Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo TM HLA Wipe Test BF-40-01 Sidan 1 av 8 Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Wipe Test BF-40-01 Revision 3 Juli 2014
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo TM HLA Wipe Test BF-40-01 Sidan 2 av 8 1. Användningsområde Biofortuna SSPGo HLA Wipe Test är avsett att användas för att monitorera laboratorieutrymmen och -utrustning för kontaminering med PCR-amplikon som kan genereras av Biofortuna SSPGo-produkterna. 2. Introduktion PCR är en känslig teknik som är mottaglig för kontaminering med DNA-amplikon från en tidigare PCR. Kontaminering kan leda till falskt positiv amplifiering i efterföljande PCR-reaktioner, vilket kan leda till felaktig genotypning. PCRamplikon kan kontaminera reagens och prover samt även laboratorieutrustning såsom pipetter. Reagens och utrustning ska undersökas regelbundet efter tecken på kontaminering. 3. Beskrivning av analysen Varje SSPGo HLA Wipe Test består av en strip med åtta PCR-brunnar som innehåller frystorkad PCR-buffert, polymeras och primrar som är specifika för HLA-DRA-genen och som kommer att generera en amplikon på 187 bp från humant genomiskt DNA. Eftersom en DRA-amplikon används som intern kontroll i alla Biofortuna-förpackningar kommer all kontaminering från användning av Biofortuna SSPGo-förpackningar leda till amplifiering av DRA-genen och detekteras av avtorkningstestets primrar. Varje strip med åtta brunnar testar förekomst av kontaminering i upp till tre avtorkningsområden. Varje strip innehåller integrerade positiva och negativa kontrollreaktioner, samt inhibitionskontrollreaktioner för vart och ett av avtorkningsområdena. Ett område testas för kontaminering genom att man först stryker över området med en provtagningspinne som sedan blötläggs i. Vattnet används som templat i avtorkningstestet och som 50:50- blandning med genomiskt DNA som ett PCR-inhibitionstest. Tester för kontaminering bör utföras regelbundet. Typiska områden som bör testas är DNA-prepareringsområdet, PCR-uppsättningsområdet och post-amplifieringsområdet. Typiska föremål som bör testas är arbetsbänkar, pipetter, centrifuger, handtag till kylskåp och frys, dörrhandtag och rackar. Typiska lösningar som bör testas är DNAprepareringsbuffertar och DNA-spädningsvätskor. Reagens som används i flera analyser, såsom PCR-buffertar och Taq-polymeras, är särskilt känsliga för kontaminering, men dessa påverkar inte Biofortuna-förpackningarna eftersom Biofortuna-produkterna är kompletta och endast kräver tillsatt DNA. 4. Förpackningens innehåll 12 strips med 8 PCR-brunnar där varje brunn innehåller 10 µl fördispenserade frystorkade primrar, polymeras, dntp* och buffert. Varje folieförpackad strip är avsedd att testa tre områden för kontaminering. Formatet med en strip och åtta reaktioner visas nedan. Reaktion Färgämne Användning 1 Rött Positiv kontroll: DNA 2 Lila Negativ kontroll: som används för att genomfukta provtagningspinnen 3 Blått Område 1, inhibitionstest: 50 % DNA, 50 % avtorknings 4 Lila Område 1, avtorkningstest 5 Blått Område 2, inhibitionstest: 50 % DNA, 50 % avtorknings 6 Lila Område 2, avtorkningstest 7 Blått Område 3, inhibitionstest: 50 % DNA, 50 % avtorknings 8 Lila Område 3, avtorkningstest 36 sterila provtagningspinnar 12x8 PCR-lock 1x bruksanvisning 1x analyscertifikat Säkerhetsdatablad (MSDS) kan laddas ned från Biofortunas webbplats www.biofortuna.com. Kontakta er lokala distributör om det inte går att ladda ned från webbplatsen.
