett sådant alltså ha använts. Att de mindre kolonierna riskerar att missas är dock inget problem, så länge större kolonier framträder tydligt, om ambitionen endast är att avgöra vattnets tjänlighet som dricksvatten då närvaron av E. coli (oavsett mängd) omedelbart gör 12

vattnet otjänligt. Framträder däremot inga E. coli-cfu tydligt finns förstås en risk att vattnet klassas som tjänligt, trots närvaron av mindre kolonier. Det är alltså, också av denna anledning, angeläget att det använda substratet i högre grad möjliggör särskiljning av de två släktena. Resultatet skadas också av att de tillämpade metodernas tillförlitlighet inte närmare testats. Det är till detta som de sent upptäckta problemen med stickprovsmetoden kan tillskrivas, men inte heller membranfiltreringsmetodens tillförlitlighet har undersökts. Fås olika värden för bakterekoncentrationen i ett och samma prov, och om så är fallet, hur stor är skillnaden? Om detta hade undersökts skulle ett konfidensintervall kunnat ges också för de räknade värdena, och det redan angiva intervallet hade kunnat förbättras för att inkludera också denna eventuella osäkerhet. Stickprovsmetoden, och de förbättringar som föreslås till den, borde också innan de tillämpas testas för att redan innan experimenten utförs känna till hur stora osäkerheter metoden medför, och om dessa kan accepteras, eller om en ny metod för vilken osäkerheten är mindre måste utvecklas. Ett test för stickprovsmetodens tillförlitlighet skulle kunna göras genom att upprepade gånger beräkna antalet prickar, som är känt, i en cirkel bestående av 144 rutor fördelat på 12*12 rader (i likhet med de i försöket använda membranen). Beroende på de resultat som då erhålls kan konfidensintervallet för metoden beräknas och värderas. Den tillämpade metoden är inte heller förenlig med någon av de två standarder som Livsmedelsverket föreskriver skall användas vid vattenanalys. Även om de två metoderna i likhet med den tillämpade bygger på membranfiltrering, måste de av verket föreskrivna metoderna användas om vattenkvaliteten skall bedömmas. Denna metod kan alltså inte användas för att säkerställa att vattenkvaliteten lever upp till de av verket föreskrivna kraven. 9.2 Resultatdiskussion Vattnet i samtliga undersökta vattendrag är otjänligt som dricksvatten, enligt Livsmedelsverkets gränsvärden. De nämna gränsvärdena är dock anpassade till vatten från brunnar eller vatten renat i vattenverk alltså vatten som skall hållas väl åtskilt från jord och ytvatten. Om koliforma bakterier ändå återfinns i ett sådant system tyder det på kontamination från marken där många koliforma bakterier kan växa. Det är därför naturligt att bäckvattnet, som är i kontakt med jord, innehåller relativt höga halter koliforma bakterier. Dessa är dock oftast inte patogener, och vattnet torde därför kunna drickas utan större risk även om en viss mängd koliforma bakterier 13

