Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 96 För kvalitativ detektering av humant papillomvirus (HPV) av typ 16, 18 och 45. För användning med digene High-Risk HPV DNA Test. 613615 QIAGEN 19300 Germantown Road Germantown, MD 20874 USA www.qiagen.com QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 40724 Hilden TYSKLAND 1058098SV Rev. 02 Sample & Assay Technologies

Innehåll Avsedd användning 6 Sammanfattning och förklaring 6 Princip för proceduren 7 Denaturering 7 Hybridisering 7 Hybridinfångning 7 Hybriddetektion 7 Tvätt 8 Signalamplifiering 8 Material som medföljer 10 Kitinnehåll 10 Material som behövs men inte medföljer 11 Utrustning och material som kan beställas från QIAGEN 11 Ytterligare utrustning och material för PreservCyt-provberedning 12 Varningar och försiktighet 13 Varningar 13 Försiktighetsåtgärder 16 Förvaring och hantering av reagens 18 Kitkomponenter 18 Beredda reagenser 18 Provinsamling och -beredning 18 Cervixprover i STM 19 Cervixprover i PreservCyt-lösning 19 Procedur 20 Reagensberedning 22 Provberedning 27 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 3

Protokoll 1: Denaturering 28 Protokoll 2: Tillsats av probblandning 30 Protokoll 3: Hybridisering och hybridinfångning 33 Protokoll 4: Hybriddetektion 35 Protokoll 5: Tvätt 37 Protokoll 6: Signalamplifiering 40 Protokoll 7: Mäta infångningsmikroplattan och framställa resultat 41 Tolkning av resultat 42 Resultat av testning 42 Felsökningshandbok 42 Kvalitetskontroll 52 Analyskalibreringsverifiering 52 Probspecifika kvalitetskontroller 55 Begränsningar 55 Prestandaegenskaper 56 Överensstämmelse mellan digene HPV Genotyping PS Test och ett validerat kvantitativt PCR-test för HPV-genotypning 56 Analytisk specificitet 58 Reproducerbarhet 58 Utvinning av DNA för STM- och PreservCyt-prover 60 Korsreaktivitet 60 Effekt av blod och andra substanser på STM-prover 62 Effekt av blod och andra substanser på PreservCyt-prover 62 Litteraturhänvisningar 62 Citerade litteraturhänvisningar 63 Symboler 64 Kontaktinformation 65 4 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

Bilaga A: Procedurer för kontaminationsutvärdering 66 Detektionsreagens 2 66 Tvättanordning och/eller vattenkälla 66 Automated Plate Washer 67 Bilaga B: Arbetsblad för registrering av testdata 69 Beställningsinformation 70 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 5

Avsedd användning digene HPV Genotyping PS Test är ett reflextest som är avsett för kvalitativ detektion av högrisk-hpv-typ 16, 18 och 45 efter ett positivt resultat i digene HC2 High-Risk HPV DNA Test (kvalitativ detektion av 13 högrisktyper). Identifieringen av högrisk-hpv-typ 16, 18 och 45 ger ytterligare information som underlättar den kliniska vården av kvinnor i screeningprogram för cervixcancer. Cervixprover som kan testas med digene HPV Genotyping PS Test innefattar följande: Prover som tagits med digene HC2 DNA Collection Device Prover som tagits med en provtagningsanordning av borsttyp eller kombinerad borste/spatel, och sedan placerats i PreservCyt -lösning Sammanfattning och förklaring Förekomsten av vissa HPV-typer i kvinnans slida är associerad med ett flertal sjukdomar, inklusive kondylom, Bowenoid papulos samt cervikal, vaginal och vulvär intraepitelial neoplasi och karcinom (1 3). Det är allmänt accepterat att dessa virus företrädesvis överförs sexuellt och att högrisk-hpv-typerna är den största identifierade riskfaktorn för utveckling av cervikal cancer (4 8). Humana papillomvirus består av en ikosahedral viruspartikel (virion) som innehåller en dubbelsträngad, ringformig DNA-molekyl med 8 000 baspar, omgiven av en proteinkapsid. Efter infektion av epitelceller etableras virus-dna i hela epitelet, men intakta virioner återfinns endast i de övre vävnadsskikten. Därför kan virus-dna hittas antingen i virioner eller som episomala eller integrerade HPV-sekvenser, beroende på lesionstyp och -grad. Indirekt evidens för anogenital HPV-infektion kan erhållas via kroppsundersökning och genom förekomsten av karakteristiska cellförändringar som associeras med virusreplikation i vaginalutstryks- eller biopsiprover. Alternativt kan biopsier analyseras med nukleinsyrahybridisering för att direkt detektera förekomsten av HPV-DNA. Kvinnor med normal cytologi som samtidigt testas positiva för HPV 16 eller 18 har en beräknad sannolikhet på 26,7 % respektive 19,1 % för att utveckla 6 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) 3 eller värre inom 12 års uppföljning (9). Dessutom var HPV-typ 16, 18 och 45 de 3 vanligaste genotyperna som återfanns vid skivepitelcellscancer, adenokarcinom och adeno/skivepitelcellscancer. De 3 HPV-typerna tillsammans stod för 75 % av fallen av skivepitelcellscancer och 94 % av fallen av adenokarcinom (10). Det har även visats att tumörer som innehåller HPV 18 eller 45 har en mer än 2 gånger så stor sannolikhet att orsaka dödsfall än tumörer som innehåller andra HPV-typer (11). Princip för proceduren digene HPV Genotyping PS Test, med användning av tekniken Hybrid Capture 2 (HC2), är en in vitro-nukleinsyraanalys som använder typspecifika oligoribonukleotider, antikroppsinfångning och kvalitativ kemiluminescent signaldetektion. Testet, som utförs i triplikat för varje cervixprov, gör en genotypning av 3 högrisktyper (16, 18 och 45) av HPV-DNA i cervixprover. Denaturering Cervixprover behandlas med en baslösning, vilken upplöser viruset och frisätter mål-dna:t. Hybridisering Mål-HPV-DNA:t hybridiseras med specifika RNA-prober och skapar DNA-RNAhybrider. Hybridinfångning Antikroppar, specifika för DNA-RNA-hybriderna och belagda på ytan av en mikroplattbrunn, fångar in DNA-RNA-hybriderna. Hybriddetektion Med tillsatsen av detektionsreagens 1 (DR1) reagerar de immobiliserade DNA- RNA-hybriderna med alkaliskt fosfatas-konjugerade antikroppar som är specifika för DNA-RNA-hybriderna. Flera alkaliskt fosfatas-molekyler konjugeras Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 7

till varje antikropp och multipla antikroppar binds till varje immobiliserad DNA- RNA-hybrid, vilket leder till en avsevärd signalamplifiering. Tvätt DNA-RNA-hybridkomplexet tvättas för att obundet material ska avlägsnas. Signalamplifiering Med tillsatsen av detektionsreagens 2 (DR2) sker en kemiluminescerande reaktion då substratet klyvs av bundet alkaliskt fosfatas. Ljuset som avges mäts som RLU (relative light units) på ett DML-instrument. Intensiteten i ljuset som avges betecknar förekomsten av mål-dna i provet. 8 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

