Leuko64 Analyskit för detektion av akut systemisk inflammatorisk respons i Produktinformation h LK-064-75 (75 provtagningar) LK-064-250 (250 provtagningar) V För in vitro-diagnostik SAMMANFATTNING OCH PRINCIPER Uttryck av neutrofilt CD64 ökar snabbt både in vitro och in vivo inom några timmar genom inflammationsmediatorer såsom interferon-gamma- och G-CSF (1-3). Samma förändring observeras som respons på dokumenterad infektion eller vävnadsskada, vilket visar att mätningen av neutrofilt CD64 uttryck korrelerar med förekomsten av sådana förhållanden hos människor (4-14). Leuko64 TM analyskittet använder en blandning av tre monoklonala antikroppar med specificiteter till CD64 (kloner 22 och 32.2) och CD163 (klon MAC2-158). Användningen av två antikroppar mot olika epitoper av CD64 förbättrar signalbrusförhållandet av analysen och tillhandahåller en mekanism för minimering av variation mellan batchar när det gäller reagensens fluorescenssignal. Tillsatsen av den monoklonala antikroppen till CD163, en monocyt-specifik antigen, ökar specificiteten av identifieringen av leukocytsubpopulationen och underlättar därmed Leuko64 TM. QuantiCALC TM programvarans klustersökande algoritm och möjliggör identifiering av interna "positiva och negativa kontroll"-populationer. Användning av automatiserad programvara eliminerar den inherenta variationen i den standardiserade subjektiva flödescytometriska analysen enligt listan. En suspension med fluorescerande pärlor för standardisering av den cellulära CD64- kvantifieringen möljiggjorde spårbarhet till NIST Standard referensmaterial SRM 1932 (RM 8640) och tillhandahåller en mekanism för att minimera skillnader mellan batchar i Leuko64 TM analyskitten. Resultaten av Leuko64 TM analysen redovisas som en PMN CD64-index som den diagnostiska parametern tillsammans med monocyt CD64 och CD163-indexen. TILLÄMPNING LK-064-75 och LK-064-250 versionerna av Leuko64 TM analyskittet är särskilt utformade för att användas med följande flödescytometrar: Beckman Coulter XL, Beckman Coulter FC-500, Beckman Coulter Navios, BD Biosciences FACScan, BD Biosciences FACSCalibur och BD Biosciences Cantos.
AVSEDD ANVÄNDNING Trillium Diagnostics Leuko64 TM analyskittet är avsett för användning vid mätning av leukocyt neutrofilt CD64 uttryck och är avsett att användas tillsammans med andra laboratorieresultat och kliniska bedömningar som hjälp vid in vitro diagnos akut systemisk inflammatorisk reaktion på vävnadsskada, såsom det förekommer i vävnadsskada, infektion eller sepsis. Trillium Leuko64 TM är endast avsedd för in vitro diagnostik av utbildad kvalificerad personal. KITKOMPONENTER Blandning av murina monoklonala antikroppar (innehåller buffrad Reagens A saltlösning med 0,5 % renat bovint serumalbumin (BSA) och 0,01 % natriumazid). 10 ggr koncentrerad Trillium Lyse-lösning (innehåller Reagens B ammoniumklorid) Suspension av 5-6 µm polystyrenkulor märkta med Starfire Red TM Reagens C och fluorescein-isotiocyanat (FITC), (innehåller <0,1 % natriumazid och 0,01 % Tween 20). Används för att analysera flödescytometriska listade filer och för Leuko64 TM att beräkna CD64-index på leukocyter. Den medföljande CDskivan innehåller även självstudier för användarutbildning och Programvara optimal användning av Leuko64 TM analyskittet. REAGENSER och MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE INGÅR Destillerat vatten 12x75 polystyrenrör för engångsbruk Flödescytometer Mikropipett (er) med förmåga att dispensera 5ul, 50ul, och 1 ml Vortexmixer Dator för analys av listade filer PROV Leuko64 TM analyskittet kräver endast 50 µl antikoagulerat helblod. EDTA, heparin, natriumcitrat eller ACD är alla kompatibla antikoagulantia med detta testsystem. Blodprover håller sig i godtagbart skick i upp till 8 timmar när de förvaras vid rumstemperatur (18-22 C) eller i 48 timmar i kylen (2-8C). PROVBEREDNING 1. Späd 10 ggr Trillium Lyse (reagens B) 1:10 genom att blanda en del av den koncentrerade reagensen B med 9 delar filtrerat destillerat vatten. Det slutliga phvärdet av denna lösning bör vara 7,40+ 0,05. Gör i ordning en volym som är tillräcklig för det förväntade antalet tester (1,0 ml krävs för varje prov). Utspädd eller 1 ggr Trillium Lyse är stabil i 1 vecka vid rumstemperatur (20-26 C) eller 30 dagar i kylskåp (2-8 C). 