finns i det. Men eftersom vattnet inte är rent finns en risk att vattnet kontaminerats av patogerner, vilket också är anledningen till Livsmedelsverkets gränsvärden. Att dricka vattnet är alltså inte riskfritt, men risken för att smittspridning är lägre än om vatten med höga halter koliforma bakterier eller E. coli intas. Vattnet i Drickbäcken (prov nr 4, 300 koliforma, 2 E. coli) och Flintgruvv. (prov nr. 8, 600 ±230 koliforma, 0 E. coli) torde därför vid provtagningstillfället ha varit relativt drickbart till följd av de låga E. coli- och koliforma-bakteriekoncentrationerna (även om koncentrationen koliforma bakterier i är osäker vid Flintgruvv.). Vidare kan också konstateras att koncentrationen E. coli är som högst i de prover tagna i älven (prov 3 och 9), vilket också är det enda vattendraget till vilket det är känt att avloppsvatten släpps ut. De totala halterna koliforma bakterier sticker dock inte ut ifrån övriga undersökta vattendrag, vilket torde tyda på att utsläppet av avloppsvatten främst påverkar halten av E. coli. Då bakterien utseslutande förekommer i fekalier förefaller detta rimligt. Även i proverna från Petmyrans avringningsbäck återfinns ett förhållandevis stort antal E. coli bakterier, något som antingen kan förklaras med otillåtna utsläpp av avloppsvatten i området eller en stor mängd naturligt förekommande fekalier i uppsamlingsområdet. Den första förklaringen förefaller dock inte trolig då inga stugor finns i området från vilka utsläppen skulle kunna originera. E. coli förekommer dessutom i samtliga kontrollerade bäckar förutom Flintgruvv., om än i lägre koncentrationer, vilket talar för den senare förklaringen då otillåtna avlopp rimligen inte mynnar i samtliga bäckar. De högsta halterna koliforma bakterier (3000 per 100 ml) återfinns i prov nummer 1 (Byn, övre). Detta kan troligen tillskrivas den låga strömningshastigheten (vattnet föreföll vid provtagningstillfället i det närmaste stillastående) i kombination med marktypen; provtagningsplatsen ligger i yngre björkskog (se Figur 1). Halten koliforma bakterier har sedan vid det prov som tas nedströms (prov 2) sjunkit till 2000 per 100 ml, vilket dock också det är en mycket hög koncentration. Den minskade koncentrationen beror troligtvis på att en annan bäck med förmodad lägre bakteriekoncentration, ansluter varvid vattnet späds. Om stillastående vatten i lövskog generellt ger upphov till högre koncentration koliforma bakterier än bäckar i barrskog med hög strömningshastighet kan inte utifrån försöket bevisas då antalet bäckar i lövskog såväl som antalet bäckar med låg strömningshastighet är allt för få i försöket, men att så skulle vara fallet förefaller troligt dels då bakteriehalterna i jorden torde vara högre i lövskog till följd av det högre ph:t och dels då den lägre strömningshastigheten ger längre tid för bakterietillväxt. 14

Uppsamlingsområdets storlek verkar vara en faktor med förvånansvärt liten inverkan på bakteriekoncentrationen. Halten koliforma bakterier är exempelvis högre i Flintgruvv.-provet än i provet från Drickbäcken, trots att den senare är dubbelt så långt ifrån sin källa som den första och trots att marktypen och strömningshastigheten är likartad. Halterna i Flintgruvv.-provet är dessutom i nivå med de från Petmyrans avrinningsbäck en bäck vars upptagningsområde utgörs av ett stort myrområde. Konfidensintervallet för Flintgruvv.-provet är dock stort, och de i intervallet lägre värdena är närmare de för Drickbäcken och de förväntade, varför det kan misstänkas att den beräknade koncentrationen (600 koliforma bakterier i 100 ml vatten) är högre än den egentliga. Inte heller mellan de olika proverna i Petmyrans avrinningsbäck ses någon större skillnad i bakteriekoncentration. Möjligen är sträckan mellan de båda proverna för kort, eller så tillförs ungefär lika mycket vatten som bakterier under sträckan, varför koncentrationen förblir oförändrad. Mellan prov 8 och 5 (Flintgruvv. resp. Björnbäcken) som är tagna i samma bäck, dock efter att ytterligare en bäck anslutit, ses, även om konfidensintervallet också i detta fall är stort, däremot en viss skillnad: bakteriekoncentrationen ökar från 600 ±230 till 730 koliforma bakterier i 100 ml vatten i det senare provet. Inte heller här verkar dock bakteriekoncentrationen öka proportionellt mot ökningen i uppsamlingsområde och sträckning, och det kan inte heller uteslutas att ökningen stammar från en eventuellt högre bakteriekoncentration i den anslutande bäcken. Det är med andra ord utifrån försöket osäkert om uppsamlingsområdets storlek överhuvudtaget inverkar på resultatet. 10 Källkritik Ballance, R. och Bartram, J. (red.): Skriften är publicerad på uppdrag av FN:s klimatprogram och Världshälsoorganisationen (WHO) och finns publicerad som PDF på den senare organisationens webbplats. Källan används för att styrka att ett begrepp anses föråldrat av WHO, och bedöms tillräcklig för att styrka att så är fallet. Dock kan frågan väckas huruvida detta är författarnas åsikt, eller WHO:s. Att begreppet överhuvudtaget inte används i den nyare rapporten publicerad av organisationen (WHO. Guidelines for drinking-water quality - 4 th ed.. Geneva: World Health Organization, 2011.) tyder dock på att begreppet inte används av denna, vilket ligger i linje med det i Ballances och Bartrams skrift framförda. 15

