Elektroporation. Test av ny teknik för ökad metanbildning och hygienisering vid rötning RAPPORT 2007:14 ISSN

Elektroporation. Test av ny teknik för ökad metanbildning och hygienisering vid rötning RAPPORT 2007:14 ISSN 1103-4092

Förord Elektroporation är en ny teknik för att med elektriska pulser forcera rötningsprocesser och avdöda patogener. Metoden används bland annat inom livsmedelsindustrin och i medicinska tillämpningar. I detta projekt har Holger Ecke, Luleå tekniska universitet, undersökt möjligheten att genom elektroporation dels effektivisera rötningen och öka metangasproduktionen, dels få ett verktyg för hygienisering. Tanken var att metoden skulle kunna användas för vissa organiska avfallsfraktioner som till exempel avfall från livsmedelsindustrin, källsorterat hushållsavfall, slakteriavfall, gödsel, reningsverksslam, energigrödor m.m. Metangasproduktionen ökade men däremot uppfyllde inte metoden kraven för hygieniseringen. Malmö oktober 2007 Håkan Rylander Ordf. Avfall Sveriges Utvecklingskommitté Weine Wiqvist VD Avfall Sverige 1

Författarnas förord Tack till: Ann Albihn (Statens Veterinärmedicinska Anstalt), Hanna Hellström (Avfall Sverige), Anders Lagerkvist (Luleå tekniska universitet), Lars-Erik Olsson (AnoxKaldnes AB), Margareta Persson (Svenskt Gastekniskt Center AB) och Per-Erik Persson (Svensk Växtkraft AB) för värdefulla synpunkter och förslag; Tommy Wikström och Shoaib Azhar för all hjälp med experimentellt arbete; Susanne Widell, professor i växtfysiologi vid Lunds universitet, för råd om ljusmikroskopering av växtceller. Projektet E-PORATION samfinansierades av Avfall Sverige, AnoxKaldnes AB, Luleå tekniska universitet, Svensk Växtkraft AB och Kempestiftelserna. 2

Sammanfattning Lönsamheten vid avfallsrötning begränsas framförallt av lågt metanutbyte, långa uppehållstider och kostsam hygienisering. Målet med projektet E-PORATION var att testa elektriska pulsers förmåga att påskynda nedbrytningen och avdöda patogener. Den så kallade elektroporationen applicerades på bioavfall och E-coli. Effekten på metanbildningshastigheten och potentialen undersöktes med hjälp av BMP-försök (biokemisk metanbildningspotential). Reduktionen av halten E-coli uppmättes. Elektriska pulser ökade det suspenderade, organiska avfallets tillgänglighet för rötning. Metanbildningshastigheten och metanbildningspotentialen ökade med 28 respektive 52%. Behandlingens hygieniseringseffekt var otillräcklig vid den applicerade fältstyrkan (24 kv cm -1 ). 3

Innehållsförteckning Inledning... 5 Material och metoder... 5 Resultat... 7 Diskussion... 10 Slutsatser... 12 Referenser... 13 Bilaga I Analyser Bilaga II Experimentell design och statistik Bilaga III Modeller 4