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo TM HLA Wipe Test BF-40-01 Sidan 3 av 8 *CleanAmp dntp är licensierat av Trilink Biotechnologies Inc för användning i Biofortuna SSPGo-produkter. 5. Reagens och utrustning som inte medföljer Lämpliga kalibrerade pipetter och sterila spetsar, t.ex. P10-pipett med filterspetsar på 10 µl. DNA-isoleringskit/-utrustning. UV-spektrofotometer. Polypropylenrör. Sterilt för molekylär användning. En termocykel med följande specifikationer ska användas: Termocykel med värmelock för 96 brunnar med en temperatur på 104 C för oljefri drift Ramptakt på 1,0 o C/s. Temperaturområde på 4,0 C till 99,9 C Temperaturprecision på ±0,25 C för området 35 C till 99,9 C Temperaturkalibrering som kan spåras till en referensstandard Programmera termocykeln med hjälp av PCR-cyklingsparameterna i avsnitt 8 nedan. Anmärkning: För specifik termocykelinformation, se tillverkarens användarmanual. Termocykeln ska kalibreras i enlighet med reglerna för ackreditering från ASHI (American Society of Histocompatibility and Immunogenetics) eller EFI (European Federation of Immunogenetics). Gelelektroforesreagens (agaros, 0,5x TBE, 1 000 bp DNA-molekylviktmarkör, 10 mg/ml etidiumbromid). Gelelektroforesutrustning (geltankar, strömförsörjning, geldokumentationssystem med UV-transilluminator). Anmärkning: ändringar i de specificerade tillstånden, som termocykelns ramptakt, kan påverka tolkningen av testresultatet. 6. Säkerhetsföreskrifter Analyser får endast utföras av lämpligt utbildad personal. Alla reagens ska hanteras i enlighet med god laboratoriesed. Håll områdena för pre- och post-pcr åtskilda. Material som genomgått post-pcr får inte återföras till området för pre-pcr. Biologisk risk: Hantera alla blodprodukter som potentiellt smittfarliga. Biologisk risk: Etidiumbromid är ett potentiellt karcinogent ämne. Vid användning av detta ämne ska alltid skyddshandskar, laboratorierock och skyddsglasögon användas. Biologisk risk: Var försiktig vid användning av UV-källor använd alltid skyddshandskar, laboratorierock och skyddsglasögon. Titta aldrig direkt på UV-ljuset. Säkerhetsdatablad (MSDS) finns tillgängliga från www.biofortuna.com. 7. Förvaring och stabilitet Förpackningarna till Biofortuna SSPGo ska förvaras i 2-28 C. När PCR-brunnarna har tagits fram ur foliepåsarna ska reagensen rehydreras med DNA inom 3 timmar. Se sista förbrukningsdag på förpackningen. Använd inte produkterna efter den sista förbrukningsdag som finns tryckt på förpackningen. Använd inte förpackningarna om foliepåsen har revor eller hål eller om det inte finns någon torkmedelspåse där. Använd endast förseglingsarken eller locken som medföljer för att se till att PCR-brunnarna förseglas ordentligt efter att DNA tillsatts, annars kan avdunstning förekomma under PCR-amplifieringen. Var särskilt noga med kanter och hörn. Anmärkning (1): Vid behov kan de icke -hydratiserade PCR-plattorna och -stripsen hållas utanför påsen upp till 3 timmar innan man tillsätter DNA vid en temperatur på upp till 21 o C och luftfuktighet som inte överstiger 60%.
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo TM HLA Wipe Test BF-40-01 Sidan 4 av 8 Anmärkning (2): När de har hydratiserats med DNA kan PCR-strips och -plattor från nyöppnade påsar lagras upp till 24 timmar vid 2-8 C innan PCR-steget, förutsatt att brunnarna är väl förseglade för att undvika avdunstning. 8. Anvisningar för användning Observera: En vanlig källa till kontaminering är PCR-pipetterna och det är tillrådligt att man torkar av spetsen och om möjligt inuti cylindern med en provtagningspinne. Dessutom bör alla kontamineringstester utföras med en pipett som har testats och funnits vara negativ. Om kontaminering detekteras ska laboratoriets riktlinjer för dekontaminering följas och områdena testas igen. 1. Arbeta i ett DNA-fritt utrymme och märk ett sterilt DNase-fritt polypropylenrör som rymmer 2 ml för vart och ett av avtorkningsområdena som ska testas. Märk ett extra rör med Negativ kontroll. 