Arbetsflöde vid hybridinfångning Denaturering Hybridisering RNA-prob Ensträngat DNA DNA-RNA-hybrid Hybridinfångning Hybriddetektion Tvätt Signalamplifiering Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 9

Material som medföljer Kitinnehåll digene HPV Genotyping PS Test (96) Katalognr 613615 Antal tester* 96 HPV Negative Control 1 (HPV-negativ kontroll 1) HPV Positive Control 1 (HPV-positiv kontroll 1) HPV Negative Control 2 (HPV-negativ kontroll 2) HPV Positive Control 2 (HPV-positiv kontroll 2) Denaturation Reagent (Denatureringsreagens) Indicator Dye (Indikatorfärg) Probe Diluent (Probspädningsvätska) Detection Reagent 1 (Detektionsreagens 1) Detection Reagent 2 (Detektionsreagens 2) Wash Buffer x15 (Tvättbuffert x 15) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 12 ml 0,35 ml 5,5 ml 12 ml 12 ml 2 x 100 ml HPV 16 Probe ASR (HPV 16-prob ASR) 110 µl HPV 18 Probe ASR (HPV 18-prob ASR) 100 µl * Antalet testresultat varierar beroende på antalet användningar per kit eftersom det krävs kontroller för varje utförande av testet. Även antalet tillåtna omgångar av infrysning/upptining av de denaturerade kontrollerna kan vara en faktor när det gäller antalet användningar per kit. Se Valfri stoppunkt, sida 29, om du vill ha mer information. 10 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

HPV 45 Probe ASR (HPV 45-prob ASR) 100 µl 5,5 % NP-40 2 x 1,5 ml Capture Microplate (Infångningsmikroplatta) 1 Material som behövs men inte medföljer Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Om du vill ha mer information hänvisas till tillämpliga säkerhetsdatablad (SDS) som kan erhållas från produktleverantören. Utrustning och material som kan beställas från QIAGEN digene Hybrid Capture 2 System ( digene HC2 System ), bestående av en QIAGEN-godkänd luminometer ( DML-instrument ), en QIAGEN-godkänd persondator med tillbehör (bildskärm, tangentbord, mus, skrivare och skrivarkabel), digene HC2 System Software ( digene assay analysis software ), LumiCheck Plate-programvara och användarhandbok till digene HC2 System Software User Manual (Användarhandbok till HC2 Systemprogramvaran) Hybrid Capture System Rotary Shaker I Hybrid Capture System Automated Plate Washer Hybrid Capture System Multi-Specimen Tube (MST) Vortexer 2 (tillval) Mikroplattor för hybridisering Lock till mikroplattor Extralånga pipettspetsar Reagensbehållare för engångsbruk DuraSeal TM rörförseglingsfilm Plattförseglare Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 11

Utrustning och tillbehör för allmän laboratorieanvändning Inkubatorskakapparat som kan upprätthålla en temperatur på 55 ± 2 ºC och skakning vid 1 100 ± 100 rpm (varv per minut) Mikrocentrifug Vortexblandare med bägarfastsättning Enkanalspipett; olika storlekar för volymer om 20 200 µl och 200 1 000 µl Repeterande volymetriska pipetter, t.ex. Eppendorf Repeater -pipett 8-kanalspipett (med flera kanaler); olika storlekar för volymer på 25 200 µl Timer 0,5 % v/v natriumhypokloritlösning Parafilm eller motsvarande Pipettspetsar för engångsbruk med aerosolbarriär för enkanalspipett (volymer på 20 200 µl och 200 1 000 µl) Engångsspetsar för repeterande volymetrisk pipett (12,5; 5; 2,5 och 1,25 ml) Engångsspetsar för 8-kanalspipett (25 200 µl) KimTowels -torkar eller motsvarande luddfria pappershanddukar Sprittorkar Bänkskydd för engångsbruk Puderfria engångshandskar Polypropylenrör på 1,5 ml och/eller 5 ml med rund botten Flytande ställ för mikrocentrifugrör Ytterligare utrustning och material för PreservCyt-provberedning Se bruksanvisningen till digene HC2 Sample Conversion-kit. 12 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

Varningar och försiktighet För in vitro-diagnostisk användning. Varningar Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Se lämpligt säkerhetsdatablad (SDS) för mer information. Dessa är tillgängliga online i praktiskt och kompakt PDF-format på www.qiagen.com/safety där du kan hitta, granska och skriva ut datablad för alla kit och kitkomponenter från QIAGEN. Prover VARNING! Prover kan innehålla infektiösa agens och ska hanteras i enlighet härmed. Betrakta alla prover som potentiellt smittsamma. Ingen känd testmetod kan erbjuda en fullständig försäkran om att prover inte överför smitta. Vi rekommenderar att humana prover behandlas i enlighet med relevant nationell och lokal praxis för biosäkerhet. Använd denna biosäkerhetspraxis i samband med material som innehåller eller misstänks innehålla smittämnen. I dessa säkerhetsåtgärder ingår bland annat: Pipettera inte med munnen. Undvik att röka, äta och dricka i områden där reagenser eller prover hanteras. Använd puderfria engångshandskar medan du hanterar reagenser eller prover. Tvätta händerna noga när testet har utförts. Rengör och desinficera allt spill från prover med användning av ett tuberkulocidalt desinfektionsmedel, t.ex. 0,5 % v/v natriumhypoklorit, eller ett annat lämpligt desinfektionsmedel (12, 13). Dekontaminera och kassera alla prover, reagenser och andra eventuellt kontaminerade material i enlighet med lokala och nationella föreskrifter. Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 13

Efter denaturering och inkubation betraktas proverna inte längre som smittsamma (14); laboratoriepersonal ska dock fortfarande följa nationella och lokala säkerhetsföreskrifter. Natriumazid Vissa reagenser innehåller natriumazid. Natriumazid har rapporterats bilda blyeller kopparazid i avloppsrör i laboratorier. Dessa azider kan explodera vid stötar, t.ex. hamrande. För att förhindra att det bildas bly- eller kopparazid ska avloppsrören spolas noga med vatten efter kassering av lösningar som innehåller natriumazid. För att avlägsna kontamination från gamla avloppsrör där man misstänker att det har ansamlats azider, rekommenderar U.S. Occupational Safety and Health Administration följande: 1. Avlägsna vätska från vattenlåset med en hävert i form av en gummi- eller plastslang. 2. Fyll med 10 % v/v natriumhypokloritlösning. 3. Låt stå i 16 timmar. 4. Spola noga med vatten. 14 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