1. Inledning 1.1. Bakgrund Anaerob nedbrytning (rötning) av samhällets organiska restprodukter kan bidra till att minska negativa miljöeffekter och sluta kretslopp. Biogasen som bildas är en värdefull förnybar energiresurs och rötresten innehåller viktiga näringsämnen som bör återföras till produktiv mark. Lönsamheten hos biogasanläggningar påverkas främst av uppehållstiden och substratets metanbildningspotential. Det är därför önskvärt att hitta metoder som kan bidra till att påskynda och öka nedbrytningen. Ett behov finns även av att utveckla effektiva hygieniseringsmetoder för att underlätta kretsloppet av näringsämnen. Mekanisk, kemisk eller termisk förbehandling är metoder som har använts för att bl.a. minska partikelstorleken och på så vis uppfylla ett eller flera av dessa behov. Metoderna är dock kostsamma och/eller effektiviteten är för låg. Elektroporation är en process som skapar tillfälliga eller permanenta porer i organismers cellmembran, framförallt utvecklad för användning inom medicin och livsmedelindustri. De elektriska pulsernas förmåga att frigöra lättillgängligt organiskt material samt att avdöda patogener gör elektroporation till en lovande förbehandlingsmetod för att åtgärda de ovan beskrivna problemen med avfallsrötning. 1.2. Mål Målet med projektet E-PORATION är att kvantifiera elektroporationens effekt som förbehandlingssteg till rötning med avseende på Nedbrytningshastighet Metanbildning Patogenavdödning 2. Material och metoder 2.1. Avfall I Västerås bedriver Svensk Växtkraft AB en biogasanläggning som producerar metan från källsorterat bioavfall blandat med förtorkade och hackade vallgrödor. Den 6 februari 2007 tog driftpersonalen prover av sönderdelat källsorterat bioavfall i två latrinhinkar av plast med en volym på 35 liter vardera. Detta material användes vid samtliga försök. 2.2. Elektroporation Elektroporation innebär att ett material (celler) utsätts för ett elektriskt fält under korta, upprepade pulser. Effekten blir att tillfälliga eller permanenta porer bildas i cellernas membran. 5

Energin som frigörs vid elektriska pulser beräknas enligt E = 0,5 C U 2 (Ekv. 1) C och U avser kapacitansen respektive laddningsspänningen. För den befintliga elektroporationsanläggningen (Figur 1) är C=84 nf och den elektriska potentialskillnaden är upp till U=40 kv. Vid en fältstyrka på t.ex. 24 kv cm -1 frigörs energi motsvarande 67 J per puls och batch. Anläggningen bedrevs satsvis i en 1-l polyetylenreaktor med ett elektrodavstånd på 10 cm. För varje batch behandlades 500 g avfall som blandades med 500 ml vatten. Efter fullgjord behandling separerades det fasta materialet från vattenfasen med hjälp av ett durkslag. Figur 1 Elektroporationsanläggning. 2.3. Biokemisk metanbildningspotential (BMP) Den biokemiska metanbildningspotentialen (BMP) hos det färska avfallet beräknades enligt Symons & Buswell (1933) i fem delprover. Hänsyn togs till avfallets totalhalt av kol, väte, syre, kväve och svavel. Hos de behandlade avfallsproverna bestämdes BMP även experimentellt (Barlaz et al. 1990, Chen et al. 1995, Ecke et al. 1998). Behandlat fastmaterial och motsvarande vätskefas tillsattes i glasflaskor till lika delar. Som ymp användes rötrest från biogasanläggningen vid NSR i Helsingborg. Till tre blank- 6

prover användes enbart slam för att kunna korrigera metanproduktionen för ympens bidrag. Alla flaskor förslöts med gummimembrankork. Hos behandlade avfallsprover mättes COD (kemisk syreförbrukning) och konduktivitet i omgivande vätska samt utfördes BMP-biogasmätningar under minst 14 veckors tid. Bildad biogas provtogs med hjälp av en kanyl i membranet. Vid varje provtagning bestämdes mängd bildad gas och metanhalt. Blankproverna analyserades dock bara en gång, vilket gjordes efter 14 veckor. De faktorer som studerades under försöket var elektroporationens frekvens, antal pulser och fältstyrka (Bilaga II). Avfallsprovernas nedbrytningshastighet beräknades utifrån den första BMP-biogasmätningen som utfördes efter två dygn. Avfallsprovernas metanbildningspotential beräknades efter 26 eller 27 dygn. 2.4. Mikroskopering Visuella undersökningar på cellmaterialet gjordes med ljusmikroskopering. Mikroskopering är inte möjlig på bioavfall på grund av dess heterogenitet. Försöket utfördes därför med olika infärgningar på behandlad respektive obehandlad sockerbeta, som är ett mer homogent material. 2.5. Patogenavdödning Elektroporationens patogenavdödningseffekt undersöktes genom att mäta halten av indikatororganismen E-coli i suspension före och efter behandling. Halten mättes i cfu (colonyforming units). 3. Resultat Avfallet karakteriserades och elektroporationens effekt (figur 2) kvantifierades med avseende på nedbrytningshastighet, metanbildning och patogenavdödning. Figur 2 Visualisering av elektroporationens effekt på ett äpple och en morot. Den behandlade delen till höger (äpple) respektive underst (morot). 7