DOH 331-181: Publikationen är en mindre informationsbroschyr från en myndighet i USA som används för att motivera behovet av indikatororganismer, till vilket källan också anses tillräcklig. Tidsperspektivet är mindre relevant då den övergripande nyttan inte torde ha förändrats nämnvärt under de senare åren, och i egenskap av myndighet (med ansvar för vatten) anses författaren trovärdig. Ekenstierna, Linda: Boken används som läromedel i kursen bioteknik, och används för att ge grundläggande uppgifter om metoder och bakterier. Dessa uppgifter bedöms inte vara kontroversiella, och några problem relaterade till tendens torde därför inte finnas. Områdena är inte heller sådana att de redovisade uppgifterna riskerar att ha blivit inaktuella sedan boken publicerats. SLVFS 2001:30: Föreskriften från det svenska Livsmedelsverket används vid flera ställen som källa i denna rapport för att styrka verkets gränsvärden och definitioner. Källan bedöms för det syftet som mycket trovärdig; tendenser beroende torde vara obefintligt då verket självt återger sina egna gränsvärden och definitioner. De återgivna uppgifterna är inte heller av reklamkaraktär, varför ingen anledning finns att förstärka dessa i endera riktningen. Inte heller tiden är ett problem, numreringen till trots. Som framgår i källförteckningen används en av Livsmedelsverket tillhandahållen konsoliderad version innehållande de ändringar som gjorts till föreskriften. Swedish Standards Institute: Källan används för att ange namnet på två standarder utarbetade av Swedish Standards Institute. Likt i fallet med SLVFS 2001:30 finns inte heller i detta fall någon anledning att tro att uppgifterna skulle vara tendensiella eller av annan anledning felaktiga organisationen får förutsättas redovisa en korrekt titel på den egna standarden. WHO: Världshälsoorganisationens officiella riktlinjer för dricksvattenkvalitet och de där i givna uppgifterna om indikatororganismerna bedöms som trovärdiga. Risken för tendens bedöms som liten då ämnet är okontroversiellt. Källan ligger väl tidsmässigt. Ett beroende mot tidigare rapporter och forskning torde oundvikligen finnas, men bedöms som positivt med tanke på texttypen. 16

