Att stimulera djupinlärning med laborativ undervisning

Att stimulera djupinlärning med laborativ undervisning Fredrik Bergh Thorén, Sahlgrenska Cancercentrum, Göteborgs universitet Pedagogiskt projektarbete för docentur vid Sahlgrenska akademin Handledare: Charlotta Movitz Bakgrund och problemställning Traditionell undervisning vid medicinsk fakultet framställs ofta som ett pedagogiskt skräckexempel. I sin iver att effektivt förmedla omfattande information till ett stort antal studenter använder lärarna närmast uteslutande katedrala föreläsningar. I denna undervisningsform går kommunikationen i princip en väg, och kunskapen är tänkt att överföras från föreläsare till studenter. Till den medicinska utbildningens försvar kan dock anföras att det medicinska ämnet som sådant är svårt att angripa utan tämligen omfattande baskunskaper. Det är exempelvis svårt att reflektera kring immunsystemets strategier för att bekämpa en virusinfektion om man inte har basala kunskaper om vad som skiljer bakterier och virus och om hur immunsystemet är uppbyggt och fungerar. Min upplevelse av medicinsk utbildning är att ett annat problem är ämnesområdets enorma bredd. Inom en enskild kurs når man ofta inte längre än till överföringen av stora informationsmängder innan kursen är slut och nästa område skall angripas. På det sättet är risken överhängande att utbildningarna blir en serie av kurser på grundnivå där studenternas kunskaper förblir oreflekterad faktakunskap, dvs endast når en förhållandevis låg taxonomisk nivå. Laborationer är ofta den naturvetenskapliga och prekliniska medicinska utbildningens försök att komplettera de katedrala föreläsningarna med erfarenhetslärande (episodiskt minne). En lång rad olika mål har knutits till laborativ undervisning, såsom ökad förståelse för kopplingen mellan teori och metod; ökad förståelse för vetenskapligt arbete; förbättrade tekniska färdigheter och ökad förtrogenhet med apparatur; förbättrad

förmåga till problemlösning; ökad förmåga att tolka och presentera resultat; bidra till utvecklandet av en vetenskaplig attityd; ökad förmåga att arbeta i grupp mm 1,2. Ramsden listar dock ett flertal studier som visar att laboratorie-baserad undervisning ofta är dyr, tidskrävande och dålig och inte alls når dessa mål 3. I många fall inbegriper laborationer rutinmässiga mekaniska uppgifter exempelvis visade en studie i England att under första årets kemiutbildning utförde den genomsnittlige studenten 50 stycken byrett-titreringar en metod där man långsamt låter lösning A droppa ner i lösning B och noterar vilken volym av A som behövs för att något specifikt skall ske. Sammantaget lär alla dessa rutinmässiga uppgifter ta en ansenlig mängd dyrbar tid i anspråk som borde kunna användas mer effektivt för att främja inlärning 4. Ett vanligt fel vid laborationer är också att laborationshandledningen lätt blir en så detaljerad manual att den påminner om ett matrecept. Proceduren kan då ofta följas steg för steg utan att studenterna egentligen förstår vad de gör, vad som sker och varför. Ett annat bekymmer är att studenterna framförallt försöker att få fram rätt resultat så fort som möjligt. 5 För några år sedan blev jag med kort varsel ombedd att skapa en ny laboration inom ramen för en 7,5p-kurs om immunsystemet och infektioner vid apotekarutbildningen. Syftet med laborationen var att introducera studenter för moderna laborativa tekniker och illustrera immunologiska processer. En laboration utformades hastigt med ett traditionellt upplägg, men vi i lärarlaget konstaterade efteråt att det här var en möjlighet att skapa en ny laboration som i högre utsträckning stimulerade djupinlärning. Således inleddes ett omfattande arbete med att förändra laborationen!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 1 Ramsden, P. Learning to teach in higher education. (2003), p 155. 2 Baillie C. and Hazel E. Teaching materials laboratory classes. (2006) Higher Education Academy UK, Centre for Materials Education. http://www.materials.ac.uk/guides/labclasses.asp 3 Ramsden, P. Learning to teach in higher education. (2003), p 155. 4 Bennet S.W., Seery, M.K., Sövegjarto-Wigbers, D. Practical work in higher level chemistry education, Innovative methods of teaching and learning chemistry in higher education. (2009), p 87. 5 Ibid.

Syfte: Att genom studentenkäter, reflektion/diskussion inom lärarlaget samt litteraturstudier identifiera strategier för att förbättra en befintlig laboration så att den blir ett effektivt lärmoment som stimulerar djupinlärning. Frågor som vi har ställt oss under detta arbete har inkluderat: Hur skall man utforma den här laborationen så att den blir ett effektivt lärmoment som stimulerar djupinlärning inom ramen för denna kurs? Hur undviker man kokboksfällan? Resultat Laborationen första året När laborationen gavs första gången erhöll studenterna en laborationshandledning med ett tämligen utförligt laborationsprotokoll (bilaga 1). Studenterna fick separera fram immunceller från blodgivarblod, tvätta dem, räkna dem och sätta dem i kultur med tumörceller. Fyra timmar efter laborationstillfället analyserade laborationshandledarna resultaten med flödescytometri. Vid laborationstillfälle 2 fick studenterna tillbaka gruppernas resultat, en demonstration av den använda tekniken urfördes och laborationsresultaten diskuterades. Efter laborationen delades en enkät ut och studenter tillfrågades om vad de tyckte om laborationen och vad som skulle kunna förbättras till nästa gång. Studenternas synpunkter Samtliga studenter fick en enkät i slutet av laborationen som de förväntades fylla i innan de lämnade lokalen. Enkäten omfattade 5 stycken frågor; tre frågor som berörde specifika avsnitt i laborationen, och 2 stycken av generell karaktär som diskuteras här ( Vad tyckte du om NK-cellslaborationen? och Vad skulle kunna förbättras? ). Denna första av dessa två frågor kunde besvaras med Mycket bra, bra, dålig, mycket dålig. Laborationen fick generellt ett ganska bra mottagande. Studenternas omdömen fördelade sig enligt nedan:

