Gemenskapsriktlinjer för god praxis. för. mikrobiologisk klassificering och övervakning. av produktions- och återutläggningsområden för musslor

Gemenskapsriktlinjer för god praxis för mikrobiologisk klassificering och övervakning av produktions- och återutläggningsområden för musslor i enlighet med förordning (EG) nr 854/2004 Utgåva 2, januari 2014

Sida 2 av 39 Revideringshistorik Utgåva Datum för Ändringar utfärdande 1 1 juni 2012 2 13 januari 2014 Ny bilaga 2 med krav för områden godkända för export till USA 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Sida 3 av 39 INNEHÅLL Avsnitt Sida ORDLISTA 4 1 ALLMÄN INLEDNING 7 2 SANITÄRA UNDERSÖKNINGAR 10 3 UPPRÄTTANDE OCH REGISTRERING AV PROVTAGNINGSPLANER 16 4 PROVTAGNING OCH TRANSPORT AV PROVER 19 5 MIKROBIOLOGISK ANALYS 23 6 DATAHANTERING OCH DATALAGRING 25 7 TOLKNING AV DATA FRÅN ÖVERVAKNINGSPROGRAM 26 8 SAMMANFATTNING 33 9 HÄNVISNINGAR 33 10 BILAGA 1 (REKOMMENDERADE FREKVENSER OSV.) 35 11 BILAGA 2 UTÖKADE KRAV FÖR PRODUKTIONSOMRÅDEN FRÅN VILKA LEVANDE MUSSLOR TAS UPP FÖR EXPORT TILL USA 36 Tabeller Tabell 1 Kriterier för klassificering av upptagningsområden för musslor 8 Tabell 2 Exempel på provinlämningsformulär 21 Figurer Figur 1 Översikt över viktiga faser i det offentliga kontrollprogrammet för musslor 9 Figur 2 Sanitär undersökning inledande sanitär undersökning och framtagning 11 av provtagningsplan Figur 3 Översyn av sanitär undersökning och provtagningsplan 15 Figur 4 Tolkning av data för klassificering av upptagningsområden 28 Figur 5 Varningsförfarande exempel på flödesschema 32

Sida 4 av 39 ORDLISTA Vattenbruk Bakteriologisk undersökning Mussla Klassificering av upptagningsområden för musslor Klassificering (fastställd) Klassificering (inledande) Koliform Bräddavlopp på kombinerat avloppssystem Behörig myndighet Nödbräddavlopp Enterovirus Uppfödning eller odling av vattenlevande organismer där tekniker används i syfte att utöver den aktuella miljöns naturliga kapacitet att öka produktionen av organismerna i fråga. Organismerna förblir under hela uppfödnings- eller odlingsfasen och fram till och med skörden en fysisk eller juridisk persons egendom (förordning (EG) nr 2792/1999). 1 Övervakning under kortare tidsperiod i syfte att underlätta valet av placering av provtagningspunkter för klassificerings- och övervakningsprogrammet. Undersökningen genomförs vanligtvis på ett större antal platser än vad som senare används i programmet. 2 Blötdjur med lamellförgrenade gälar som livnär sig genom filtrering, och även tagghudingar, manteldjur och marina snäckor. 1,3 Indelning av upptagningsområden i olika klasser enligt ett offentligt program för att fastställa omfattningen av mikrobiologiska föroreningar i produktions- och återutläggningsområden. Kraven fastställs i bilaga II, kapitel II till förordning (EG) nr 854/2004. 2 Offentlig klassificering fastställd utifrån resultaten från ett stort antal provtagningar för att säkerställa att fullständig hänsyn har tagits till potentiella årstidsbundna och årliga variationer. 2 Offentlig klassificering fastställd utifrån resultaten av ett begränsat antal provtagningar. 2 Gramnegativ, fakultativt anaerob, stavformig bakterie som jäser laktos för att producera syra och gas vid en temperatur av 37 C. Denna sorts bakterier återfinns vanligtvis i varmblodiga djurs tarmsystem men kan också påträffas i miljön (t.ex. på växtmaterial och jord). 2 System för att tillåta avledning av avloppsvatten (vanligtvis utspätt, orenat vatten) från ett avloppssystem vid kraftigt regn. Genom bräddavloppet undviker man att alltför stora vattenflöden når avloppsrör eller reningsverk, vilket gör det möjligt att undvika överbelastning, vattenskador på byggnader osv. 2 Den centrala myndighet i en medlemsstat som har ansvar för att organisera de offentliga kontrollerna, eller en annan myndighet som har förlänats detta ansvar. I tillämpliga fall omfattar definitionen också motsvarande myndighet i ett tredjeland. 1 System för att tillåta avledning av avloppsvatten (vanligtvis obehandlat) från ett avloppssystem eller reningsverk om utrustning slutar att fungera. 2 En grupp obesläktade virus som har det gemensamma draget att spridas genom den fekal-orala smittvägen. Gruppen omfattar bl.a. norovirus och hepatit A-virus. 2 1 Definition från EU-lagstiftning. 2 Kompletterande definition. 3 Lagstiftningens krav för musslor, med undantag av bestämmelserna om rening, gäller även för levande tagghudingar, manteldjur och marina snäckor. Bestämmelser om klassificering av produktionsområden gäller inte för marina snäckor som inte är filtrerare.