Skydds- och riskfraser för komponenter Följande risk- och skyddsfraser gäller för komponenter i kitet med digene HPV Genotyping PS Test: 5.5% NP-40 Innehåller: Ethoxylated nonylphenol. Varning! Orsakar lätt hudirritation. Skadliga långtidseffekter för vattenlevande organismer. Undvik utsläpp till miljön. Innehållet/ behållaren lämnas till en godkänd avfallsanläggning. Denaturation Reagent Innehåller: sodium hydroxide. Fara! Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. Kan vara korrosivt för metaller. Innehållet/ behållaren lämnas till en godkänd avfallsanläggning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten/ duscha. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare. Förvaras inlåst. Använd skyddshandskar/ skyddskläder/ ögonskydd/ ansiktsskydd. Detection Reagent 1 Skadliga långtidseffekter för vattenlevande organismer. Undvik utsläpp till miljön. HPV Negative Control 1 Varning! Orsakar lätt hudirritation. Vid hudirritation: Sök läkarhjälp. HPV Positive Control 1 Varning! Orsakar lätt hudirritation. Vid hudirritation: Sök läkarhjälp. HPV Positive Control 2 Varning! Orsakar lätt hudirritation. Vid hudirritation: Sök läkarhjälp. HPV Negative Control 2 Varning! Orsakar lätt hudirritation. Vid hudirritation: Sök läkarhjälp. Probe Diluent Innehåller: acetic acid; Polyacrylic acid. Fara! Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. Innehållet/ behållaren lämnas till en godkänd avfallsanläggning. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 15

försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten/ duscha. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare. Förvaras inlåst. Använd skyddshandskar/ skyddskläder/ ögonskydd/ ansiktsskydd. Wash Buffer, 15x Innehåller: Sodium azide. Varning! Skadligt vid förtäring. Orsakar lätt hudirritation. Skadliga långtidseffekter för vattenlevande organismer. Undvik utsläpp till miljön. Innehållet/ behållaren lämnas till en godkänd avfallsanläggning. Vid hudirritation: Sök läkarhjälp. VID FÖRTÄRING: Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare. Använd skyddshandskar/ skyddskläder/ ögonskydd/ ansiktsskydd. Ytterligare information Säkerhetsdatablad: www.qiagen.com/safety Försiktighetsåtgärder Användaren måste alltid vidta följande försiktighetsåtgärder vid utförandet av digene HPV Genotyping PS Test: Använd inte reagenserna efter utgångsdatumet som anges bredvid symbolen på etiketten utanpå kartongen eller utgångsdatumet för de beredda reagenserna. Om testet utförs utanför angivna tids- och temperaturintervall kan det leda till ogiltiga resultat. Tester som inte hamnar inom de fastställda tids- och temperaturintervallen är ogiltiga och måste göras om. Proceduren, analyskalibreringen, kvalitetskontrollen och tolkningen av resultaten för digene HPV Genotyping PS Test måste följas noga för att man ska få fram pålitliga testresultat. Det är viktigt att pipettera exakt den reagensvolym som anges och att blanda väl efter varje reagenstillsats. Om detta inte följs kan det leda till felaktiga testresultat. Om man kontrollerar att de angivna färgförändringarna har skett bekräftas att dessa villkor har uppfyllts. 16 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

Kitkomponenterna har testats som en enhet. Byt inte ut dem mot komponenter från andra källor eller andra loter. Nukleinsyror är mycket känsliga för miljömässig nukleasnedbrytning. Nukleaser finns på människans hud och på ytor eller material som hanteras av människor. Rengör och täck över arbetsytor med ett bänkskydd för engångsbruk och använd puderfria engångshandskar medan teststegen utförs. Cervixprover kan innehålla blod eller andra biologiska material som kan dölja färgförändringarna av proven. Prover med en mörk färg ger eventuellt inte den beskrivna färgförändringen. I dessa fall påverkar avsaknad av färgförändring inte analysresultaten. Bekräfta korrekt blandning genom att observera kontrollernas färgförändring. Se till att kontamination av infångningsmikroplattan och DR2 med exogent alkaliskt fosfatas förhindras under utförandet av testet. Substanser som kan innehålla alkaliskt fosfatas är t.ex. DR1, bakterier, saliv, hår och fett från huden. Det är särskilt viktigt att täcka över infångningsmikroplattan efter tvättsteget och under DR2-inkubationen eftersom exogent alkaliskt fosfatas kan reagera med DR2, vilket ger falska positiva resultat. Skydda DR2 från långvarig exponering för direkt ljus. Använd DR2 omedelbart efter alikvotering och undvik direkt solljus. Prima den repeterande volymetriska pipetten innan reagens tillsätts och kontrollera regelbundet att det inte finns några stora luftbubblor. Alltför stora mängder av stora luftbubblor i pipettspetsen kan göra att tillförseln blir mindre noggrann. Detta kan undvikas genom att du fyller pipetten, dispenserar all vätska och fyller den på nytt. Se användarhandboken till pipetten när det gäller specifika bruksanvisningar. Utför pipettering med flera kanaler med användning av den omvända pipetteringstekniken (se Protokoll 4: Hybriddetektion, sida 35) för dispensering av DR1 och DR2. Kontrollera alla pipettspetsar på pipetten med flera kanaler avseende korrekt passning och fyllning. Kontrollera att alla brunnar på infångningsmikroplattan är noga rengjorda (se Protokoll 5: Tvätt, sida 37). Otillräcklig rengöring leder till ökad bakgrund och kan ge falska positiva resultat. Rester av tvättbuffert i Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 17

brunnarna på infångningsmikroplattan kan leda till reducerad signal eller dålig reproducerbarhet. Förvaring och hantering av reagens Kitkomponenter Efter mottagandet ska kitet förvaras vid 2 8 ºC. Tvättbuffert x 15, denatureringsreagens och indikatorfärg kan förvaras vid rumstemperatur (15 30 ºC), om så önskas. Alla reagenser tillhandahålls bruksfärdiga, utom denatureringsreagenset (DNR), probblandningarna och tvättbufferten. Beredda reagenser I beredd form är DNR stabilt i 3 månader vid 2 8 ºC. I beredd form är tvättbufferten stabil i 3 månader vid 2 30 ºC. Provinsamling och -beredning Samla in och transportera cervixprover som ska testas med digene HPV Genotyping PS Test med användning av en av följande provtagningsanordningar: digene HC2 DNA Collection Device [består av en cervixborste och provtransportmedium (Sample Transport Medium, STM)] En provtagningsanordning av borsttyp eller kombinerad borste/spatel placerad i PreservCyt-lösning Prover som har tagits med andra provtagningsanordningar eller har transporterats i andra transportmedium har inte validerats för användning med det här testet. Prestandaegenskaperna för detta test har endast fastställts med de angivna provtagningsanordningarna. Se bruksanvisningarna till digene HC2 DNA Collection Device när det gäller ytterligare procedurer för provtagning och hantering. 18 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