Mycket bra: 26 Bra: 50 Ok: 2 (även om detta svarsalternativ inte fanns med i enkäten) Dålig: 1 Mycket dålig: 0 Förbättringsförslagen i fråga två rörde framförallt det faktum att föreläsningar om det aktuella ämnet inte föregick laborationen utan hade schemalagts efter laborationen, samt att studenterna ville utföra alla moment inom laborationen på egen hand. Reflektioner/diskussioner inom lärarlaget Efter laborationen diskuterade vi i lärarlaget hur laborationen hade gått, vilka moment som var mer eller mindre lyckade, och hur laborationen kunde förbättras till nästa gång. Vi var tämligen överens om att demonstrationen av flödescytometri inte hade blivit speciellt lyckad. Den tycktes snarare förbrylla studenterna än få dem att inse hur tekniken fungerade. Vidare tyckte vi att cellseparationen från blod förbrukade mycket tid, kostade mycket i material, och gav mycket varierande resultat, vilket påverkade många laborationsgruppers fortsatta arbete. Sammantaget var vi överens om att laborationen hade potential, men behövde omarbetas rejält för att bli det effektiva lärmoment som vi eftersträvade. Förändringar inför andra året Inför det andra kurstillfället gjorde vi stora förändringar. Istället för att låta studenterna utföra den mekaniska cellseparationen, erhöll studenterna expanderade NK-celler som odlats fram under tre veckor. Varje grupp erhöll färgade tumörceller, ett rör med den terapeutiska antikroppen Mabthera som används kliniskt vid kronisk lymfatisk leukemi, och ett rör med Fc-block som blockerar Mabtheras immunstimulerande effekt. Laborationsuppgiften var kort beskriven: Utforma ett experiment som gör det möjligt

att utvärdera NK-cellers cytotoxicitet samt Mabtheras funktion med avseende på CDC, ADCC samt direkt cytotoxisk effekt. Efter 4 h färgade och fixerade laborationshandledarna studenternas prover för att möjliggöra analys vid laborationstillfälle 2. Vid detta tillfälle fick studenterna själva köra sina prover i två flödescytometrar som placerades i laborationssalen. Diskussion kring förändringsarbetet Det kan finnas flera olika syften med laborativ undervisning: Den kan åskådliggöra teori från föreläsningar i praktiken, introducera studenterna till moderna tekniker, ibland t.o.m. sk hands-on -erfarenhet, få studenterna att djupare reflektera kring studieämnet, och visa studenterna hur man arbetar med experimentell forskning mm 6,7. Det stod fullständigt klart att vår första upplaga av laborationen uppfyllde vissa av dessa syften men kapitalt misslyckades med andra. Vi hade gått i fällan och producerat en urförlig laborationsmanual som med stadig hand förde studenterna från punkt A till punkt B utan att studenterna egentligen behövde begripa någonting. Uttryckt i SOLOtaxonomiska termer så krävde laborationen endast kunskap på den lägsta unistrukturella nivån (fig 1, samt not 8). Paradoxalt nog var studenterna ganska nöjda ändå, dels för att de är vana vid den här typen av serverad information, dels kanske för att en andel av dem är såpass begåvade att de ändå begrep vad det handlade om. Den senare gruppen av studenter är djupinlärande och kunde kanske, undervisningsmetoden till trots, analysera och integrera laborationserfarenheterna med sin sedan tidigare inhämtade kunskapsmassa. Pettersen refererar i sin bok till Biggs två olika studenttyper, den djupinlärande Susan och den ytinlärande Robert 9. Våra Susan -studenter lyckades möjligen se bortom kokboksreceptet och förstod hur man med denna typ av försöksuppställningar skulle kunna besvara andra intressanta frågor, dvs deras kunskapsnivå har nått de två högsta nivåerna i SOLO-taxonomin, den relationella nivån!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 6 Fler exempel i Ramsden, P. Learning to teach in higher education (2003) s154 f 7 Seery, M. Teaching in the laboratory: 1 Pedagogy (2010), http://michaelseery.com/home/index.php/2010/09/teaching-in-the-laboratory-1-pedagogy/ "!Pettersen, RC. Kvalitetslärande i högre utbildning (2005) s290ff! 9 A.a. s39!

och den utvidgat abstrakta nivån (fig 1, not 7). De ytinlärande Robert -studenterna å andra sidan var eventuellt nöjda med att genomföra en laboration om immunsystemet och cancer genom att enkelt glida med och följa de erhållna instruktionerna.!"#$%&'(&&#$!%$&!'()*'+,*)-./$0)+!-!123245+67)7&-)8!90/)!:$55$0*7);!<=8 Kvalitetslärande i högre utbildning (2005) s290. Vår avsikt var dock att laborationen skulle stimulera till en ökad förståelse för ämnet, att få studenterna att få ökad kunskap om hur man utforskar ett ämne, hur man utformar ett experiment för att besvara en frågeställning mm. Den detaljerade och styrande laborationshandledningen förhindrade dock detta. Domin beskriver olika sorters ansatser i laborativ undervisning; expository, inquiry, discovery, problembased. Dessa skiljer sig med avseende på mål, ansats och procedur. Den traditionella naturvetenskapliga laborationen av kokbokstyp är den förklarande varianten (expository). Den har en start, ett bestämt mål, en deduktiv ansats och en detaljerad given beskrivning. En sådan laboration följer en räls och studenterna förväntas hoppa på tåget och nå förväntad destination. Den undersökande varianten (Inquiry) å andra sidan