Sida 5 av 39 Escherichia coli (E. coli) Fekala koliformer Kött och intravalvulär vätska Geografiskt informationssystem (GIS) Upptagningsområde Hepatit A-virus Hydrodynamiska modeller Norovirus Offentlig kontroll Partikeltransportmod eller Produktionsområde Återutläggningsområde Fekal koliform bakterie som också bildar indol ur tryptofan vid en temperatur på 44 C ± 0,2 C inom 24 timmar. 1,4 Fakultativt aeroba, gramnegativa, icke sporbildande, cytokromoxidasnegativa, stavformiga bakterier som vid 44 C ± 0,2 C inom 24 timmar jäser laktos med gasbildning vid närvaro av gallsalter eller andra ytaktiva ämnen med samma tillväxthämmande egenskaper. 1,5 En musslas muskler, kropp och organ samt vätskan som finns kvar innanför skalen då djuret är stängt och inte befinner sig i vatten. 2 Datorbaserat system som kombinerar kartläggning och datalagring för att lagra, manipulera, analysera, presentera och tolka geografiska referensdata. 2 Termen upptagningsområde omfattar i dessa riktlinjer både produktions- och återutläggningsområden. 2 Ett virus med 27 nm diameter med nukleinsyran RNA. Viruset sprids via den fekal-orala smittvägen, och trots att de flesta infektioner visar sig som tydliga eller milda feberepisoder kan de också orsaka leverinflammation som leder till gulsot. 2 I dessa riktlinjer menas med detta numeriska modeller som efterliknar havsvattnets rörelser, dvs. hastigheter och vattendjup som funktioner av tid och rymd. Data från dessa modeller kan sedan användas tillsammans med en representation av diffusionsprocesser i vattenstapeln (se Partikeltransportmodeller nedan) för att visa bakteriers livscykel och dispersion. 2 Norovirus är små, 27 32 nm, strukturerade RNA-virus som tros vara den vanligaste orsaken till utbrott av icke-bakteriell gastroenterit. (De har tidigare kallats norwalkliknande eller små runda virus.) 2 Varje form av kontroll som utförs av den behöriga myndigheten eller av EU i syfte att kontrollera efterlevnaden av foder- och livsmedelslagstiftningen samt bestämmelserna om djurhälsa och djurskydd. 1 I dessa riktlinjer menas med partikeltransportmodeller modeller som visar diffusionen (spridningen) hos lösta eller suspenderade ämnen i havsvatten. De kan användas för att upprätta modeller över bakteriekoncentrationer. 2 Varje område i hav, i anslutning till flodmynning eller lagun som utgör en naturlig fyndplats för musslor eller område som används för odling av musslor och från vilket levande musslor tas upp. 1 Varje område i hav, i anslutning till flodmynning eller lagun som har klart markerade gränser, angivna med bojar, stolpar eller annan fast anordning, och som används uteslutande för naturlig rening av levande musslor. 1 1 Definition från EU-lagstiftning. 2 Kompletterande definition. 4 E. coli ingår i bakteriegruppen fekala koliformer. Den är mer specifikt förknippad med varmblodiga djurs och fåglars tarmar än andra bakterier i samma grupp. E. coli identifieras i referensmetoden genom förekomst av betaglukoronidas. 5 Den återfinns oftast, men inte enbart, i tarmarna hos varmblodiga djur och fåglar.