2. Den utspädda Trilliumen Lyse-lösningen skall ha en temperatur på mellan 20 C och 37 C vid användning. En kall lösning kan resultera i dålig lys och mindre optimala analysförhållanden. 3. Märk ett 12 x 75 mm polystyrenrör för varje prov som skall analyseras. 4. Pipettera 50µL Leuko64 TM reagens A i varje märkt rör. LK64-V11-2013 A4 SV Sidan 2 av 8
5. Pipettera 50µL av det välblandade antikoagulerade blodprovet med vita blodkroppar <25 x 10 9 celler/l (utspädd efter behov) till motsvarande rör innehållande reagens A, blanda försiktigt eller virvla, och inkubera under 10 minuter i mörker vid rumstemperatur (18-22 C). 6. Tillsätt 1 ml av 1X Trillium Lyse (utspätt reagens B) till varje rör och virvla grundligt. Inkubera 15 minuter i mörker vid rumstemperatur. Om man virvlar då och då förbättrar det lysen. 7. Tillsätt 5 µl Leuko64 TM pärlor (reagens C) till varje rör, virvla, och analysera på flödescytometern genom att använda instrumentarrangemanget och analysprotokollet nedan. Beredda prov som inte analyseras omedelbart bör förvaras vid 2-8 C och skyddas från ljus tills de analyseras. Analys med flödescytometri bör utföras inom 4 timmars färgning. KONFIGURATION AV FLÖDESCYTOMETER Innan du kan analysera dina första prov, måste ett inhämtningsprotokoll konfigureras på flödescytometern. Leuko64 TM pärlor (reagens C) kommer att fungera som kalibrator för instrumentets ökningar och spänningsinställningar. För att den automatiserade programvaran ska kunna fungera korrekt, är det absolut nödvändigt att noga följa följande steg. Se självstudierna på den medföljande CD-skivan med Leuko64 TM QuantiCALC programvaran (CD) för ytterligare instruktioner. 1. Förbered ett12 x 75 mm polystyrenrör som innehåller 5 µl Leuko64 TM pärlor (reagens C) i 0,5 ml 1X Trillium Lyse (reagens B utspädd 1:10 med filtrerat destillerat vatten, ph 7,40+0,05). Denna lösning med pärlor kommer att användas för att fastställa den optimala PMT-spänningen och ljusspridningsinställningarna för flödescytometern. 2. I inhämtningsläge för din cytometer (Beckman Coulter XL, FC500 eller Naviosanvändare - se nedan), ska du konfigurera fem histogram med två parametrar: FS (lin) mot SS (log) CD64 FITC mot SS (log) CD163 PE mot SS (log) FL3 (pärlor) mot SS (log) CD163 PE mot CD64 FITC Och 3 histogram med en parameter: FL1 - CD64 FITC FL2 - CD163 PE FL3 (eller PMT med filterinställningar som kan detektera 685 nm ljus) OBS: Beckman Coulter XL, FC500 och Navios-instrument måste ha inhämtningsparametrarna markerade i följande ordning: P1 = FALS P4 = log PE P2 = log sidospridning (side P5=log PMT för 685 nm signal (vanligtvis scatter) FL4) P3 = log FITC LK64-V11-2013 A4 SV Sidan 3 av 8