har inte ett fördefinierat mål, och studenterna utformar laborationen efter eget huvud. 10 Baillie och Hazel har en annan men liknande uppdelning av laborativa uppgifter med varierande grad av oberoende (tabell 1) 11. )"*+&,*& -./%-/01/& 2,.-%,3-%"/,43"*"3/3& 5+6& 5,3/%",6& 5/3-1& 7/8$63,3& >! #$&7)*50+5-7)!?-.$5!?-.$5!?-.$)!?-.$5! @! A7)507BB$0+C!D.)-)E!?-.$5!?-.$5!?-.$)! F,,$5! G! 150('5(0$0+C! %70*')-)E*(,,E-%5! 9,./66&:(&&2B-'+!5I,$?-.$5!?-.$5;!H$B5! $BB$0!C$B.-*! F,,$5;! H$B5!$BB$0! C$B.-*! F,,$5! Föga förvånande har den traditionella laborativa undervisningen, i likhet med den traditionella katedrala föreläsningen, utsatts för mycket kritik. Den må vara effektiv (i någon mening) för stora studentgrupper, men den stimulerar inte till reflektion eller djupinlärning. Vår ambition är att ytterligare utveckla laborationen och ge den en mer undersökande karaktär. Laborationen kommer även fortsättningsvis att behandla immuncellers förmåga att eliminera tumörceller. Vi kommer dock att inkludera nyutvecklade läkemedel som kan påverka interaktionerna mellan immunceller och tumörceller. Laborationens ramar kommer att definieras vid en introducerande föreläsning (vilka celler kommer vi att arbeta med, vilka substanser kan ni använda för att påverka cellerna), men studenterna får sedan själva bestämma vilka frågor de vill söka att besvara genom experiment och skriva ner hur de avser att gå tillväga för att göra det. Genom detta förfarande ökar vi förhoppningsvis studenternas engagemang och de tvingas att förbereda sig inför laborationen. Studier har visat att den tid som studenterna ägnas åt förarbete inför en laboration och efterarbetet i hög grad styr hur mycket studenter lär sig. 12 Under laborationen är min tanke att vi lärare skall fungera som bollplank och Vygotskij-inspirerade guider; vi skall inte säga exakt hur de skall gå!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 10 Domin, DS. A Review of Laboratory Instruction Styles, J. Chem. Educ., 1999, 76 (4), s 543 11 Baillie, C & Hazel, E. Teaching materials laboratory classes. 2003 The UK Centre for Materials Education (http://www.materials.ac.uk/guides/9-lab-classes.pdf) 12 Bennet S.W., Seery, M.K., Sövegjarto-Wigbers, D. Practical work in higher level chemistry education, Innovative methods of teaching and learning chemistry in higher education. (2009), s 93.

tillväga, men lotsa dem och hjälpa dem att utföra mer avancerade problemlösningar än de kanske hade klarat av på egen hand. 13 Till skillnad från den första upplagan av laborationen är vår avsikt att studenterna även fortsättningsvis själva skall få analysera sina prover med avancerad metodik. Vi tror att detta gör mötet med flödescytometritekniken mer meningsfull än vid en demonstration. Studenterna kommer sedan få författa en skriftlig rapport där de skall diskutera sitt experimentella upplägg, de erhållna resultaten och hur de stämmer överens/skiljer sig från den teori som kursböcker och föreläsningar har förmedlat. I rapporten skall studenterna också beröra frågor såsom: Hade något i genomförandet kunnat förbättras?; vad är den svaga länken?; hur trovärdiga är resultaten? Avslutande kommentarer Till skillnad från traditionell föreläsning har aldrig laborativ undervisning berörts inom de pedagogiska kurser som jag har läst, och jag har inte heller reflekterat kring laborationsundervisningens brister. Litteratursökningen inom detta arbete fick mig verkligen att få upp ögonen för traditionell laboratorieundervisnings tillkortakommanden. En traditionell laboration behöver förstås inte vara meningslös utifrån ett inlärningsperspektiv; en viss förtrogenhet om hur det går till i en laborationssal kan nog de flesta få med sig, men frågan är hur relevant det är för den stora andelen apotekare som inte kommer att ägna sig åt laborativt arbete efter examen. Jag tror inte att det är ett vågat påstående att säga att den laboratorieundervisning är en pedagogisk resurs som kan användas mycket bättre. Våra mål får inte vara för högt ställda utifrån de givna resurserna, men inom laborativ undervisning bör fokus ligga på mål på en hög taxonomisk nivå, dvs nå bortom det praktiska utförandet eller användningen av specifik apparatur. 14 En stor utmaning för oss är att genomföra en radikal förändring av laboratorieundervisningen när man ansvarar för en mycket begränsad del av utbildningen. Andra institutioner, och t o m andra fakulteter, har redan format studenternas uppfattningar om universitetsutbildning och laborativ undervisning när de!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 13 Pettersen, RC. Kvalitetslärande i högre utbildning (2005) s107 ff 14 Referens i Davies, C. Learning and teaching in laboratories, 2008. Higher Education Academy Engineering Subject Centre

kommer till vår kurs. Att inom ramen för en laboration introducera en ny didaktisk metod (som dessutom är ganska krävande för studenterna) och samtidigt säkerställa att studenterna tillgodogör sig tillräckligt med ämneskunskap är en utmaning. Förhoppningen är dock vi skall skapa en laboration som blir ett effektivt inlärningsmoment inom apotekarutbildningen.

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020!"#$#%&%'()"(*)+,-.&-.(/01(,23$.0-44-.(3-#(+/354-3-%,(.-65-+,&"-( )+,&"-.)#-(7890-44-.( :%4-#%&%'( Syftet med denna laboration är att ni skall förstå de avdödningsfunktioner som är av betydelse för att skydda oss mot mikroorganismer och mot egna avvikande celler. Fagocyterande vita blodkroppar och NK-celler är exempel på två olika celltyper som är utrustade med avdödningsfunktioner, men även lösliga proteiner (exempelvis de som ingår i komplementsystemet) kan döda andra celler. De fagocyterande cellerna behandlas inte under laborationen och för en genomgång av deras avdödningsfunktion hänvisas till en föreläsning som hålls under kursen. Omkring 10 % av de mononukleära cellerna i blodet är NK-celler. De identifierades på 1970-talet som stora granulerade lymfocyter och fick namnet Natural Killer cells av forskare vid Karolinska institutet. Karakteristiskt för dessa celler är att de kan döda tumörceller och virusinfekterade celler utan att först instrueras av antigenpresenterade celler. Till sin hjälp har NK-celler ett stort antal olika aktiverande och inhiberande receptorer på cellytan. Viktiga inhiberande receptorer är de sk KIR ( Killer Immunoglobulin-like Receptors ) medan de viktigaste aktiverande receptorerna är NCRs ( Natural cytotoxicity receptors tex NKp30 och NKp46) och NKG2D. KIR känner igen MHC I-komplexet som uttrycks av alla normala kärnförsedda celler i kroppen. NKG2D känner igen proteiner som uppregleras på stressade celler (tex strukturen MICA) medan NCRs bl.a. känner igen virala proteiner. När NK-cellen stöter ihop med en målcell kommer de olika strukturerna på målcellen binda in till de olika NK-cellsreceptorerna. Vad NK-cellen slutligen gör (avdödning eller ej) bestäms av balansen mellan aktiverande och inhiberande signaler som skickas in i NK-cellen (figur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