Cervixprover i STM Cervixprover som har samlats in i STM behöver inte beredas före testning med digene HPV Genotyping PS Test. Eftersom digene HPV Genotyping PS Test är ett reflextest för digene HC2 High- Risk HPV DNA Test, är STM-prover redan denaturerade och är klara att gå vidare till Protokoll 2: Tillsats av probblandning för testet. Minst 225 µl av varje denaturerat STM-prov måste vara tillgängligt för att digene HPV Genotyping PS Test ska kunna utföras. Cervixprover i PreservCyt-lösning PreservCyt-prover kräver provberedning innan de testas med digene HPV Genotyping PS Test. Utför provtagning på sedvanligt sätt och bered objektglas för ThinPrep -Paptestet enligt tillverkarens anvisningar. Efter provtagning kan PreservCyt-prover sparas i upp till 3 månader vid 2 30 ºC före provberedning för digene HPV Genotyping PS Test. PreservCyt-prover kan inte frysas. Resultatet av provberedning med användning av digene HC2 Sample Conversion kit är ett denaturerat prov som är klart att gå vidare till Protokoll 2: Tillsats av probblandning i testet. Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 19

Procedur Saker som ska utföras före start Låt det ta minst 60 minuter för inkubatorskakapparaten att uppnå 55 C ± 2 ºC från en kallstart. Om uppvärmningsperioden inte får ta denna tid kan testresultaten bli felaktiga. Kontrollera att vattenbadet är 65 ºC och att vattennivån är tillräcklig för att täcka hela vätskevolymen i rören. Skriv ut ett nytt Test Data Recording Worksheet (Arbetsblad för registrering av testdata) och registrera följande information (se Bilaga B: Arbetsblad för registrering av testdata, sida 69): Testplats Testdatum Användar-ID Omgivningstemperatur Lotnummer för kitet med digene HPV Genotyping PS Test Kontroller och prover körs på en mikroplatta med en konfiguration med 8- brunnskolonn. Fyll i arbetsbladet för registrering av testdata genom att registrera ID-numren för alla erforderliga kontroller och prover i mikroplattans brunnar. För varje test måste kontrollerna testas i följande positioner på mikroplattan (se figur 1 nedan): Negativ kontroll 1 (NC1)-replikat i mikroplattans brunnar A1, B1 och C1 Positiv kontroll 1 (PC1)-replikat i mikroplattans brunnar D1, E1 och F1 Negativ kontroll 2 (NC2) med probblandning 16 i mikroplattans brunn G1 NC2 med probblandning 18 i mikroplattans brunn H1 NC2 med probblandning 45 i mikroplattans brunn A2 Positiv kontroll 2 (PC2) med probblandning 16 i mikroplattans brunn B2 20 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

PC2 med probblandning 18 i mikroplattans brunn C2 PC2 med probblandning 45 i mikroplattans brunn D2 Prov Figur 1. Position för kontroller och prover på mikroplatta. Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 21

Reagensberedning Viktiga saker att tänka på innan du startar Bered PreservCyt-prover innan du låter några tidigare denaturerade prover och reagenser utjämnas till rumstemperatur. Ta ut proverna och alla erforderliga reagenser från förvaringsplatsen innan testningen inleds. Låt dem uppnå 20 25 ºC i 15 30 minuter. Kassera alla beredda reagenser (såvida inget annat angetts) och reagensalikvoter när testet är klart. Använd Tabell 1 nedan för att bestämma vilken volym som behövs för varje reagens baserat på antalet tester. Tabell 1. Erforderliga volymer av beredda och bruksfärdiga reagenser Antal HPV 16- HPV 18- HPV 45- tester/ probbland- probbland- probbland- strips* ning ning ning Tvättbuffert DR1 DR2 4/5 0,77 ml 0,56 ml 0,56 ml >1 liter 2,55 ml 2,55 ml 8/5 0,91 ml 0,70 ml 0,70 ml >1 liter 3,45 ml 3,45 ml 12/8 1,05 ml 0,84 ml 0,84 ml >1 liter 4,35 ml 4,35 ml 16/8 1,19 ml 0,98 ml 0,98 ml >1 liter 5,25 ml 5,25 ml 20/11 1,33 ml 1,12 ml 1,12 ml >1 liter 6,15 ml 6,15 ml 24/11 1,47 ml 1,26 ml 1,26 ml >1 liter 7,05 ml 7,05 ml 28/12 1,61 ml 1,40 ml 1,40 ml >1 liter 7,95 ml 7,95 ml * Antalet tester/strips baseras på testning av ett prov för HPV-typ 16, 18 och 45 och innefattar den reagensmängd som behövs för kontrollerna. Infångningsmikroplatta Infångningsmikroplattan innehåller 12 strips med åtta infångningsbrunnar i en plattram. Infångningsbrunnar på mikroplattan som inte används under testet 22 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

måste avlägsnas från plattramen, läggas tillbaka i folieförpackningen och förvaras så att de kan användas för ytterligare testning. 1. Använd en märkpenna och märk infångningsmikroplattan med en lämplig identifiering. 2. Bestäm hur många brunnar som behövs på infångningsmikroplattan baserat på det ifyllda arbetsbladet för registrering av testdata. 3. Placera infångningsmikroplattan upp och ner på en ren KimTowels-tork eller motsvarande luddfri pappershandduk. 4. Använd ett behandskat finger, eller suddgummit på en blyertspenna, för att föra bort strips med brunnar som inte ska användas på infångningsmikroplattan från plattramen. 5. Lägg tillbaka de borttagna stripsen med brunnar från infångningsmikroplattan i folieförpackningen, förslut och förvara. Obs! Infångningsmikroplattan förvaras vid 2 8 ºC. Denatureringsreagens Var försiktig vid hanteringen av denatureringsreagenset. Se varningar och försiktighetsåtgärder på sida 13. 1. Tillsätt 2 droppar indikatorfärg i flaskan med denatureringsreagens. 2. Blanda DNR noga. DNR ska ha en homogen, mörklila färg. 3. Märk DNR med det nya utgångsdatumet. Anm: I beredd form är DNR stabilt i 3 månader vid 2 8 ºC. Om färgen bleknar tillsätter du ytterligare 1 droppe indikatorfärg och blandar noggrant före användning. Probblandningar Vid testning av varje prov för HPV-typ 16, 18 och 45 krävs en specifik probblandning för varje typ, alltså totalt 3 probblandningar per prov. Det behövs en extra mängd av HPV 16-probblandningen eftersom den används för Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 23