11 Källförteckning 11.1 Textkällor Ballance, R. och Bartram, J. (red.). Water quality monitoring: A practical guide to the design and implementation of freshwater quality studies and monitoring programmes. London: E&FN Spon, 1996. DOH 331-181. Coliform Bacteria and Drinking Water. Olympia: Washington State Department of Health - Office of Drinking Water, 2011. Ekenstierna, Linda. Mikrobiologi för gymnasieskolan. Lund: Studentlitteratur, 1999. SLVFS 2001:30. Livsmedelsverkets föreskrifter om dricksvatten (konsoliderad version innehållande ändringarna LIVSFS 2005:10, LIVSFS 2007:13, LIVSFS 2011:3 (Omtryck) och LIVSFS 2013:4). http://www.livsmedelsverket.se/globalassets/om-oss/lagstiftning/dricksvatten--- naturl-mineralv---kallv/slvfs-2001-30-kons.pdf (Hämtad 2014-10-17). Swedish Standards Institute. Vattenundersökningar - Koliforma bakterier, termotoleranta koliforma bakterier och Escherichia coli i vatten - Bestämning med membranfiltermetod (MF). http://www.sis.se/milj%c3%b6-ochh%c3%a4lsoskydds%c3%a4kerhet/vattenkvalitet/dricksvatten/ss-28167 (Hämtad 2015-02-05). Swedish Standards Institute. Vattenundersökningar - Kvantifiering av Escherichia coli och koliforma bakterier - Del 1: Membranfiltermetod för vatten med låg bakteriologisk bakgrundsflora (ISO 9308-1:2014). http://www.sis.se/matematik-naturvetenskap/mikrobiologi/vattnets-mikrobiologi/ss-en-iso-9308-12014 (Hämtad 2015-02-05). WHO. Guidelines for drinking-water quality - 4 th ed.. Geneva: World Health Organization, 2011. 17

11.2 Bildkällor Lantmäteriet. Topografisk karta. http://kso2.lantmateriet.se/. Välj Topografisk i rullgardinsmenyn (Hämtad 2015-02-06). 18

Bilaga 1 Karta 19 över provtagningspunkterna identifierade med provnummer och beskrivande namn. Notera den lila linjen vid prov 1 som indikerar bäckens ungefärliga fortsatta sträckning i enlighet med kartans nästa förstoringsnivå. 19 Bildkälla: Lantmäteriet. Topografisk karta.

Bilaga 2 Tabell med samtliga uppmätta, icke avrundade, värden. Med räknade värden avses antalet cfu i det urval av rutor som vid tillämpande av stickprovsmetoden gjorts för att uppskatta det totala antalet koliforma bakterier. Prov nr. Provplatsens namn Metod Totalt antal koliforma (cfu) Räknade värden E. coli (cfu) 1 Byn, övre Stickprov 3024 26, 21, 22, 20, 16 11 2 Byn, nedre Stickprov 2131,2 14, 15, 17, 16, 12 10 3 Älven, nedre Multipla stickprov Serie 1: 806,4 Serie 2: 547,2 Serie 3: 489,6 Serie 4: 806,4 Serie 5: 691,2 Med.v.: 668,16 Serie 1: 5, 6, 4, 6, 7 Serie 2: 4, 3, 3, 1, 8 Serie 3: 4, 4, 2, 3, 4 Serie 4: 6, 4, 6, 8, 4 Serie 5: 4, 3, 5, 5, 7 >100 (svårt att urskilja vilka som är E. coli) 4 Drickbäcken Stickprov 288 5, 1, 1, 2, 1 2 5 Björnbäcken Stick. & räknade Räknade: 736 Med.: 806 7, 4, 3, 6, 8 27 6 Petm. avr.b. nedre Stickprov 633,6 6, 5, 4, 3, 4 43 7 Petm. avr.b. övre Räknade 604 17 (58 i stereolupp) 8 Flintgruvv. Stickprov 576 7, 3, 3, 3, 4 0 9 Älven, övre Räknade 455 112 10 Kranvatten Räknade 0 0

Bilaga 3 Överblick av sterilteknikens grundläggande principer 20 : Alla arbetsytor desinficeras före och efter användning för att undvika kontamination (förorening av främmande organismer) och att de undersökta bakterierna sprids. Allt materiel och material som används skall vara sterilt (annars kontamineras kulturen). Allt material som kommit i kontakt (kontaminerats) med de undersökta organismerna skall destrueras genom autoklavering (vilket dödar organismerna). Det samma gäller kulturerna när dessa studerats färdigt. För att undvika smittspridning skall försiktighet och en god handhygien vidtas vid allt arbete, speciellt vid arbete med potentiella patogener. 20 Ekenstierna, Linda. Mikrobiologi för gymnasieskolan, ss 155-158.