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020 Syftet med den första delen av laborationen är att demonstrera hur NK-cellers cytotoxicitet fungerar samt hur cytotoxiciteten kan mätas med moderna laboratorietekniker. Laborationen avser dessutom att introducera centrala immunologiska tekniker såsom densitetsgradientsseparation, cellräkning och flödescytometri. I laborationen kommer mononukleära celler att isoleras från blodgivarblod. De mononukleära cellerna kommer att inkuberas med tumörcellslinjen Daudi i närvaro eller frånvaro av den NK-cellsaktiverande cytokinen IL-2. Daudi saknar MHC I och kan därmed dödas av NK-celler framförallt om NK-cellerna först stimulerats med IL-2. Efter ett antal timmars inkubering kommer andelen avdödade tumörceller att bestämmas med hjälp av flödescytometri. Syftet med den andra delen av laborationen är att demonstrera komplementsystemets bakteriedödande funktion. Komplementsystemet består av ett antal plasmaproteiner som från en inaktiv form (zymogener), vid aktivering överförs till aktiva komponenter. Aktiveringen sker på ett karakteristiskt sätt med en successiv förstärkning, sk kaskadeffekt. Aktiveringen kan ske enligt två olika vägar som brukar kallas den klassiska respektive den alternativa vägen. Den klassiska vägen aktiveras med hjälp av antikroppar (IgG1, IgG3 eller IgM) eller ett mannosbindande plasmaprotein (MBP). Den alternativa vägen aktiveras direkt av den främmande partikeln via t.ex endotoxin från G-negativa bakterier, teichonsyra från G-positiva bakterier eller ytstrukturer på vissa virus och transformerade celler. I ett appendix som återfinns i slutet av laborationshandledningen finns lite mer om komplementsystemets biologiska effekter. ;-5).),&/%()"(*4/#0-44-.(6/3(6+)44()%"<%#)6(=$.(7890-4464)*/.),&/%-%( Vid separation av olika blodkroppar utnyttjar man det faktum att olika celltyper har olika densitet. Röda blodkroppar > granulocyter > monocyter/lymfocyter > trombocyter. Under laborationen används en speciell typ av blodprovsrör, sk BD Vacutainer CPT med citrat. Citrat fungerar som antikoagulant, dvs förhindrar att blodprover levrar sig. I botten av röret finns en hög-densitetslösning (1,077g/ml) av FICOLL-HYPAQUE. Ovanför Ficoll-lösningen ligger en barriär av polyestergel som förhindrar att blodet blandar sig med Ficoll-lösningen. När provet centrifugeras i hög hastighet kommer de röda blodkropparna och granulocyterna (som har högre densitet än 1,077g/ml) att tryckas igenom barriären och lägga sig i botten på röret. De övriga blodkropparna (monocyter, lymfocyter och trombocyter) har lägre densitet och återfinns därför i ett vitaktigt lager ovanför gelbarriären efter centrifugering (se figur 2).!!!!

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020 "#$%&!)!

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020 De mononukleära cellerna kan sedan sugas upp med en pipett tillsammans med trombocyterna, varefter trombocyterna tvättas bort med hjälp av en centrifugering vid lägre hastighet. >)2#&90-44-.( Daudi-celler är en human B-lymfoblastoid cellinje som isolerats från ett Burkitt-lymfom. Cellerna uttrycker inte MHC I på ytan och kan dödas av cytokin-stimulerade NK-celler (i äldre litteratur även kallade LAK-celler, lymphokine-activated killer cells ). I den här laborationen är Daudi-cellerna infärgade med den orange membranfärgen PKH-26 som tack vare sin hydrofobicitet tränger in i cellmembranet. Den orange färgen gör det möjligt att skilja tumörcellerna från de vanliga lymfocyterna i den flödescytometriska analysen under dag II.?4$#-60@,/3-,.&( I en flödescytometer sugs vätska innehållande partiklar/celler upp i en tunn slang. Cellerna radas upp en efter en och leds in i en laserstråle. Olika celler bryter ljuset på olika sätt, dels beroende på storlek/volym, dels beroende på hur granulerade de är. Varje cell analyseras och får ett storleksvärde (Forward Scatter, FSC) och ett granuleringsvärde (Side Scatter, SSC). På detta sätt kan ett cellprov analyseras och andelen av olika sorters blodceller kan bestämmas beroende på hur stora och hur granulerade de är. Utöver cellernas storlek och granulering kan flödescytometri också ge information om cellernas fenotyp, aktiveringsgrad och huruvida de är levande eller döda. Genom att använda antikroppar mot cellytestrukturer som är specifika för en viss celltyp (tex NK-celler) kan man bestämma andelen av exempelvis NK-celler i ett prov. Den NK-cellsspecifika antikroppen konjugeras med en fluorokrom som exciteras av laserljuset. När fluorokromen återgår till sitt grundtillstånd skickar den ut ljus av en viss våglängd (emission). Detta ljus kvantifieras av detektorer, och således kan uttrycket av den specifika NK-cellsstrukturen bestämmas för varje cell som leds in i flödescytometern. I avancerade flödescytometrar finns flera laserkällor som sänder ut ljus med olika våglängd detta möjliggör användande av ett stort antal antikroppar som är konjugerade till olika fluorokromer samtidigt. Man kan även använda färger som själva binder in till olika cellulära strukturer, som ex DNA, cellmembran, mitokondrier osv I den här laborationen använder vi oss av två olika flödescytometrar: en FACSCanto II med tre lasrar, som mäter FSC, SSC och 8 olika färger, och en Accuri C6 med två lasrar, som mäter FSC, SSC och fyra färger.!%)4@6()"(#),)( Den orange membranfärgen, PKH-26, exciteras av den blåa lasern (488nm) och emitterar ljus runt 567nm. Flödescytometern kommer att identifiera Daudi-cellerna som celler med hög signal i den orange detektorn (~567nm), medan blodgivarcellerna som inte är orangefärgade kommer att ge en låg signal. För att bestämma hur stora andel av Daudi-cellerna som har dött tillsätts en färg som binder till döda celler. Färgen FARVID (excitation 633nm, emission 646nm) binder in till amin-grupper, och dessa finns framförallt inne i cellen. FARVID kan inte röra sig över intakta membraner och således kommer levande celler endast färgas i låg utsträckning. FARVID tränger däremot in genom porerna i lyserade tumörceller och färgar dem intensivt röda. Således kommer döda tumörceller att kunna identifieras som celler som både är orange (PKH-26) och röda (FARVID), medan levande Daudiceller endast är orange