3.1. Karakterisering Avfallets TS-halt bestämdes till 27 %. C/N-kvoten hos avfallet var 16,0±0,7. BMP enligt Symons & Buswell (1933) beräknades till 553±12 l (kg TS) -1 vid en metanhalt av 57±1 Vol.- % i biogasen. 3.2. Nedbrytningshastighet Av de 27 BMP-flaskorna exploderade 3 stycken, varav två efter 2 dygn och den tredje efter 18 dygn. Dessa värden saknades därmed för den statistiska utvärderingen. COD och konduktivitet i vattenfasen påverkades positivt av elektroporationens fältstyrka. Vid den maximala applicerade fältstyrkan (24 kv cm -1 ) ökade konduktiviteten med 27% ( =0,01, R 2 =0,83) och COD-halten med 17% ( =0,05, R 2 =0,59). Den fullständiga modellen redovisas i Bilaga III. Den initiala nedbrytningshastigheten, uttryckt som metanbildningshastighet, varierade som funktion av de elektriska pulsernas frekvens och antal (Figur 3). Elektroporation ökade avfallets initiala nedbrytningshastighet med 28% pga ökande pulsfrekvens och ökade antal pulser (=0,1, R2=0,26). Den fullständiga modellen redovisas i Bilaga III. Figur 3 Metanbildningshastighet som funktion av de elektriska pulsernas antal och frekvens. 8

3.3. Metanbildning I BMP-försöken ökade den kumulativa metanbildningen linjärt under nästan 4 veckor. Därefter minskade ökningen asymptotiskt. Den linjära metanbildningsfasen påverkades av både de elektriska pulsernas fältstyrka och frekvens (Figur 4). Avfallets totala metanbildning (avläst efter ~4 veckor) ökade med 52% till 338 (l (kg TS) -1 ) pga ökad pulsfrekvens och ökad fältstyrka ( =0,1, R 2 =0,26). Den fullständiga modellen redovisas i Bilaga III. Modellen som illustreras i Figur 4 baseras på värden som korrigerades för blankprover. Eftersom blankproverna analyserades efter 14 veckor och metanbildningen bestämdes efter mindre än 4 veckor, kan de absoluta värdena vara underskattade. Figur 4 Metanbildning som funktion av de elektriska pulsernas fältstyrka och frekvens. 3.4. Patogenavdödning Elektroporationens effekt på indikatororganismen E-coli i suspension påverkas av samtliga utvärderade faktorer. Inverkan från fältstyrka och antal pulser illustreras i Figur 5 ( =0,01, R 2 =0,59). Reduktionen som uppnås är lägre än faktor 2, mer än hälften av indikatororganismerna överlevde alltså behandlingen. Den fullständiga modellen redovisas i Bilaga III. 9

Figur 5 E-coli (cfu) som funktion av de elektriska pulsernas fältstyrka samt antalet pulser (frekvensen har lagts konstant till 7 Hz). 3.5. Ljusmikroskopering Försöken med ljusmikroskopering gav inga data som kunde utvärderas. 4. Diskussion Biogas består främst av koldioxid och metan. Andelen av andra gaser är vanligtvis försumbar, vilket är en förutsättning för att tillförlitligt bestämma biogasens metanhalt med hjälp av sackarometermetoden (Bilaga II). Framförallt de i lut icke eller svaglösliga gaserna som t.ex. vät-, syr- och kvävgas kan öka analysfelet mot överskattade metanhalter. Om analysfelet skall minskas är gaskromatografi en lämplig, dock dyrare, metod. Den observerade C/N-kvoten hos avfallet (16,0±0,7) var lämplig för rötning. En viss risk för ammoniuminhibering kan dock finnas vid kontinuerlig drift, eftersom C/N<20 (Weiland 1993). Den centrala idén bakom projektet E-PORATION var att lysera celler med hjälp av elektriska pulser; dels för att döda patogena bakterier och dels för att göra avfallets cellmaterial lättillgängligt för anaerob nedbrytning. 10