3. Stäng AV alla inställningar för kompensering och tröskel. 4. Spänningsinställningar för alla instrument, förutom BDB FACSCanto II. (FACSCanto II-användare, se instruktioner nedan) Obs: Sätt alla loggparametrar på visning med 4-decimaler i flödescytometrins uppsamlingsprogram före inhämtningen Kör pärlsuspensionen och gör följande justeringar på histogrammen med en parameter (se diagram) Mitten av toppen på FL1 (FITC)-axel ska centreras på kanal 100, (i början av den tredje decimalen av fluorescensintensiteten. Mitten av toppen på FL2 (PE)-axel ska centreras på ~ 20, (på första strecket för den tredje decimalen av fluorescensintensiteten). Mitten av toppen på FL3-axeln ska centreras på kanal 100, (i början av den tredje decimalen för fluorescensintensiteten. På FS vs log SS histogrammet ska pärlpopulationen placeras i slutet av den tredje decimalen för log sidospridningssignalen och nära kanal 200 för framåt eller lågvinkel spridningssignal (för 256-skalan används kanal 25-50). För alla användare av Beckman Coulter-modeller, FACSCalibur och FACScan TM : CD64 FITC CD163 PE Starfire Red SSC Log **Spänningsinställningar endast för användare av BDB FACSCanto II TM : BD FACSCanto II flödescytometrar kräver alternativa installationsinstruktioner på grund av skillnader i visningen av logg fluorescensskalan som är unik för inhämtningsprogrammet BD FACSDiva som används på Canto II. Obs: Sätt alla loggparametrar på visning med 4-decimaler i flödescytometrins uppsamlingsprogram före inhämtningen. Kör pärlsuspensionen och gör följande justeringar på histogrammen med en parameter (se diagram): Mitten av toppen på FL1 (FITC)-axel ska centreras på kanal 3000, (det andra strecket för den tredje decimalen för fluorescensintensiteten). Mitten av toppen på FL2 (PE)-axel ska centreras nära den andra decimalen av fluorescensintensiteten. Mitten av toppen på FL3-axel ska centreras på kanal 3000, (det andra strecket för den tredje decimalen för fluorescensintensiteten). LK64-V11-2013 A4 SV Sidan 4 av 8
På FS vs. log SS histogrammet ska pärlpopulationen placeras i slutet av den tredje decimalen för log sidospridningssignalen och i kanal 25-50 för framåt eller lågvinkel spridningssignal. Endast för användare av BD FACSCanto II: CD64 FITC CD163 PE Starfire Red SSC Log 5. Tröskeln för att utesluta blodplättar och debris av röda blodkroppar kommer att ställas in på log SS med användning av lymfocyter. Diskriminatorn på log SS ska ställas in precis till vänster om lymfocytpopulationen. Använd inte en diskriminator som är inställd på framåtspridning, eftersom pärlor kommer att uteslutas från inhämtningen. 6. Inställningar för inhämtning och lagring bör justeras för att möjliggöra insamling av 50 000 obevakade händelser. Det rekommenderas i allmänhet att ställa in upplösningen till 1024 rekommenderas i allmänhet, men det krävs när man använder cytometrar från Beckman Coulter Cytomics TM FC500 eller BD Biosciences FACSCanto TM. 7. Spara inställningarna och inhämtningsmallen. Upprepa steg 4-7 med valfri ny batch Leuko64 TM eller efter nästa service på instrumentet. LISTMODE FILANALYS Installera medföljande Leuko64 TM QuantiCALC program på den Macintosh eller PC som kommer att användas för dataanalysen. Följ de användarvänliga instruktionerna för listmode dataanalys som du hittar i hjälpfilen för programmet. OBS: Programmet är batch-specifikt och protokoll för användning är specifika för instrumentmodellerna. Du kommer att uppmanas att verifiera rätt val. STRATEGI FÖR KVALITETSKONTROLL VID LEUKO64 TM ANALYS Analysen använder autologa cellpopulationer inom patientproven för både positiva och negativa kontroller, vilket optimerar bedömningen av pre-analytiska variabler. Lymfocytpopulationen, som saknar uttryck av både CD64 och CD163 tjänar som en negativ kontrollpopulation och säkerställer tillsättning av lämpliga reagens och kan detektera närvaron av fluorescerande ämnen inom det diagnostiska provet. Monocytpopulationen, som har konstitutivt uttryck av både CD64 och CD163, fungerar som en positiv kontroll för försäkran om rätt provfärgning med reagens A. Följ de användarvänliga instruktionerna för listmode dataanalysen i hjälpfilen tillleuko64 TM programvaran för vidare detaljer angående analysens negativa och positiva kontroller. OBS: Programmet har kontrollrelaterade flaggor och direktiv. LK64-V11-2013 A4 SV Sidan 5 av 8