8 kontrollbrunnar på mikroplattan. Det behövs en extra mängd av HPV 18- och HPV 45-probblandningarna, eftersom var och en används för 2 kontrollbrunnar på mikroplattan. Bered varje probblandning individuellt så som beskrivs nedan. Viktiga saker att tänka på innan du startar Bered probblandningarna under Protokoll 1: Denaturering, (se sida 28). Var extremt försiktig för att förhindra RNas-kontamination. Använd pipettspetsar med aerosolbarriär när proben pipetteras. Probspädningsvätska är viskös. Kontrollera att en synlig virvel uppnås när probblandningarna bereds; ofullständig blandning kan leda till reducerad signal. 1. För att undvika att proben fastnar i flasklocket ska varje flaska med prob centrifugeras kortvarigt så att vätskan hamnar i flaskans botten. 2. Knacka försiktigt på flaskan för att blanda. 3. Bestäm volymerna som behövs för en probspädning på 1:24:10: probspädningsvätska: 5,5 % NP-40 för att bereda probblandningen. Obs! Det behövs 35 µl probblandning per brunn i mikroplattan. Rekommendation: Bered litet extra probblandning för att täcka upp för volymen som kan gå förlorad i pipettspetsarna eller på flaskans sidor. Använd de rekommenderade volymerna (se Tabell 1, sida 22) som innefattar den rekommenderade extra volymen. 4. Märk en ny engångsbehållare på lämpligt sätt. Beroende på antalet tester rekommenderas ett polypropylenrör med rund botten på antingen 1,5 ml eller 5 ml. 5. Pipettera den mängd som behövs av probspädningsvätska (se Tabell 2, nedan) i det märkta röret. 6. Pipettera den mängd som behövs av proben i probspädningsvätskan (se Tabell 2, nedan) genom att placera pipettspetsen mot rörets innervägg strax ovanför menisken och sedan trycka ut innehållet. Viktigt: Doppa inte pipettspetsen i probspädningsvätskan. 24 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

7. Pipettera den mängd som behövs av 5,5 % NP-40 (se Tabell 2, nedan) i det märkta röret. Tabell 2. Beredning av probblandning Volym av probblandning Volym av Volym av som behövs probspädningsvätska Probvolym 5,5 % NP-40 0,56 ml 384 µl 16 µl 160 µl 0,70 ml 480 µl 20 µl 200 µl 0,77 ml 528 µl 22 µl 220 µl 0,84 ml 576 µl 24 µl 240 µl 0,91 ml 624 µl 26 µl 260 µl 0,98 ml 672 µl 28 µl 280 µl 1,05 ml 720 µl 30 µl 300 µl 1,12 ml 768 µl 32 µl 320 µl 1,19 ml 816 µl 34 µl 340 µl 1,26 ml 864 µl 36 µl 360 µl 1,33 ml 912 µl 38 µl 380 µl 1,40 ml 960 µl 40 µl 400 µl 1,47 ml 1 008 µl 42 µl 420 µl 1,61 ml 1 056 µl 44 µl 440 µl 8. Vortexblanda i minst 5 sekunder vid maximal hastighet för att blanda noggrant. En synlig virvel måste framställas. Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 25

Tvättbuffert Viktiga saker att tänka på innan du startar Bered tvättbufferten under Protokoll 3: Hybridisering och hybridinfångning, (se sida 33). För den manuella mikroplattvättningsmetoden bereds 3 liter tvättbuffert i tvättanordningen. Rekommendation: Var tredje månad bör tvättanordningen och slangarna rengöras med 0,5 % natriumhypokloritlösning och sköljas noga med destillerat eller avjoniserat vatten för att förhindra möjlig kontamination av alkaliskt fosfatas som finns i bakterier och mögel. För Automated Plate Washer: bered tvättbufferten och förvara den i en övertäckt behållare, eller bered 1 liter och placera den i tvättbehållaren till den automatiska plattvättaren. 1. Blanda tvättbuffert x15 väl och tillsätt den volym som behövs av tvättbuffert x15 (se tabell 3 nedan) till den specificerade behållaren. 2. Tillsätt den volym som behövs av destillerat eller avjoniserat vatten (se tabell 3 nedan) till den specificerade behållaren. Tabell 3. Beredning av tvättbuffert Volym av tvättbuffert som behövs Volym av tvättbuffert x15 Volym av destillerat eller avjoniserat vatten 1 liter 67 ml 933 ml 1,5 liter 100 ml 1 400 ml 2 liter 133 ml 1 867 ml 3 liter 200 ml 2 800 ml 3. Placera en ren, luddfri pappershandduk över öppningarna på behållaren och blanda väl. 26 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

4. Förslut behållaren eller placera den i respektive instrument, beroende på vad som är mest lämpligt. 5. Märk tvättbufferten med det nya utgångsdatumet. Obs! I beredd form är tvättbufferten stabil i 3 månader vid 2 30 ºC. Provberedning PreservCyt-prover kräver provberedning innan de testas med digene HPV Genotyping PS Test. Till digene HPV Genotyping PS Test behövs 225 µl av berett prov för att testa för HPV-typ 16, 18 och 45. Korrekt förvarade och tidigare beredda PreservCyt-prover kan användas för att utföra detta test. Om en otillräcklig mängd berett PreservCyt-prov återstår, måste minst 6 ml av PreservCyt-prov beredas för att testet ska kunna utföras. Se bruksanvisningarna till digene HC2 Sample Conversion kit när det gäller manuell provberedning av PreservCyt-prover. Resultatet av provberedning med användning av digene HC2 Sample Conversion kit är ett denaturerat prov som är klart att gå vidare till Protokoll 2: Tillsats av probblandning i testet (se sida 30). Bered kontrollerna separat enligt Protokoll 1: Denaturering (se sida 28). Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 27

Protokoll 1: Denaturering Kontrollerna som behövs med digene HPV Genotyping PS Test denatureras enligt anvisningarna nedan. Viktiga saker att tänka på innan du startar Denaturera inte STM-prover enligt Protokoll 1: Denaturering. STM-prover har redan denaturerats som ett resultat av testning med digene HC2 High- Risk HPV DNA Test och är klara att gå vidare till Protokoll 2: Tillsats av probblandning i testet. Denaturera inte PreservCyt-prover enligt Protokoll 1: Denaturering. Denaturering av PreservCyt-prover utförs som en del av provberedningen. De beredda PreservCyt-proverna är klara att gå vidare till Protokoll 2: Tillsats av probblandning i testet. Se till att du inte spiller kontrollvätska eller stänker DNR medan detta protokoll utförs. Tillsatsen av DNR till kontrollröret fyller röret så pass att vätskan är nära kanten. Se varningar och försiktighetsåtgärder på sida 13. Saker som ska utföras före start Kontrollera att det finns tillräckligt med vatten i vattenbadet för att täcka hela volymen i rören. Det är viktigt att allt kontrollmaterial kommer i kontakt med DNR för att förhindra falska positiva resultat. 1. Märk locken på NC1, PC1, NC2 och PC2. Locken ska återanvändas för att tillsluta kontrollrören. 2. Ta av locken från NC1, PC1, NC2 och PC2, och placera locken så att de inte löper risk att kontamineras. 3. Använd en enkanalspipett med en ny pipettspets för varje tillsats och pipettera 500 µl DNR i varje kontrollrör genom att placera pipettspetsen under vätskans yta och dispensera. 4. Sätt tillbaka locket på varje respektive kontroll och tillslut röret. Kontrollera att locken är tätt åtskruvade för att undvika kontamination eller spill. 28 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