Sida 6 av 39 Avlägset område Representativ provtagningspunkt Provtagningsplan Sanitär undersökning Avloppsvatten Ett område som inte påverkas av några fekala föroreningar från människor eller djur och där övervakningsdata är stabila. 2 Specifik geografisk plats varifrån prov tas för att representera antingen en enda eller flera fyndplatser för vilda musslor eller vattenbruksplatser. Den ska representera den plats i det klassificerade området där risken för fekal förorening är högst. 2 I dessa riktlinjer menas med provtagare en person som tar prover på musslor i ett upptagningsområde (eller från upptagna musslor) i syfte att utföra offentliga kontroller i enlighet med förordning (EG) nr 854/2004. En provtagningstjänsteman är en provtagare som är direkt anställd av den behöriga myndigheten eller ett annat kontrollorgan som har förlänats ansvaret för den offentliga provtagningen i kontrollsyfte. 2 Formellt register över planerad provtagning i ett upptagningsområde med angivelse av arter, representativa provtagningspunkter och provtagningsfrekvenser. Vilka uppgifter som ska ingå i provtagningsplanen fastställs efter den sanitära undersökningen. 2 Utvärdering av källorna till fekal förorening i eller nära ett upptagningsområde samt en utvärdering av dessa källors potentiella påverkan på upptagningsområdets mikrobiella status. 2 Vätska i ett avloppsrör, eller som tidigare har funnits i ett avloppsrör. Den består av vattenburet avfall från hem, handelslokaler och industrianläggningar samt regnvatten från den undre delen av jordmånen och ytvatten. 2 Avloppsreningsverk Anläggning för rening av avloppsvatten från hem och handelslokaler. Kallas ibland bara reningsverk. 2 Avlopp Rör för transport av avloppsvatten. 2 Avloppssystem Provtagare/provtagningstjänsteman Strandlinjeundersökning Tillfälliga kontroller System med sammankopplade avlopp, ofta med inbyggda, mellanliggande pumpstationer. 2 Fysisk undersökning av strandlinjen och området som gränsar till upptagningsområdet för att identifiera eventuella föroreningskällor som identifierats i en skrivbordsstudie samt för att upptäcka ytterligare potentiella källor till föroreningar. 2 Kontrollåtgärder som vidtas för att minska eller avhjälpa en ökad folkhälsorisk som kan uppkomma från en tillfällig ökning av föroreningarna i ett upptagningsområde. Åtgärderna omfattar förbud mot upptagning, tillfällig omklassificering och ökade behandlingskrav utan omklassificering. Kontrollåtgärderna ska åtgärda risker för folkhälsan (t.ex. från patogener från avloppsvatten) och inte enbart de indikatorbakterier som används i övervakningssyfte. 2 1 Definition från EU-lagstiftning. 2 Kompletterande definition.