Det var påtagligt att elektriska pulser öppnade avfallets cellmaterial. Pulsernas fältstyrka ökade både konduktivitet och COD i avfallssuspensionens vätskefas. De framtagna modellerna visar en hög statistisk säkerhet med 99% konfidens för konduktivitet och 95% konfidens för COD. Modellernas förklaringsgrad på 83% respektive 59% indikerar att det även fanns andra faktorer som inverkade på cellöppningen. Dessa kunde dock inte identifieras, vilket kan bero på en för hög datavariabilitet. I detta sammanhang anses avfallets heterogenitet som en viktig felkälla. Fältstyrkan varierades från 12 till 24 kv cm -1, vilket ledde till en ökning i konduktivitet och COD motsvarade 27% respektive 17%. Detta i sin tur underlättade för de anaeroba mikroorganismerna att bryta ner substratet, vilket påskyndade den initiala metanbildningshastigheten i BMP-flaskorna från 28 till 37 l metan per kg TS och dygn. Vid fullständig anaerob nedbrytning är den enligt Symons & Buswell (1933) beräknade metanbildningspotentialen 553±12 l (kg TS) -1, vilket kan jämföras med metanbildningen i BMP-försöken som varierade mellan 222 och 338 l (kg TS) -1 (Bilaga III, Figur 4). Eftersom metanbildningen avser den linjära delen av BMP-kurvan, uppskattades att ~40 vikt-% av avfallet bestod av lättnedbrytbart material. Med hjälp av elektriska pulser kunde denna andel ökas med ~52%, vilket indikerar att elektroporation ökade cellmaterialets tillgänglighet för anaerob nedbrytning. Olika responsvariabler påverkades av olika faktorer (Tabell 1). Detta observerades även för responsvariabler som gäller för samma material, dvs avfall (konduktivitet, COD, metanbildningshastighet och metanbildning). Förklaringen beror troligen på den höga heterogeniteten hos avfallet och slumpmässiga felkällor i t.ex. gasanalysen (se ovan). Den resulterande datavariabiliteten maskerar möjligtvis en eller två faktorers statistiskt signifikanta inverkan. Detta gäller i synnerhet om determinationskoefficienten (R 2 ) är låg, som för metanbildningshastigheten och metanbildningen. Tabell 1 Kvalitativ faktorinverkan på responsvariablerna: (0) ingen signifikant inverkan, (+) positiv signifikant inverkan. Faktor Responsvariabel Frekvens Pulser Fältstyrka Konduktivitet 0 0 + 0,83 2 COD 0 0 + 0,59 3 Metanbildningshastighet + + 0 0,26 4 Metanbildning + 0 + 0,26 5 R 2 Ekvation Maximalt användes 500 J (kg TS) -1 per puls, dvs 250 kj (kg TS) -1 vid 500 pulser motsvarande <7 l metan per kg TS. Det kan jämföras med en metanbildning som med hjälp av elektroporation ökade från 222 till 338 l per kg TS. Elektroporationens energikonsumtion motsvarade <6% av energivinsten. E-coli har använts som en indikator för förekomst av sjukdomsframkallande bakterier (SP 2004). Den av elektroporationen åstadkomna reduktionen är dock alldeles för låg (<faktor 2). Den för applikationen önskade hygieniseringseffekten skall motsvara flera tiopotenser cfu. Gränsvärdet för antalet E-coli 11