t l H Y C HANTERING OCH FÖRVARING Förvara flaskorna upprätt, väl förslutna, vid 2-8C när de inte används. Oöppnade flaskor är stabila fram till det utgångsdatum som anges på varje flaska och analysformulär. Undvik onödiga cykler av uppvärmning och nedkylning eftersom analysen är validerad till trettio (30) eller mindre termiska cykler. Skydda produkten från frost, temperaturer över 30 C eller längre tid i rumstemperatur (18-26 C) eller från långvarig exponering för ljus. VARNING Alla komponenter i denna sats innehåller natriumazid (<0,1% vikt/volym). Denna kemikalie är en giftig och farlig förening i kombination med syror eller metaller. Hanteras varsamt. Lösningar som innehåller natriumazid ska avfallshanteras rätt sätt. KONTROLL AV PRODUKTKVALITET Prestandan och specificiteten av reagenser som ingår i denna sats skall testas med hjälp av Trilliums interna kvalitetskontrollmetoder. Tillverkningen av denna produkt görs med hjälp av kvalitetssystem och riktlinjer för tillverkning och produktion i enlighet med FDA QSR och ISO 13485:2003. PRODUKTBEGRÄNSNINGAR Terapeutisk användning av interferon-gamma, G-CSF, eller andra medel som modulerar det medfödda immunförsvaret, är kända för att påverka uppregleringen av leukocyt CD64 uttryck och kommer därför att påverka tolkningen av analysen. Leuko64 TM analysresultat ska inte användas som enda mått på inflammation hos dessa patienter, men de kan användas för att följa effekten av dessa behandlingar. Anvisningar om korrekt förvaring och hantering av denna produkt samt de prover som skall testas måste följas för optimal prestanda och för att undvika falska eller felaktiga resultat. Ofullständig blandning av reagens C före användning kan ogiltiggöra både alikvoten som har tagits och återstoden av materialet i flaskan. Valet av felaktig instrument protokoll eller batchnummer till kittet när du startar programmet kan leda till en minskning av noggrannheten i listmode dataanalysen. Programmet är batch-specifikt och protokoll för användning är specifika för instrumentmodellerna. Gör rätt urval när du uppmanas att göra det. Varje fil från en allvarligt leukopeniskt eller neutropent blodprov somvisar mindre än 200 WBC händelser som övervakas av Leuko64 TM programmet i någon av de tre kategorierna (PMN, lymfocyter eller monocyter) kan inte analyseras av Leuko64 TM analyskittet utan betydande minskning av noggrannhet och precision av PMN CD64-indexen. LK64-V11-2013 A4 SV Sidan 6 av 8
Alla filer med ett antal pärlhändelser under 1000 bör utvärderas för att fastställa orsaken till det låga antalet pärlor, som kan orsakas av felaktig instrumentinställningar eller av ett outspätt blodprov med ett WBC >25 x 10 9 celler/l. Ibland kan flödescytometri-instrument ha filter som är anordnade i en atypisk konfiguration vari FL1 inte är CD64 FITC-signalen och FL2 är inte CD163 PEsignalen och därigenom kan de äventyra prestandan hos Leuko64 TM programmet. Kontakta din instrumentleverantör och Trillium Diagnostics tekniska support för att få hjälp med att lösa en sådan situation eller problem med använding av programmet. PRESTANDAEGENSKAPER Varje laboratorium bör fastställa ett acceptabelt referensomfång för varje batch av Leuko64 TM. Referensomfånget för PMN CD64-index för friska normala blodprover beräknas vara 1,00. I allmänhet gäller att ju allvarligare den systemiskt akuta inflammatoriska reaktionen är, desto högre PMN (och monocyt) CD64 index-värden kommer att mätas. De förväntade referensomfången för Monocyt CD64 och CD163-index har inte fastställts. REFERENSER 1. Davis BH. Improved diagnostic approaches to infection/sepsis detection. Expert Rev Mol Diag 2005;5:193-207. 