5. Blanda varje rör noga genom att pulsvortexblanda dem individuellt, vid hög hastighet, i minst 30 sekunder. Viktigt: Blandning efter tillsats av DNR är ett avgörande steg. 6. Inkubera rören i ett flytande mikrocentrifug-rörställ i ett vattenbad på 65 ± 2 ºC i 45 ± 5 minuter. Bered probblandningarna som behövs under denna inkubation (se Reagensberedning, sida 22). 7. Avlägsna rören från vattenbadet efter inkubationen. De denaturerade kontrollerna kan: testas omedelbart (gå vidare till Protokoll 2: Tillsats av probblandning, sida 30) förvaras (se Valfri stoppunkt, sida 29) Valfri stoppunkt Viktigt: Denaturerade prover eller kontroller får inte förvaras eller transporteras på kolsyreis. Denaturerade kontroller kan förvaras vid 2 8 ºC över natten eller vid 20 ºC enligt följande: Högst en omgång med infrysning/upptining får ske för förvaring i upp till 4 veckor. Högst 3 omgångar med infrysning/upptining får ske för förvaring i upp till 9 veckor. För varje omgång av infrysning/upptining tillåts högst 2 timmar vid rumstemperatur under upptiningen. Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 29

Protokoll 2: Tillsats av probblandning Viktiga saker att tänka på innan du startar Probblandning är viskös. Kontrollera att probblandningen är väl blandad och att den volym som behövs dispenseras fullständigt i varje brunn på hybridiseringsmikroplattan. När kontroller och prover överförs till hybridiseringsmikroplattan ska du tänka på följande: Undvik att vidröra sidorna i brunnarna på hybridiseringsmikroplattan eftersom falska positiva resultat kan uppkomma om prover inte överförs noggrant. Begränsa bildandet av luftbubblor. Använd en ren, extra -lång pipettspets för varje överföring för att undvika korskontamination. Saker som ska utföras före start Om de denaturerade kontrollerna eller proverna har förvarats måste de få uppnå 20 25 ºC. Om STM- eller PreservCyt-proverna har förvarats i ett provställ och MST Vortexer 2 ska användas för vortexblandning, ska locken avlägsnas från rören och kasseras. 1. Ta fram och märk en hybridiseringsmikroplatta. 2. Vortexblanda kontrollen och provrören med en av följande metoder: Alla provtyper med vortexblandare Vortexblanda varje rör individuellt i minst 5 sekunder på högsta hastighet. STM-prover med MST Vortexer 2 a. Täck rören om så önskas med DuraSeal-rörförseglingsfilm och säkra ställets lock på provstället. b. Vortexblanda provstället i minst 5 sekunder med högsta hastighet. c. Placera omedelbart provstället på bänken och öppna spärrarna. Lyft ställets lock cirka 1 cm och flytta det försiktigt åt vänster och höger för 30 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

att frigöra rör som eventuellt har fastnat på DuraSealrörförseglingsfilmen. Ta bort ställets lock genom att lyfta det rakt upp tills det släpper från provstället. d. Dra försiktigt bort DuraSeal-rörförseglingsfilmen från locket och kasta den. PreservCyt-prover med MST Vortexer 2 a. Täck rören om så önskas med DuraSeal-rörförseglingsfilm och säkra ställets lock på provstället. b. Vortexblanda provstället i minst 10 sekunder med högsta hastighet. c. Placera omedelbart provstället på bänken och öppna spärrarna. Lyft ställets lock cirka 1 cm och flytta det försiktigt åt vänster och höger för att frigöra rör som eventuellt har fastnat på DuraSealrörförseglingsfilmen. Ta bort ställets lock genom att lyfta det rakt upp tills det släpper från provstället. d. Dra försiktigt bort DuraSeal-rörförseglingsfilmen från locket och kasta den. 3. Använd en enkanalspipett med extra långa pipettspetsar och överför 75 µl av varje kontroll eller prov till botten på den tomma brunnen på hybridiseringsmikroplattan enligt arbetsbladet för registrering av testdata. Om så önskas kan den återstående volymen förvaras enligt följande anvisningar: Förslut de denaturerade kontrollerna med originallocken och förvara enligt gränsvärdena som anges i Valfri stoppunkt, sida 29. Förslut STM-proven med nya skruvlock för provtagningsrör och förvara enligt bruksanvisningarna till digene HC2 High-Risk HPV DNA Test. Förslut PreservCyt-proven med nya lock och förvara enligt bruksanvisningarna till digene HC2 Sample Conversion kit. 4. När det sista provet har överförts ska hybridiseringsmikroplattan täckas med ett mikroplattlock och inkuberas i 10 minuter vid 20 25 ºC. 5. Vortexblanda probblandningarna noga. Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 31

6. Pipettera försiktigt 35 µl av den lämpliga probblandningen i varje brunn på hybridiseringsmikroplattan med en enkanals- eller repeterande volymetrisk pipett och en ny spets för varje tillsats av probblandning. Undvik stänk och vidrör inte sidorna i brunnarna på hybridiseringsmikroplattan. 7. Täck hybridiseringsmikroplattan med ett mikroplattlock eller en plattförseglare och skaka i 3 ± 2 minuter på Rotary Shaker I inställd på 800 ± 100 rpm (varv per minut). 8. Ta bort hybridiseringsmikroplattan från Rotary Shaker I. Ta bort mikroplattlocket och placera det på en ren yta. Efter skakning ska kontrollerna och STM-proverna bli gula och PreservCytproverna ska bli rosa. Prover som fortfarande är lila har eventuellt inte fått rätt mängd probblandning. Tillsätt ytterligare 35 µl av den lämpliga probblandningen till proverna som fortfarande är lila och skaka igen i 3 ± 2 minuter på Rotary Shaker I inställd på 800 ± 100 rpm. Om ett prov fortfarande är lila efter denna procedur ska provet testas igen. 9. Fortsätt till Protokoll 3: Hybridisering och hybridinfångning, sida 33. 32 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