Sida 7 av 39 1. ALLMÄN INLEDNING Fisk och skaldjur kan allmänt anses vara en säker, hälsosam och näringsrik livsmedelsgrupp. Konsumtion av råa eller otillräckligt tillagade filtrerande musslor som befunnit sig i vatten som innehåller fekala föroreningar kan emellertid orsaka sjukdomar, eftersom de kan innehålla skadliga mikroorganismer. Förr i tiden förknippades musslor med tyfoidfeber och paratyfoidfeber, men dessa sjukdomar är numera sällsynta i utvecklade länder. Gastroenterit i samband med konsumtion av musslor som orsakas av salmonellabakterier som varken är tyfoida eller paratyfoida förekommer i sällsynta fall, men sjukdomar orsakade av virus, såsom norovirus (som orsakar gastroenterit) och hepatit A (som orsakar smittsam gulsot), är numera de vanligaste infektionerna från förorenade musslor. Avföring från både människor och djur kan vara en källa till patogener som sedan kan överföras till människor via förorenade musslor. Mänsklig avföring är generellt sett den största riskfaktorn, men flera patogener med förmåga att infektera människor kan förekomma i djurs avföring. För närvarande finns inte tillräckliga bevis som stöder en behandling av dessa två smittkällor som åtskilda. Genom att undersöka olika källor till och typer av fekala föroreningar (från människor och djur) i närheten av upptagningsområden, i kombination med mikrobiologisk övervakning med hjälp av indikatororganismer (Escherichia coli i EU) kan man bedöma risken för förorening från bakteriella och virala patogener. Bedömningen utgör grunden för folkhälsomotiverade kontroller. I EU är det den behöriga myndigheten som har ansvar för att utveckla och tillämpa program för offentlig klassificering och övervakning. Kraven för denna verksamhet fastställs i bilaga II till förordning (EG) nr 854/2004, som innehåller särskilda bestämmelser för genomförandet av offentlig kontroll av produkter av animaliskt ursprung avsedda att användas som livsmedel. Motsvarande krav för industrin finns i förordning (EG) nr 853/2004 om fastställande av särskilda hygienregler för livsmedel av animaliskt ursprung. Områden klassificeras utifrån bedömningen som görs vid den offentliga kontrollen, och klassificeringen avgör huruvida musslor får tas upp från ett visst område och i vilken utsträckning behandling efter upptagandet krävs för att minska hälsoriskerna till en acceptabel nivå. Klassificeringskriterierna i förordning (EG) nr 854/2004 och, via hänvisning, i kommissionens förordning om mikrobiologiska kriterier för livsmedel, visas i tabell 1. Genom pågående övervakning fastställs huruvida risken har ändrats, och om tillfälliga kontroller därför är nödvändiga, eller huruvida klassificeringsstatusen har ändrats. Dessa riktlinjer tar upp de offentliga kontroller som genomförs i detta syfte. Man bör notera att musslornas upptagnings- och reningstakt för de bakterier som används som indikatorer (t.ex. E. coli) skiljer sig från upptagnings- och reningstakten i samband med vissa patogener (särskilt virala sådana), och därför kan man inte anta att individuella E. coli-resultat ger en indikation om den allmänna risken för förorening med patogener. I likhet med rutinerna för andra livsmedel, används därför förebyggande system för EU-kontrollerna (HACCP-systemet med faroanalys och kritiska styrpunkter) i stället för utsläppande av upptagna partier på grundval av mikrobiologisk analys. Analysen av partier vid mottagandet i en renings- eller leveransanläggning utgör en kompletterande kontroll av den mikrobiologiska kvaliteten, men den ersätter inte behovet av ett korrekt genomfört, offentligt kontrollprogram för klassificering och övervakning. Det är de behöriga myndigheterna i varje land som ansvarar för genomförandet av klassificerings- och övervakningsprogrammen i enlighet med förordning (EG) nr 854/2004, och de kan därför skilja sig åt mellan medlemsstaterna. Den behöriga myndigheten kan delegera vissa arbetsuppgifter till ett särskilt utsett kontrollorgan på villkor att vissa garantier (som fastställs i förordning (EG) nr 882/2004) uppfylls och att kommissionen meddelas. De huvudsakliga faser som en behörig myndighet ska gå igenom vid upprättandet och genomförandet av ett offentligt kontrollprogram för mikrobiologisk klassificering och övervakning av produktionsområden för musslor visas i figur 1. De olika faserna behandlas mer ingående i riktlinjernas olika kapitel. Det övergripande syftet med dessa gemenskapsriktlinjer är att hjälpa de behöriga myndigheterna att genomföra vetenskapligt underbyggda program för att skydda folkhälsan och främja handeln på EU:s inre marknad.