är 10 cfu g -1 (SP 2004). Troligtvis krävs en högre fältstyrka, eventuellt i kombination med andra stressfaktorer (exempelvis värme), för att uppnå önskad reduktion av patogener. Det visade sig omöjligt att se effekten av elektroporation på enskilda celler med ljusmikroskop, då de undersökta bitarna är uppbyggda av flera lager celler. Inledande försök med epitelceller från lök (ett enda cellager) gjordes och här finns potential för fortsatta försök där en indikatorfärg används för att påvisa ph-förändringen som uppstår i cellernas vacuoler då membranet poreras. Efter konsultation med en växtfysiolog (Widell 2007) beslutades dock att konduktivitetsanalys av omgivande vätska är den mest tillförlitliga metoden för att påvisa att celler har porerats (lyserat). Effekten syns också tydligt redan utan mikroskop (Figur 2). Cellsaft rinner ut, strukturen förändras och mjukas upp. Resultaten visar att elektroporation bär stor potential för att effektivisera rötning av avfall. Med hjälp av elektriska pulser ökades både nedbrytningshastigheten och metanbildningen, vilket leder till såväl kortare uppehållstid i rötkammaren som högre metanutbyte. Resultaten från BMP-försöken kan dock inte användas för att kvantifiera elektroporationens gynnsamma effekt på rötning i fullskala. Detta beror framförallt på att försöken bedrevs satsvis, till skillnad från fullskaleanläggningar som bedrivs kontinuerligt. Dessutom måste uppskalningseffekter beaktas. 5. Slutsatser Elektriska pulser ökade det suspenderade, organiska avfallets tillgänglighet för anaerob nedbrytning. Pga högre elektrisk fältstyrka visade den behandlade suspensionen såväl 27% högre konduktivitet som 17% högre halt COD (kemisk syreförbrukning). Elektroporation ökade avfallets initiala nedbrytningshastighet med 28% pga ökande pulsfrekvens och ökade antal pulser. Elektroporation ökade avfallets totala metanbildning (efter ~4 veckor) med 52% till 338 (l (kg TS) -1 ) pga ökade pulsfrekvens och ökade fältstyrka. Elektriska pulser vid en fältstyrka upp till 24 kv cm -1 hade ingen tillräcklig hygieniseringseffekt med avseende på indikatororganismen E-coli. Tester vid högre fältstyrkor rekommenderas. Inverkan av de studerade faktorerna (1) frekvens, (2) antal pulser och (3) fältstyrka på responsvariablerna ovan var inte likartad, vilket troligen berodde på ett flertal felkällor men främst avfallets heterogenitet som ökade datavariabiliteten. Den senare skulle minskas avsevärt vid kontinuerliga rötningsförsök i totalomblandade reaktorer. 12

6. Referenser Barlaz, M. A., Ham, R. K. & Schaefer, D. M. (1990) Methane production from municipal refuse: A review of enhancement techniques and microbial dynamics. Critical Reviews in Environmental Control 19(6) 557-84. Chen, H., Ecke, H., Kylefors, K., Bergman, A. & Lagerkvist, A. (1995) Biochemical methane potential (BMP) assays of solid waste samples. Proceedings from: Fifth International Landfill Symposium, CISA, Environmental Sanitary Engineering Centre, Cagliari, Italy, S. Margherita di Pula, Cagliari, Italy, 613-27. Ecke, H., Bergman, A. & Lagerkvist, A. (1998) Multivariate data analysis (MVDA) in landfill research. The Journal of Solid Waste Technology and Management 25(1) 33-9. SIS (1981) Vattenundersökningar - Bestämning av torrsubstans och glödningsrest i vatten, slam och sediment. Swedish Institute for Standards. Stockholm, Sweden, SIS - Standardiseringskommissionen i Sverige, Svensk Standard. (SS 02 81 13) SP (2004) Certifieringsregler för biogödsel. SPCR 120. SP Swedish National Testing and Research Institute. Symons, G. E. & Buswell, A. M. (1933) The methane fermentation of carbohydrates. J. Am. Chem. Soc. 55(5) 2028-36. Weiland, P. (1993) One- and two-step anaerobic digestion of solid agroindustrial residues. Water Science and Technology 27(2) 145-51. Widell, S. (2007) personlig kontakt; Department of Cell and Organism Biology, Lund University. 13

Bilaga I - Analyser Torrsubstanshalt (TS) bestämdes enligt Svensk standard (SIS 1981). Konduktivitet analyserades med elektrod WTW TetraCon 325. Koldioxidhalt i biogas bestämdes med 1 M NaOH i sackarometer. Kemisk syreförbrukning (COD) bestämdes med fotometriskt snabbtest Spectroquant NOVA 60 från Merck. Före analys separerades partiklar genom centrifugering följd av filtrering. Centrifugering genomfördes i en Eppendorf Centriguge 5804 vid ett varvtal på 5000 min -1 under 10 min och en inbromsningstid på 10 min. För filtrering användes 0,45-μm-sprutfilter. Elementanalyser utfördes av Belab AB i Norrköping enligt Leco-metoden. Levande celltalsberäkningar på E-coli utfördes på agarplattor enligt Viable Count. Visuella undersökningar på cellmaterialet gjordes med ljusmikroskopering Nikon Diaphot 300. 14