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020 (PKH-26). Blodgivarcellerna kommer att detekteras som icke-orange, några av dem har eventuellt dött under inkuberingen och kommer således att färgas in med FARVID (se figur 3). "#$%&!*! 0 ( ( ( ( 0! A),-.&)4(=$.(7890-4464)*/.),&/%-%( 1 provrör med 8ml helblod(buffy coat) spädd med buff NaCl 1 BD vacutainer CPT-rör 1 15-ml-rör Flaska med buffrad natriumklorid Slaskburk Cellräkningskopp Komplett medium med 10% serum IL-2 (400 U/ml) PKH-26-färgade Daudiceller (400 000/ml) 96-hålsplatta Pipetter A),-.&)4(=$.(+/354-3-%,4)*/.),&/%-%( Rör med normalt humant serum (NHS) Rör med värmebehandlat NHS Rör med bakteriesuspension 1 2x105/ml Rör med bakteriesuspension 2 2x105/ml Agarplattor (lb-medium) 12 st Racklor (4st) Pipetter Vidallrör med kork

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020 B,=$.)%#-C(7890-4464)*/.),&/%-%C(#)'(D(( M Överför blodet från provröret till ett BD Vacutainer CPT-rör M Ställ i centrifugen och centrifugera i 20 min, 1500 g i rumstemperatur. Starta komplementlaborationen i den här pausen. Se nedan. M Hämta CPT-röret och notera hur de olika blodcellerna har separerats, se figur 1. M Resuspendera det vitaktiga cellagret i den överliggande plasman och överför plasma och celler till ett 15 ml-rör. Fyll upp med buffrad natriumklorid-lösning. Centrifugera 10 min, 300g, rumstemperatur. M Efter centrifugeringen, häll av supernatanten i slaskburken och resuspendera sedan cellerna i 1 ml komplett medium. Överför 20!l av cellsupensionen till cellräkningskoppen och sätt sedan till exakt 10 ml buffrad NaCl till koppen. Sätt på locket och räkna cellerna i cellräknaren. Värdet som cellräknaren ger är uttryckt i antal tusen celler per ml i ditt prov. Späd cellerna till 2milj/ml genom att sätta till lämplig mängd komplett medium. M Märk upp tre brunnar på 96-hålsplattan: 1. Daudi-kontroll 2. Daudi + PBMC 3. Daudi + PBMC + IL-2 Till plattan pytsats enligt följande: 0 Daudi-kontroll Daudi + PBMC Daudi + PBMC + IL-2 Komplett medium 150!l 50!l 0 Daudi 50!l 50!l 50!l PBMC 0 100!l 100!l IL-2 0 0 50!l M Anteckna slutkoncentrationerna av celler och IL-2. M Ställ plattan på vagnen för transport till 37 C-inkubator Efter 4h kommer labhandledarna sätta till FarVID och analysera cytotoxiciteten med flödescytometri. (

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020 B,=$.)%#-C(+/354-3-%,4)*/.),&/%-%C(#)'(D(( M Till fyra Vidallrör pytsas enligt följande: Rör 1 Rör 2 Rör 3 Rör 4 NHS 3 droppar 3 droppar NHS-56 3 droppar 3 droppar Bakteriesusp. 1 3 droppar 3 droppar Bakteriesusp. 2 3 droppar 3 droppar ( M Inkubera rören (med propp) i 37 o C i ca 30 min M Gör en spädningsserie 10-1, 10-2 och 10-3 från varje rör i fysiologiskt koksalt. Förslagsvis 100µl bakteriesuspension till 900 µl koksalt. M Glöm inte att blanda ordentligt innan spädning och beakta steriltekniken. M Sprid 100 µl från varje spädning på LB-plattor (sammanlagt 12 st) som skall märkas med gruppnummer och provnummer. Rackla ut dropparna. M Inkubera plattorna över natt i 37 o C termostat.

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020 >)'(EC(7890-4464)*/.),&/%-%(F1)4")('.255-%(6/3(6-#)%(*@,-.(,&44(4)*6)4-%G( M Demonstration av fenotypisk analys av lymfocyter i föreläsningssalen. M Utdelning av laborationsresultat. M En uppsättning prov från laborationen analyseras på Accuri C6 i föreläsningssalen. >)'(EC(+/354-3-%,4)*/.),&/%-%(F1)4")('.255-%(6/3(6-#)%(*@,-.(,&44(=$.-4<6%&%'66)4-%G( M Avläsning av resultatet i labsalen. M Räkna med hjälp av de plattor som har 20-200 kolonier ut hur många bakterier det fanns i respektive rör. M Gör en Gram-färgning av bakterie 1 och 2. (se labkompendiet för en beskrivning av färgning och mikroskopering). M Försök förklara resultatet.

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020 APPENDIX KOMPLEMENTSYSTEMETS BIOLOGISKA EFFEKTER Komplementsystemet utgör genom den baktericida effekten en viktig del i det humorala försvaret mot mikroorganismer, och systemet kan döda invaderande mikrober också i den preimmuna fasen. Komplementsystemet deltar också i regleringen av inflammationsprocessen (kan både förstärka och begränsa reaktionen) och många klyvings-/degradationsprodukter från komplementsystemet har biologisk aktivitet. Produkt: C2a C3a, C4a, C5a C3a C5a C3b, ic3b, C4b Biologisk effekt: Ökar kärlpermeabiliteten och kontraherar glatt muskulatur Anafylatoxiner. Binder till receptorer på granulocyter, makrofager, mastceller och trombocyter, och frisätter därmed vasoaktiva aminer och lysosomala enzymer. Kemotaktisk för eosinofila granulocyter Kemotaktisk för granulocyter och monocyter Opsoniner C6-9 Membrane attack complex (MAC) förorsakar membranskada som kan leda till lys av en cell som binder komplexet. C3e Rekryterar granulocyter från benmärgen. SJUKDOMAR ASSOCIERADE MED FEL ELLER BRIST PÅ EN KOMPLEMENTFAKTOR Defekt/brist: C1q C1r Symptom/sjukdom: Vaskulit, nefrit, SLE eller liknande syndrom, hypogammaglobulinemi samt kroniska bakteriella infektioner. Recidiverande infektioner, njursjukdomar, SLE eller liknande syndrom, reumatiska sjukdomar. C4, C2 SLE, infektionskänslighet C3, C5, faktor H Recidiverande infektioner med pyogena infektioner. C6, C7, C8 Recidiverande infektioner med Neisseria.0