Protokoll 3: Hybridisering och hybridinfångning 1. Placera hybridiseringsmikroplattan bredvid infångningsmikroplattan. 2. Använd en 8-kanalspipett och överför hela innehållet (cirka 110 µl) i brunnarna på hybridiseringsmikroplattan till botten av de motsvarande brunnarna på infångningsmikroplattan. Använd nya pipettspetsar för varje överföring och låt varje pipettspets tömmas helt för att garantera fullständig provöverföring. Om så önskas kan pipetten stadgas genom att mitten på pipettspetsarna får vila på den övre kanten av brunnarna på infångningsmikroplattan (se Figur 2, nedan). Obs! Om det rör sig om ett litet antal prover kan en enkanalspipett med pipettspetsar på 20 200 µl användas istället för en pipett med 8 kanaler. Använd nya pipettspetsar för varje överföring. Rätt Pipettera inte lodrätt så undviker du stänk. Låt inte pipettspetsen vidröra sidan i brunnen på mikroplattan. Figur 2. Rätt pipetteringsteknik. 3. Täck infångningsmikroplattan med en ny plattförseglare och inkubera infångningsmikroplattan i 120 ± 5 minuter vid 1 100 ± 100 rpm i inkubatorskakapparaten temperaturutjämnad till 55 ± 2 ºC. 4. När inkubationen är klar tar du bort infångningsmikroplattan från inkubatorskakapparaten och avlägsnar försiktigt plattförseglaren. Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 33

5. Avlägsna vätskan från brunnarna på infångningsmikroplattan genom att dekantera i en vask; vänd infångningsmikroplattan upp och ner över vasken och skaka hårt med en nedåtriktad rörelse. Viktigt: Vänd inte tillbaka plattan igen. Kontrollera att du inte ger upphov till stänk; det kan hända om du dekanterar alltför nära vaskens botten. 6. Torka genom att knacka plattan hårt 2 3 gånger på rena KimTowels-torkar eller motsvarande luddfria pappershanddukar. Kontrollera att all vätska har avlägsnats från brunnarna på infångningsmikroplattan och att ovansidan på infångningsmikroplattan är torr. 7. Fortsätt till Protokoll 4: Hybriddetektion, sida 35. 34 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

Protokoll 4: Hybriddetektion Viktiga saker att tänka på innan du startar Utför reagenstillsatser över infångningsmikroplattan från vänster till höger med en 8-kanalspipett. Torka av pipettspetsarna på reagensbehållaren för engångsbruk för att avlägsna överskott på reagens innan du tillsätter något till infångningsmikroplattan. Om inte en 8-kanalspipett används kan en lämplig repeterande volymetrisk pipett användas. Alikvotera DR1 i ett polypropylenrör med tillräcklig storlek för att rymma den volym som behövs. Vi rekommenderar att den omvända pipetteringstekniken används för att förbättra enhetligheten för reagenstillsats. Proceduren beskrivs nedan. Om så önskas kan pipetten stadgas genom att mitten på pipettspetsarna får vila på den övre kanten av brunnarna på infångningsmikroplattan. Kontrollera att sidorna på brunnarna på infångningsmikroplattan inte vidrörs eftersom prover då kan korskontamineras (se Figur 2, sida 33). 1. Blanda DR1 noga och mät försiktigt upp lämplig volym (se Tabell 1, sida 22) i en ren reagensbehållare för engångsbruk. 2. Pipettera försiktigt 75 µl av DR1 i varje brunn på infångningsmikroplattan med den omvända pipetteringstekniken, på följande sätt: a. Sätt fast spetsar på en 8-kanalspipett; kontrollera att alla spetsar sitter säkert. b. Tryck pipettkolven förbi det första stoppet till det andra stoppet. c. Sänk ner spetsarna i reagenset. d. Släpp kolven sakta och låt reagenset fylla spetsarna. Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 35

e. Dispensera reagenset i brunnarna på mikroplattan genom att trycka ned kolven till det första stoppet. Släpp inte kolven förrän pipettspetsarna har sänkts ner i reagenset igen. f. Fyll spetsarna igen och upprepa tills alla brunnar på mikroplattan är fyllda. Verifiera att alla brunnar på infångningsmikroplattan är fyllda genom att observera den rosa färgens intensitet. Alla brunnar på infångningsmikroplattan ska ha samma rosa färgintensitet. 3. Täck infångningsmikroplattan med ett mikroplattlock, ren Parafilm eller motsvarande, och inkubera i 30 35 minuter vid 20 25 ºC. 4. Fortsätt till Protokoll 5: Tvätt, sida 37. 36 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

Protokoll 5: Tvätt Tvätta infångningsmikroplattan med en av nedanstående metoder. Metod för Automated Plate Washer Automated Plate Washer ska alltid vara PÅ. Automated Plate Washer sköljer rutinmässigt systemet för rengöring. Se Användarhandbok till Automated Plate Washer för vidare anvisningar. Saker som ska utföras före start Verifiera att tvättbehållaren är fylld med minst 1 liter tvättbuffert. Om inte, bered tvättbufferten (se Reagensberedning, sida 22). Verifiera att sköljbehållaren är fylld med avjoniserat eller destillerat vatten. Verifiera att avfallsbehållaren är tom och att locket är säkert fastsatt. Automated Plate Washer primas automatiskt före varje tvätt och sköljs efter varje tvätt. Automated Plate Washer tvättar bara kompletta strips och kan inte hoppa över brunnar eller strips. Om endast en partiell strip med brunnar används på en infångningsmikroplatta, ska tomma mikroplattbrunnar placeras i plattramen för komplettering av stripen före tvätt. Alla strips som tvättas måste ha mikroplattbrunnar. 1. Avlägsna locket, ren Parafilm eller motsvarande från infångningsmikroplattan, och placera infångningsmikroplattan på plattformen till Automated Plate Washer. 2. Verifiera att Automated Plate Washer är PÅ, och att displayen visar Digene Wash Ready (Digene-tvätt klar) eller P1. 3. Välj antalet strips som ska tvättas genom att trycka på tangenten Rows (rader) och sedan på + eller för att justera. 4. Tryck på tangenten Rows (Rader) för att återgå till Digene Wash Ready eller P1. Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 37