Bilaga II - Experimentell design och statistik Faktorer som studerades i triplikat på två nivåer samt medelpunkt (3 23+3=27) var elektroporationens frekvens, antal pulser och fältstyrka (tabell 1). Hos 27 behandlade avfallsprover mättes COD och konduktivitet i omgivande vätska samt utfördes BMP-biogasmätningar under minst 14 veckors tid. Samma experimentella design samt faktornivåer (tabell 1) användes för att undersöka elektroporationens effekt på halt E-coli i suspension. Elektriska pulsers effekt på E-coli undersöktes på en suspension med ~10 9 cfu ml -1 (cfu: colony-forming units). Tabell 1 Faktorer och dess nivåer vid elektroporation. Nivå Faktor Enhet Låg Medel Hög Frekvens Hz 1,5 7,0 12,5 Antal pulser 2 250 500 Fältstyrka kv cm -1 12 18 24 För utvärdering av de designade försöken användes multipel linjär regression vid signifikansnivå på =0,01, =0,05 eller =0,1. 15

Bilaga III - Modeller Ekvation för konduktivitet i vattenfas ( =0,01, R 2 =0,83): Konduktivitet [ms cm-1] = 4,27 + 0,088 Fältstyrka [kv cm -1 ] Ekvation för COD i vattenfas ( =0,05, R 2 =0,59): COD [g l-1] = 24,2 + 0,29 Fältstyrka [kv cm -1 ] Ekvation för den initiala nedbrytningshastigheten ( =0,1, R 2 =0,26): Metanbildningshastighet [l (kg TS dygn)-1] = 26,9 + 0,394 Frekvens [Hz] + 0,00985 Pulser [-] Ekvation för den ackumulerade metanbildningen ( =0,1, R 2 =0,26): Metanbildning [l (kg TS)-1] = 164 + 6,07 Frekvens [Hz] + 4,09 Fältstyrka [kv cm -1 ] Ekvation för patogenavdödning ( =0,01, R 2 =0,59): E-coli [cfu] = 53 0,71 Frekvens [Hz] + 0,021 Pulser [-] + 0,43 Fältstyrka [kv cm -1 ] + 0,0042 Frekvens [Hz] Pulser [-] 0,0037 Pulser [-] Fältstyrka [kv cm -1 ] 16

Rapporter från Avfall sverige 2007 2007:01 Uppdaterade bedömningsgrunder för förorenade massor 2007:02 Frivilligt åtagande - inventering av utsläpp från biogas- och uppgraderingsanläggningar 2007:03 Nedbrytning av organiska föreningar i rökgasreningsprodukter vid avfallsförbränning 2007:04 Hantering av förpackat livsmedelsavfall 2007:05 Insamling och behandling av hushållsavfall Former och utförande samt ekonomiska effekter på avfallsavgifterna 2007:06 Uppföljning: Kontroll av tätskiktskonstruktionen på Dragmossens deponi 2007:07 Mall för renhållningsordning. Föreskrifter för avfallshantering. 2007:08 Metod för riskinventering/analys i det systematiska arbetsmiljöarbetet 2007:09 Insamlingssystem för matavfall från restauranger, storkök och butiker 2007:10 Utvärdering av svensk avfallspolitik i ett systemperspektiv 2007:11 Metalliskt aluminium i förbränningen 2007:12 Sluttäckning av avfallsupplag Alternativa metoder att uppnå gällande krav avseende infiltration 2007:13 Utvärdering av certifieringssystemen för biogödsel och kompost, SPCR 120 och SPCR 152 2007:14 Elektroporation. Test av ny teknik för ökad metanbildning och hygienisering vid rötning

Avfall Sverige Utveckling 2007:14 ISSN 1103-4092 Avfall Sverige AB Adress Telefon Fax E-post Hemsida Prostgatan 2, 211 25 Malmö 040-35 66 00 040-35 66 26 info@avfallsverige.se www.avfallsverige.se