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310!"#$#%&%'()"(*)+,-.&-.(/01(,23$.0-44-.(3-#(+/354-3-%,(.-65-+,&"-( )+,&"-.)#-(7890-44-.(/01(.&,2:&3)*( ;%4-#%&%'( Avsikten med denna laboration är att den skall öka er förståelse för de avdödningsfunktioner som är av betydelse för att skydda oss mot mikroorganismer och mot egna avvikande celler. Fagocyterande vita blodkroppar och NK-celler är exempel på två olika celltyper som är utrustade med avdödningsfunktioner, men även lösliga proteiner (exempelvis de som ingår i komplementsystemet) kan döda andra celler. De fagocyterande cellerna behandlas inte under laborationen och för en genomgång av deras avdödningsfunktion hänvisas till en föreläsning som hålls under kursen. Omkring 5-20 % av de mononukleära cellerna i blodet är NK-celler. De identifierades på 1970- talet som stora granulerade lymfocyter och fick namnet Natural Killer cells då dessa celler kan döda tumörceller och virusinfekterade celler utan att först instrueras av antigenpresenterande celler. Till sin hjälp har NK-celler ett stort antal olika aktiverande och inhiberande receptorer på cellytan. De inhibitoriska KIR-receptorerna känner igen MHC I- komplexet som uttrycks av normala celler i kroppen, medan vissa aktiverande receptorer känner igen proteiner som uppregleras på stressade och virusinfekterade celler. En annan aktiverande receptor på NK-celler är CD16 en Fc-receptor. CD16 binder till Fc-delen på IgGantikroppar. En cell med antikroppar bundna på sin yta kommer således att trigga en aktiverande signal i NK-cellen och kan därför dödas av NK-celler via antikroppsberoende avdödning (ADCC; antibody-dependent cell cytotoxicity). När NK-cellen stöter ihop med en målcell kommer olika strukturer på målcellen binda in till de olika NK-cellsreceptorerna. Vad NK-cellen slutligen gör (avdödning eller ej) bestäms av balansen mellan aktiverande och inhiberande signaler som skickas in i NK-cellen (figur 1).!!!! "#$%&!'(!4506'.7%-(06%"8.9%0"&&0:-,,-%0)$80%');-%"%0"&&0 +<+")0"50=>?:-,,-%0"(&'(.-(07&&%@:;-%0ABC0D0'0,'&-(0 7&)&%E:;('(.0F+5)0.-%0-(+")&07GG*$50&',,0)5"."0 '(*'#'&$%');"0)'.(",-%0'0=>?:-,,-(H0",&-%("&'5&07&&%@:;-%0 )&%-))G%$&-'(-%0F)9)$80ADC4H0-,,-%0,'."(+-%06<%0=CI0'0 )&$%07&)&%E:;('(.0F+5)0.-(-%-%"%0)&"%;"0";&'5-%"(+-0 )'.(",-%0'0=>?:-,,-(HJ0K(0;$8#'("&'$(0"50,'&-&0ABC0D? 7&&%@:;0$:*07&&","&0)&%-))G%$&-'(7&%@:;0<;"%0%');-(06<%0 "5+<+('(.0@&&-%,'."%-JJ0

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310 Kronisk lymfatisk leukemi. Sjukdomen kronisk lymfatisk leukemi är en hematologisk malignitet som karaktäriseras av en långsam men okontrollerad expansion av omogna lymfocyter av B-cellskaraktär (B-KLL). KLL drabbar ofta äldre män och många hinner med dagens behandlingar avlida av andra orsaker än sin leukemi. Flödescytometri. Flödescytometri är idag det absolut mest använda och kraftfulla verktyget för immunologisk forskning. Principen bygger på att man binder en fluorescent (exciterbar) fluorokrom till cellen, oftast kopplad till en antikropp, som sedan kan analyseras med en flödescytometer. I korthet så behandlas celler med en fluorokromkonjugerad antikropp eller färg, cellerna sugs upp i flödescytometern och passerar sedan en eller flera lasrar. När infärgade celler passerar lasern exciteras fluorokrom och det ljus som sedan emitteras från infärgade celler kan detekteras. På så sätt kan infärgade celler särskiljas från ofärgade. Genom att kombinera olika färger och olika specifika antikroppar kan noggranna analyser av immunförsvarets komponenter göras. Flödescytometern ger även grova mått på en cells storlek samt dess granulering. Ovan syns en typisk fenotypning gjord med en flödescytometer. Denna typ av figurer kallas dot-plots. I dot-plotten representerar varje prick en cell. I dot-plotten längst till vänster är storlek (Forward scatter; FSC) på x-axeln, och granuleringsgrad (Side scatter; SSC) på y-axeln. Den inringade gruppen (populationen) i mitten är lymfocyter och bara dessa celler visas sedan i dot-plotten i mitten, där CD3 finns på x-axeln och CD56 på y-axeln. NK-celler som saknar CD3 kommer att hamna långt till vänster. Däremot uttrycker de CD56 på sin yta och kommer därför hamna längst upp till vänster i den blåa populationen. T-celler uttrycker alltid CD3 (T-cellsreceptorn) och kommer därför att finnas till höger i plotten (grön population). I den högra dot-plotten visas sedan CD8 mot CD4. Som nämnts på föreläsningarna fördelar sig de gröna T-cellerna i två olika populationer en population uttrycker CD8 (längst upp till vänster), den andra uttrycker CD4 (längst ner till höger). I princip ingen cell uttrycker både CD4 och CD8.