2. Använd en pipett som är garanterat fri från kontaminering och tillsätt 500 µl sterilt destillerat för molekylär användning i varje 2 ml-rör. 3. Placera en av de medföljande sterila plastprovtagningspinnarna i varje avtorkningsteströr så att den genomfuktas. 4. Stryk med den genomfuktade pinnen över området som ska testas. 5. Bryt eller klipp av plaststickan på pinnen och placera den i det ursprungliga 2 ml-röret med. 6. Blanda kort med vortexblandare. 7. Avlägsna och kassera provtagningspinnen med hjälp av en steril pincett. 8. Centrifugera i 1 minut vid 10 000 till 13 000 rpm i en mikrocentrifug för att avlägsna partiklar. 9. Öppna foliepåsen med testet. Alla tester ska rehydreras med totalt 10 µl vätska i enlighet med diagram 1. 10.Negativ kontroll: Tillsätt 10 µl sterilt för molekylär användning till den negativa kontrollreaktionen 2 (lila). 11.Tillsätt 5 µl sterilt till reaktionerna 1, 4, 6 och 8. 12.Positiv kontroll: Tillsätt 5 µl humant genomiskt DNA på 10 ng/µl till reaktion 1 (röd reaktion) och reaktionerna 3, 5 och 7 (blå). 13.Reaktioner för avtorkningstestet: Tillsätt 5 µl centrifugerad vätska (avtorknings) från avtorkningsområde 1 till reaktionerna 3 och 4, från avtorkningsområde 2 till reaktionerna 5 och 6 samt från avtorkningsområde 3 till reaktionerna 7 och 8. 14.Alla reaktioner har nu en rehydrerad volym på 10 µl, vilket visas i diagram 1. Förslut reaktionerna med de medföljande locken och fortsätt med de vanliga SSPGo PCR-parametrarna som visas nedan. Diagram 1. Reaktion 1 RÖD 5 µl sterilt 5 µl DNA Reaktion 2 LILA 10 µl sterilt Reaktion 3 BLÅ Område 1 5 µl DNA Reaktion 4 LILA Område 1 5 µl sterilt Reaktion 5 BLÅ Område 2 5 µl DNA Reaktion 6 LILA Område 2 5 µl sterilt Reaktion 7 BLÅ Område 3 5 µl DNA Reaktion 8 LILA Område 3 5 µl sterilt Kontroller Kontroller Avtorkningstester 3 områden ANMÄRKNING OM RESUSPENDERING: Se till att PCR-blandningar resuspenderas med proverna inom 3 timmar efter att plattan har tagits ut ur foliepåsen. ANMÄRKNING OM PCR-PLATTANS/-STRIPSENS HÖJD: Plattorna och stripsen bör vara lika höga om de placeras i samma PCR-maskin. Olika höjd kan orsaka dålig kontakt med PCR-maskinens värmelock. Detta kan leda till dålig eller utebliven PCR-amplifiering.
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo TM HLA Wipe Test BF-40-01 Sidan 5 av 8 PCR-parametrar Följande PCR-parametrar ska användas. Se till att ramphastigheten är minst 1 C per sekund och aktivera värmelocket. Läs tillverkarens användarmanual till termocykeln för att få en fullständig handhavandebeskrivning. Termocyklar ska kalibreras i enlighet med reglerna för ackreditering från American Society of Histocompatibility and Immunogenetic (ASHI) eller European Federation of Immunogenetics (EFI). Denaturering 94 C 5 minuter Denaturering 96 C 15 sekunder Bindning 66 C 50 sekunder 10 cykler Förlängning 72 C 30 sekunder Denaturering 96 C 15 sekunder Bindning 64 C 50 sekunder 20 cykler Förlängning 72 C 30 sekunder Gelelektrofores HÅLLTEMPERATUR 15 C Dessa anvisningar gäller horisontell agarosgelelektrofores: Bered en 2-procentig agarosgel i 0,5x TBE-buffert. När gelen har svalnat till cirka 60 C ska etidiumbromid tillsättas så att den slutliga koncentrationen blir 0,5 µg/ml. Härda gelen och sätt i mikrotiterkammar (t.ex. 12 x 8 brunnar med 9 mm mellanrum). När gelen har stelnat ska kammarna tas ur och gelen täckas med 0,5x TBE-buffert. Överför minst 5 µl och högst 10 µl från varje reaktion på plattan eller stripen till motsvarande brunn i gelen och notera varje reaktions position. En stege på 100 bp kan vara till hjälp vid storleksbestämningen. Kör gelen i 20 minuter vid 10 V/cm. Se tillverkarens bruksanvisning till elektroforessystemet för särskild information som gäller utrustningen. Gelerna ska avbildas med ett UV-geldokumentationssystem med UV-transilluminator.