2. Schiff D, Rae J, et al. Increased phagocyte CD64 expression and improved Fc-receptor mediated phagocytosis following in vivo recombinant human interferon-ɣ treatment of normal human subjects. Blood 1997;90:2987-94. 3. Petroni KC, Shen L, Guyre PM. Modulation of human polymorphonuclear leukocyte IgG Fc receptors and Fc receptor-mediated functions by IFN-gamma and glucocorticoids. J Immunol 1988;140:3467-72. 4. Davis BH, Bigelow NC, et al. Neutrophil CD64 expression: potential diagnostic indicator of acute inflammation and therapeutic monitor of interferon- therapy. Lab Hematol 1995;1:3-12. 5. Guyre PM, Campbell AS, et al. Monocytes and polymorphonuclear neutrophils of patients with streptococcal pharyngitis express increased numbers of type I IgG Fc receptors. J Clin Invest 1990;86:1892-1. 6. Ng PC, Lam HS. Diagnostic markers for neonatal sepsis. Curr Opin Pediatr 2006;18:125-31. 7. Davis BH, Bigelow NC. Comparison of neutrophil CD64 expression, manual myeloid immaturity counts, and automated hematology analyzer flags as indicators of infection or sepsis. Lab Hematol 2005;11:137-47. 8. Leino L, Sorvajarvi K, et al. Febrile infection changes the expression of IgG Fc receptors and complement receptors in human neutrophils in vivo. Clin Exp Immunol 1997;107:37-43. 9. Davis BH, Olsen S, et al. Neutrophil CD64 is an improved indicator of infection or sepsis in emergency room patients. Arch Pathol Lab Med 2006;130(5):654-61. 10. Van der Meer W, Pickkers P, et al. Hematological indices, inflammatory markers and neutrophil CD64 expression: comparative trends during experimental human endotoxemia. J Endotoxin Res 2007;13:94-100. 11. Groselj M, Ihan A, Derganc M. Neutrophil and monocyte CD64 and CD163 expression in critically ill neonates and children with sepsis: comparison of fluorescence intensity and calculated Indexes. Mediators Inflamm 2008; 2008:202646. 12. Bhandari V, Wang C, et al. Hematologic profile of sepsis in neonates: neutrophil CD64 as a diagnostic marker. Pediatrics 2008;121:129-134. 13. Hoffmann JJ. Neutrophil CD64 as a sepsis biomarker. Biochemica Medica 2011;21:282-90. LK64-V11-2013 A4 SV Sidan 7 av 8
14. Icardi M, Erickson Y, Kilborn S, et al. CD64 Index provides simple and predictive testing for detection and monitiroing of sepsis and bacterial infection in hospital patients. J Clin Microbiol 2009;47:3914-19. 15. US Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration. 29 CFR Parts 1910. 1030, Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens; Final Rule. Federal Register 235:64175-82. 1991. 16. US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication (NIH) 93-8395.Washington: US Government Printing Office. 1993. VARUMÄRKEN Leuko64 TM QuantiCALC programmet är upphovsrättsskyddad och har utvecklats i samarbete med VERITY SOFTWARE HOUSE Topsham, Maine, USA www.vsh.com och, LLC Brewer, Maine, USA www.trilliumdx.com FACSCanto TM och FACScan TM är varumärken som tillhör BD Biosciences San Jose, CA, USA www.bdbiosciences.com Navios TM, Gallios TM Cytomics FC500 TM och XL TM är varumärken som tillhör Beckman Coulter, Inc Brea, CA, USA www.beckman.com Leuko64 TM är ett patenterat analyskit, som omfattas av US patentnr. 8,116,984, japanskt patentnr. 5047803, och EPO-patentansökannr. 05851842.4. KUNDTJÄNST M P Trillium Diagnostics, LLC PO Box 67 Brewer, Maine, USA 04412 Tel. +1 207 945 0900 Fax +1 207 942 0346 Tekniska frågor info@trilliumdx.com Beställningar per telefon, fax eller hemsida på www.trilliumdx.com IQ Products BV Rozenburglaan 13a 9727 DL Groningen, Nederländerna Tel. +31 (0) 50 57 57 000 Fax +31 (0) 50 57 57 002 Tekniska frågor marketing@iqproducts.nl Beställningar orders@iqproducts.nl Hemsida www.iqproducts.nl LK64-V11-2013 A4 SV Sidan 8 av 8