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310 I den här laborationen använder vi oss av en Accuri C6 flödescytometer som är utrustad med två lasrar och mäter FSC, SSC och fyra färger. <=>,-( Syftet med den första delen av laborationen är att låta er själva att utforma ett experiment som kan utvärdera NK-cellers och/eller en terapeutisk antikropps (Mabthera, rituximab) förmåga att avdöda leukemiska celler samt att ge en inblick i hur cytotoxicitet kan mätas med moderna laboratorietekniker. Syftet med den andra delen av laborationen är att demonstrera komplementsystemets bakteriedödande funktion. Komplementsystemet består av ett antal plasmaproteiner som från en inaktiv form (zymogener), vid aktivering överförs till aktiva komponenter. Aktiveringen sker på ett karakteristiskt sätt med en successiv förstärkning, sk kaskadeffekt. Aktiveringen kan ske enligt två olika vägar som brukar kallas den klassiska respektive den alternativa vägen. Den klassiska vägen aktiveras med hjälp av antikroppar (IgG1, IgG3 eller IgM) eller ett mannosbindande plasmaprotein (MBP). Den alternativa vägen aktiveras direkt av den främmande partikeln via t.ex endotoxin från G-negativa bakterier, teichonsyra från G-positiva bakterier eller ytstrukturer på vissa virus och transformerade celler. I ett appendix som återfinns i slutet av laborationshandledningen finns lite mer om komplementsystemets biologiska effekter.?$.2,6@,,%&%').("&#(7894)*/.),&/%-%( Ni kommer att få tillgång till en tumörcellinje som kallas 221. Denna cellinje är en EBVtransfekterad cellinje av B-cellskaraktär. I denna laboration kommer vi att använda 221 som ett substitut för KLL-celler (kronisk lymfocytisk leukemi). 221-cellerna uttrycker inte MHC I på cellytan och kan alltså inte binda in till NK-cellernas KIR. Således kommer 221-celler inte skapa en inhibitorisk signal i NK-celler utan kan dödas av NK-celler. 221-linjen kommer att vara märkt med en fluorescent färg som heter PKH26. Den orange färgen gör det möjligt att skilja 221-cellerna från NK-cellerna i den flödescytometriska analysen under dag II. Genom att tillsätta en fluorescent färg med benämningen FarVid (görs av handledare 4h efter laborationen) kommer även andelen döda celler att kunna analyseras med flödescytometer. Ni har även tillgång till expanderade NK celler. Detta innebär att NK-celler har odlats och förökats i cellodlingsflaskor under 3 veckor. Detta har gjorts för att få många aktiverade NKceller till laborationen. Alla grupper har således NK-celler från samma donator. Rituximab (Mabthera ) är en monoklonal antikropp som används vid behandling av KLL. Följande text är tagen från FASS och beskriver i korthet dess funktion vid behandling av KLL. Farmakodynamik Rituximab binder specifikt till det transmembrana antigenet, CD20, ett icke glykosylerat fosfoprotein, lokaliserat på pre-b och mogna B-lymfocyter. Antigenet uttrycks på > 95 % av alla B-cells non- Hodgkinlymfom. CD20 återfinns både på normala och maligna B-celler, men inte på hematopoietiska stamceller, pro-b-

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310 celler, normala plasmaceller eller annan normal vävnad. Detta antigen internaliseras inte vid antikroppsbindning och secerneras inte. CD20 cirkulerar inte i plasma som ett fritt antigen och konkurrerar således inte om antikroppsbindningen. Fab-domänen hos rituximab binder till CD20 antigenet på B-lymfocyter och Fc-domänen kan inrikta immunsystemets effektorsteg till att mediera B-cellslys. Möjliga mekanismer för effektormedierad lys av celler inkluderar komplement-beroende cytotoxicitet (CDC) som ett resultat av C1q-bindningen och antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC) medierad av en eller flera Fc!-receptorer på ytan av granulocyter, makrofager och NK-celler. Genom bindning till CD20 antigenet på B-lymfocyter har rituximab även visats inducera celldöd via apoptos. Antalet perifera B-celler sjönk under normalvärdet efter att den första infusionen med MabThera fullföljts. Hos patienter behandlade för hematologiska maligniteter började B-cellsnivåerna öka inom 6 månader efter avslutad behandling, för att återvända till normala värden mellan 9-12 månader efter avslutad behandling. Hos patienter med reumatoid artrit observerades en omedelbar minskning av antalet B-celler i perifert blod efter två MabThera-infusioner à 1000 mg givna med 14 dagars intervall. Antalet B-celler i perifert blod började återkomma från vecka 24 och normalisering av B-cellsnivåerna observerades hos majoriteten av patienterna efter 40 veckor, oavsett om MabThera gavs som monoterapi eller i kombination med metotrexat. Fc-Block är en lösning som blockerar NK-celler och makrofagers Fc-receptorer, dvs de strukturer som binder in den icke-specifika delen av en antikropp. Genom att använda Fc-block omöjliggörs antikroppsmedierad cellulär avdödning (s.k. ADCC) av målcellen.!%)4=6()"(#),)( Den orange membranfärgen, PKH-26, exciteras av den blåa lasern (488nm) och emitterar ljus runt 567nm. Flödescytometern kommer att identifiera 221-cellerna som celler med hög signal i den orange detektorn (~567nm), medan blodgivarcellerna som inte är orangefärgade kommer att ge en låg signal. För att bestämma hur stora andel av 221-cellerna som har dött tillsätts en färg som binder till döda celler. Färgen FARVID tränger däremot in genom porerna i lyserade tumörceller och färgar dem intensivt röda. Således kommer döda tumörceller att kunna identifieras som celler som både är färgade med PKH-26 och FARVID (längst upp till höger i fig. till höger), medan levande 221-celler endast är PKH-26-positiva (uppe till vänster). NK-cellerna kommer att detekteras som ickeorange, några av dem har eventuellt dött under inkuberingen och kommer således att färgas in med FARVID (nere till höger).!!

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310 A),-.&)4(,&44(7890-4464)*/.),&/%-%( 1 provrör NK-celler, koncentration står angiven på röret. 1 provrör PKH26 färgade 221-celler, koncentration står angivet på röret 1 provrör Rituximab stamlösning, koncentration står angivet på röret. 1 provrör Fc-block, koncentration står angivet på röret 4 st 10 ml provrör 1 rör Iscoves medium kompletterat med 10% humant AB-serum 96 hålsplatta 8 st FACS-rör, 5 ml Pipetter A),-.&)4(>$.(+/354-3-%,4)*/.),&/%-%( Rör med normalt humant serum (NHS) Rör med värmebehandlat NHS Rör med bakteriesuspension 1 2x105/ml Rör med bakteriesuspension 2 2x105/ml Agarplattor (lb-medium) 12 st Racklor (4st) Pipetter Vidallrör med kork