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo TM HLA Wipe Test BF-40-01 Sidan 6 av 8 9. Tolkning Testresultaten för testade områden är endast giltiga om den positiva kontrollen är positiv och den negativa kontrollen är negativ. Testerna av avtorkningsområdena är endast giltiga om motsvarande inhibitionskontrolltest är positivt. En amplikon på 187 bp ska observeras om PCR-kontaminering eller DNA-kontaminering förekommer. Alla fläckar eller band i andra storlekar kan också indikera PCR-kontaminering, men primerdimer och andra primerförlängningsartefakter på mindre än 100 bp ska ignoreras. Rx Färgämne Användning Resultat Slutsats Åtgärd 1 Rött 2 Lila 3, 5, 7 4, 6, 8 Blått Lila Positiv kontroll Negativ kontroll Inhibitionstest Avtorkningstest 187 bp +ve Testet giltigt. DNA lämpligt. PCR effektivt Ingen amplifiering Testet ogiltigt Upprepa hela analysen med en annan DNA-kontroll 187 bp +ve Testet ogiltigt. Vattnet och/eller Testa med annat och en pipetten är kontaminerade annan pipett Ingen amplifiering Testet giltigt. Vattnet är inte kontaminerat 187 bp +ve Avtorkningstestet giltigt. Inga inhibitorer närvarande Ingen amplifiering Avtorkningstestet ogiltigt. Rengör området med sterilt Potentiella inhibitorer närvarande, upprepa 187 bp +ve Kontaminering förekommer Isolera och rengör den pipett som användes. Rengör det kontaminerade området med en lösning avsedd att avlägsna DNA. Upprepa testet. Ingen amplifiering Avtorkningstestet negativt. Ingen kontaminering 10. Kvalitetssäkring och kvalitetskontroll Test av analysen: PCR-amplikon från en Biofortuna-förpackning fick torka på en hård yta. Avtorkningstestet utfördes på ospädd amplikon och därefter i spädningar från 1x10 1 till 1x10 15. Amplikonen detekterades i spädningar upp till och inklusive 1x10 15. Genomiskt DNA fick torka på en hård yta. Avtorkningstestet utfördes på gdna på 100 ng/µl och sedan i spädningar från 1x10 1 till 1x10 15. DNA detekterades i spädningar på upp till 1x10 3. 11. Referenser 1) Bunce M et al Tissue Antigens. 1995 Nov;46(5):355-67. 2) Saiki RK et al. Nature. 1986 Nov 13-19;324(6093):163-6.
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo TM HLA Wipe Test BF-40-01 Sidan 7 av 8 12. Biofortuna HLA Wipe Test (v2): Provregistreringsblad Provregistreringsblad Detta provregistreringsblad bör kopieras före användning eftersom förpackningen räcker till 36 områden (3 avtorkningsområden per strip med 8 brunnar, 12 strips per förpackning). Testdatum: Testet utfördes av: Godkändes av: Övrig information: Förpackningens lotnummer: Reaktion Färgämne Användning (se anvisningar) Testresultat Åtgärd Provinformation 1 Rött Positiv kontroll: DNA 2 Lila Negativ kontroll: 3 Blått Område 1, inhibitionstest 4 Lila Område 1, avtorkningstest 5 Blått Område 2, inhibitionstest 6 Lila Område 2, avtorkningstest 7 Blått Område 3, inhibitionstest 8 Lila Område 3, avtorkningstest
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo TM HLA Wipe Test BF-40-01 Sidan 8 av 8 13. Symbolförklaring X P i M V H 4: s 28 : g Antal tester EG-represantant Läs bruksanvisningen Tillverkningsplats In vitro-diagnostik Sista förbrukningsdag Förvaringstemperatur Lotnummer Distribuerad av Global Trade Item Number 14. Tillverkarens kontaktinformation Biofortuna Ltd 1 Hawkshead Road Croft Business Park Bromborough, CH62 3RJ, UK Tel: +44 (0) 151 334 0182 E-post: info@biofortuna.com Webb: www.biofortuna.com 15. Översättningar Français: Deutsch: Español: Italiano: České: Danske: Έλληνες: Magyar: Norsk: Polska: Português: Россию: Slovenskému: Türk: Svenska: Traductions disponibles Übersetzungen verfügbar Traducciones disponibles Traduzioni disponibili Překlady k dispozici Tilgængelige oversættelser διαθέσιμες μεταφράσεις Fordítások Oversettelser tilgjengelig Dostępne tłumaczenia Traduções disponíveis Переводы доступны Preklady k dispozícii Çeviriler mevcut Översättningar tillgängliga www.biofortuna.com Revisionshistorik