5. Tryck på Start/Stop för att börja. Automated Plate Washer utför 6 fyllnings- och aspirationsomgångar vilket tar cirka 10 minuter för varje omgång. Det görs en kortvarig paus under programmet; ta inte ut infångningsmikroplattan för tidigt. När Automated Plate Washer är klar med tvätten visar displayen Digene Wash Ready eller P1. 6. Ta bort infångningsmikroplattan från plattformen i Automated Plate Washer när programmet är slut. Brunnarna på infångningsmikroplattan ska vara vita, och det ska inte vara några rester av rosa vätska kvar i brunnarna på infångningsmikroplattan. 7. Fortsätt till Protokoll 6: Signalamplifiering, sida 40. Manuell plattvätt Saker som ska utföras före start: Verifiera att tvättanordningen är fylld med minst 1 liter tvättbuffert. 1. Avlägsna locket, ren Parafilm eller motsvarande från infångningsmikroplattan. 2. Placera rena KimTowels-torkar eller motsvarande luddfria pappershanddukar ovanpå infångningsmikroplattan. 3. Kontrollera att pappershanddukarna är i kontakt med hela ytområdet på infångningsmikroplattan, och vänd försiktigt infångningsmikroplattan upp och ner. 4. Låt infångningsmikroplattan rinna av i 1 2 minuter. 5. Låt infångningsmikroplattan torka på rena KimTowels-torkar eller motsvarande luddfria pappershanddukar. Kassera noga de använda pappershanddukarna för att undvika kontamination med alkaliskt fosfatas. 6. Använd tvättanordningen för att tvätta infångningsmikroplattan manuellt 6 gånger. För att få en tillräcklig tvätteffekt ska alla brunnar på infångningsmikroplattan överflödas med tvättbuffert. Detta avlägsnar DR1 från toppen på brunnarna på infångningsmikroplattan. Tvättning börjar med 38 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

brunn A1 på infångningsmikroplattan och fortsätter på ett slingrande sätt åt höger och nedåt. När alla brunnar på infångningsmikroplattan är fyllda, ska vätskan dekanteras i vasken med en kraftig nedåtriktad rörelse. Den andra tvätten börjar med brunn H12 på infångningsmikroplattan och fortsätter i en slingrande rörelse åt vänster och uppåt. Denna sekvens med 2 tvättar upprepas ytterligare 2 gånger för totalt 6 tvättar av infångningsmikroplattan. 7. Efter tvätt ska infångningsmikroplattan torkas genom att den vänds upp och ner på rena KimTowels-torkar eller motsvarande luddfria pappershanddukar. Knacka hårt på den 3 4 gånger. Byt ut pappershanddukarna och gör om proceduren. 8. Låt infångningsmikroplattan ligga upp och ned och rinna av 5 minuter. Byt ut pappershanddukarna och gör om proceduren. Infångningsmikroplattan ska vara vit, och det ska inte vara några rester av rosa vätska kvar i brunnarna på infångningsmikroplattan. 9. Fortsätt till Protokoll 6: Signalamplifiering, sida 40. Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 39

Protokoll 6: Signalamplifiering Viktiga saker att tänka på innan du startar Använd ett nytt par puderfria engångshandskar när du hanterar DR2. Utför reagenstillsatser över infångningsmikroplattan från vänster till höger med en 8-kanalspipett. Om inte en 8-kanalspipett används kan en lämplig repeterande volymetrisk pipett användas. Alikvotera DR2 i ett polypropylenrör med tillräcklig storlek för att rymma den volym som behövs. Tillsätt DR2 utan avbrott. Inkubationstiderna för brunnarna på infångningsmikroplattan måste vara så nära varandra som möjligt (utan uppehåll mellan brunnarna). Kontrollera att du inte vidrör sidorna på brunnarna på infångningsmikroplattan och att du inte får reagensstänk på pipettspetsarna eftersom prover då kan korskontamineras (se Figur 2, sida 33). 1. Blanda DR2 noga och mät upp lämplig volym (se Tabell 1, sida 22) i en ren reagensbehållare för engångsbruk. 2. Pipettera 75 µl av DR2 i varje brunn på infångningsmikroplattan med den omvända pipetteringstekniken som har beskrivits tidigare (se Protokoll 4: Hybriddetektion, sida 35). Verifiera att alla brunnar på infångningsmikroplattan har fyllts tillräckligt genom att observera den gula färgens intensitet; alla brunnar på infångningsmikroplattan ska ha en likvärdig gul färgintensitet. 3. Täck infångningsmikroplattan med ett mikroplattlock och inkubera vid 20 25 ºC i 15 minuter (och högst 30 minuters inkubation). Undvik direkt solljus. 4. Fortsätt till Protokoll 7: Mäta infångningsmikroplattan och framställa resultat, sida 41. 40 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test

Protokoll 7: Mäta infångningsmikroplattan och framställa resultat 1. När inkubationen är slutförd ska infångningsmikroplattan mätas med användning av mätfunktionen för rådata på ett DML-instrument. Se användarhandboken till respektive programvara för mer information om mätning av en infångningsmikroplatta. 2. Skriv ut rådatarapporten. Viktigt: Rådatarapporten måste skrivas ut efter mätning. Det går inte att spara rådatarapporten med användning av digene - assayanalysprogramvaran. 3. Märk rådatarapporten på lämpligt sätt med informationen som är specificerad på arbetsbladet för registrering av testdata. 4. Om du inte använde en full infångningsmikroplatta, tar du bort infångningsmikroplattans använda brunnar från plattramen, sköljer plattramen noga med destillerat eller avjoniserat vatten, torkar och sparar för nästa test. 5. Kassera alla reagensalikvoter och beredda reagenser om inget annat anges. Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test 41

Tolkning av resultat Cutoff (CO) för digene HPV Genotyping PS Test motsvarar 5 000 kopior av HPV-plasmid 16, 18 och 45. Viktigt: Innan testresultaten tolkas måste alla krav angående kvalitetskontroll och analyskalibreringsverifiering slutföras (se Kvalitetskontroll, sida 52). Resultat av testning CO för bestämning av positiva prover är PC1-medelvärdet. Använd det beräknade PC1-medelvärdet under analyskalibreringsverifiering för att bestämma RLU/CO för varje prov. Testresultaten bestäms på följande sätt: Prover med ett RLU/CO-värde 2,0 betraktas som positiva för den HPVtypen. Prover med ett RLU/CO-värde < 2,0 betraktas som negativa eller inget HPV-DNA detekterat för den HPV-typen. Antigne saknas HPV-DNAsekvenser eller HPV-DNA-nivåerna är lägre än testets detektionsgräns. Felsökningshandbok Kommentarer och förslag Felaktig eller ingen färgförändring observeras under denatureringen av kontrollerna a) Felaktig beredning av DNR b) DNR har inte tillsatts till kontrollerna Verifiera att DNR innehåller indikatorfärgen och har en mörklila färg. Verifiera att DNR har tillsatts till kontrollerna genom att mäta volymen i mikroplattan. Volymen ska vara 75 µl. Om volymen visar att DNR inte har tillsatts ska du tillsätta lämplig mängd DNR, blanda och fortsätta med testet om den rätta färgförändringen observeras. 42 Bruksanvisning för digene HPV Genotyping PS Test