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310 ;%>$.()"#$#%&%'64)*/.),&/%B(#)'(CD( Tänk noga igenom vilka olika experiment ni behöver göra för att undersöka NK-cellers cytotoxicitet samt Rituximabs funktion i avseende på CDC, ADCC samt dess direkta apoptotiska effekt. Beräkna vilka koncentrationer av NK-celler, 221-celler samt Rituximab ni vill använda för att uppnå önskade ration. Tillsätt varje komponent i en volym om 50!l. Avsluta med att sätta till medium så att slutvolymen i varej brunn blir 200!l. Varje komponent kommer då att spädas ut 4 gånger (från 50!l till 200!l) Ex. Pelle och Kerstin vill bl.a. undersöka rituximabs direkta cytotoxiska effekt på 221-celler. De vill använda 100 tusen 221-celler och en koncentration av rituximab om (1"g/ml). För att kompensera spädningseffekten av rituximab gör de en lösning som innehåller 4"g/ml. Sedan räknar de ut koncentrationen som krävs för att 50"l 221-suspension skall innehålla 100 tusen celler. Till brunn A1 sätter de: 50"l 221-celler, 50"l rituximab (4"g/ml) och 100"l medium (Totalt 200"l) Till brunn A3 sätter de: 50"l 221-celler och 150"l medium (Totalt 200"l) Vid dag II undersöker de hur stor andel av 221-cellerna som är döda i de två brunnarna. Skillnaden utgör rituximabs cytotoxiska effekt. Några saker att tänka på när ni utformar er laboration: L L L Späd NK-celler, 221-celler samt Rituximab till lämpliga koncentrationer i Iscoves medium, tänk på att den totala volymen i brunnen inte får överstiga 200µl. Sätt ut NK-celler, 221-celler, Rituximab samt Fc-block i lämpliga kombinationer för att undersöka NK-cellers cytotoxiska effekt samt Rituximabs effekt. Tänk på att ta med kontroller (som brunn A3 i exemplet ovan) så att ni har något att jämföra med. En lämplig mängd 221-celler (målceller) är 100.000 celler/brunn. Anpassa mängden NK-celler därefter. L Lämpliga förhållanden mellan NK celler och 221-celler är från 1:1 till 10:1 L L L Lämpliga slutkoncentrationer av Rituximab är 1ug/ml och 5ug/ml För att ha tid att analysera era experiment bör er uppställning omfatta maximalt 8-12 brunnar. Kom gärna överens med en annan grupp för att kunna jämföra olika ration eller koncentrationer. Se bara till att ni har kontroller till era egna försök. Sätt alla prover i en rad efter varandra (se fig) Före laborationsstart Lämna in en kopia av ert laborationsprotokoll till labhandledarna. Protokollet skall inkludera en skiss över er försöksuppställning, en beskrivning av genomförandet, samt en kort motivering till era val. Sätt ert experiment på en 96-hålsplatta. Visa plattan för handledarna. Efter 4h kommer labbhandledarna sätta till FarVID och fixera proverna.

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310 E,>$.)%#-B(+/354-3-%,4)*/.),&/%-%B(#)'(C(( L Till fyra Vidallrör pytsas enligt följande: Rör 1 Rör 2 Rör 3 Rör 4 NHS 3 droppar 3 droppar NHS-56 3 droppar 3 droppar Bakteriesusp. 1 3 droppar 3 droppar Bakteriesusp. 2 3 droppar 3 droppar ( L Inkubera rören (med propp) i 37 o C i ca 30 min L Gör en spädningsserie 10-1, 10-2 och 10-3 från varje rör i fysiologiskt koksalt. Förslagsvis 100µl bakteriesuspension till 900 µl koksalt. L Glöm inte att blanda ordentligt innan spädning och beakta steriltekniken. L Sprid 100 µl från varje spädning på LB-plattor (sammanlagt 12 st) som skall märkas med gruppnummer och provnummer. Rackla ut dropparna. L Inkubera plattorna över natt i 37 o C termostat.

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310 F)'(GB(7890-4464)*/.),&/%-%(( L Resuspendera era prover försiktigt med en pipett L För över era prover till FACS-rör, glöm ej att märka era rör. L Avvakta er grupps tur att analysera proverna på FACSen (Accuri C6) En labbrapport om en sida från varje grupp skall lämnas in. Labbrapporten skall behandla följande frågor: Vilka experiment gjorde vi? Hur resonerade vi då vi planerade experimentet? Motivera brunnar ni satte. Vilka resultat fick vi? Vilka slutsatser kan vi dra av resultatet? Finns det något vi kunde ha gjort annorlunda för att få en tydligare bild av NK-cellers och Rituximabs funktion? F)'(GB(+/354-3-%,4)*/.),&/%-%(( L Avläsning av resultatet i labsalen. L Räkna med hjälp av de plattor som har 20-200 kolonier ut hur många bakterier det fanns i respektive rör. L Gör en Gram-färgning av bakterie 1 och 2. (se labkompendiet för en beskrivning av färgning och mikroskopering). L Försök förklara resultatet.

!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310 APPENDIX KOMPLEMENTSYSTEMETS BIOLOGISKA EFFEKTER Komplementsystemet utgör genom den baktericida effekten en viktig del i det humorala försvaret mot mikroorganismer, och systemet kan döda invaderande mikrober också i den preimmuna fasen. Komplementsystemet deltar också i regleringen av inflammationsprocessen (kan både förstärka och begränsa reaktionen) och många klyvings-/degradationsprodukter från komplementsystemet har biologisk aktivitet. Produkt: C2a C3a, C4a, C5a C3a C5a C3b, ic3b, C4b Biologisk effekt: Ökar kärlpermeabiliteten och kontraherar glatt muskulatur Anafylatoxiner. Binder till receptorer på granulocyter, makrofager, mastceller och trombocyter, och frisätter därmed vasoaktiva aminer och lysosomala enzymer. Kemotaktisk för eosinofila granulocyter Kemotaktisk för granulocyter och monocyter Opsoniner C6-9 Membrane attack complex (MAC) förorsakar membranskada som kan leda till lys av en cell som binder komplexet. C3e Rekryterar granulocyter från benmärgen. SJUKDOMAR ASSOCIERADE MED FEL ELLER BRIST PÅ EN KOMPLEMENTFAKTOR Defekt/brist: C1q C1r Symptom/sjukdom: Vaskulit, nefrit, SLE eller liknande syndrom, hypogammaglobulinemi samt kroniska bakteriella infektioner. Recidiverande infektioner, njursjukdomar, SLE eller liknande syndrom, reumatiska sjukdomar. C4, C2 SLE, infektionskänslighet C3, C5, faktor H Recidiverande infektioner med pyogena infektioner. C6, C7, C8 Recidiverande infektioner med Neisseria.0