Sida 8 av 39 Tabell 1. Kriterier för klassificering av upptagningsområden för musslor Kategori 1 Mikrobiologisk standard 2 A Levande musslor från dessa områden får inte överskrida gränsen 230 MPN E. coli per 100 g kött och intravalvulär vätska. 3 B Hos levande musslor från dessa områden får i 90 % av proven gränsvärdet 4 600 MPN E. coli per 100 g kött och intravalvulär vätska inte överskridas. I resterande 10 % av proven får hos levande musslor gränsvärdet 46 000 MPN E. coli per 100 g kött och intravalvulär vätska inte överskridas. 4 C Levande musslor från dessa områden får inte överskrida gränsen för ett MPN-femrörstest med tre utspädningar på 46 000 MPN E. coli per 100 g kött och intravalvulär vätska. 5 Behandling efter upptagning som krävs för att minska mikrobiologisk förorening Ingen Rening, återutläggning eller kokning med en godkänd metod Återutläggning eller kokning med en godkänd metod 1 En behörig myndighet kan förbjuda all produktion och upptagning av musslor i områden som anses olämpliga av hälsoskäl. 2 Referensmetoden är ISO TS 16649-3. 3 Genom hänvisning från förordning (EG) nr 854/2004, via förordning (EG) nr 853/2004 till förordning (EG) nr 2073/2005. 4 Från förordning (EG) nr 854/2004, ändrad genom förordning (EG) nr 1021/2008. 5 Från förordning (EG) nr 854/2004. Riktlinjerna bygger på befintlig vetenskap och erfarenheter från genomförandet av praktiska övervakningsprogram enligt förordning (EG) nr 854/2004. De kommer att behöva ses över regelbundet för att ta hänsyn till nya erfarenheter som tillkommer vid deras tillämpning, och för att uppdateras med nya vetenskapliga rön eller ändringar i lagstiftningen. Vid översynen bör man särskilt ta hänsyn till nya kunskaper om sambandet mellan indikatorbakterien (E. coli) och andra relevanta patogener (t.ex. norovirus, hepatit A-virus och salmonella) och till viktiga aspekter för utformningen av övervakningsprogram, t.ex. riskförutsägelse, provtagningsmetoder, variationer i rum och tid och behandlingsmetoders effektivitet. EU:s referenslaboratorium för övervakning av bakteriologisk och viral kontamination av musslor har publicerat kompletterande tekniska riktlinjer (Anon 2013) som också kan fungera som vägledning för behöriga myndigheter och andra aktörer.

Figur 1. Översikt över viktiga faser i det offentliga kontrollprogrammet för musslor Sida 9 av 39 Nytt upptagningsområde anmäls till behörig myndighet 1 Sanitär undersökning Fastställande av rep. provtagningsplatser + provtagningsplan Nej Fastställande av klassificering för upptagningsområdet Sanitär undersökning gjord för området? Ja Fortgående offentliga kontroller Befintligt klassificerat upptagningsområde (klassificerat före 2006) 2 Översyn av resultat (fortgående och formell regelbunden) Orosmoment 3 åtgärdat/ersatt Några direkta orosmoment? Ja Vidta tillfälliga kontrollåtgärder Nej Upp- eller nedgradera klassificeringen Nej Uppfyller området klassificeringskraven? 1 Av livsmedelsföretagare eller annan intressent. 2 I dessa riktlinjer rekommenderas att alla områden genomgår en sanitär undersökning senast januari 2015. 3 Sjukdomsutbrott hos människor, föroreningsepisod, avvikande resultat. Ja Regelbunden översyn av sanitär undersökning (om gjord) och provtagningsplan

Sida 10 av 39 2. SANITÄRA UNDERSÖKNINGAR 2.1 Inledning Sanitära undersökningar omfattar identifiering av potentiella källor till fekal förorening av upptagningsområden för musslor och en bedömning av dessa källors förväntade påverkan på musselodlingens mikrobiologiska kvalitet. Den sanitära undersökningen är det första steget i att upprätta ett mikrobiologiskt övervakningsprogram för ett produktionsområde och ger en översikt över påverkan från föroreningar och därmed en vetenskaplig grund för fastställande av representativa provtagningspunkter och en provtagningsplan. Det finns många potentiella källor till fekala föroreningar, såsom utsläpp av avloppsvatten (kontinuerliga eller tillfälliga), lantbruksdjur, vilda djur och sjöfart. Effekternas omfattning bestäms av hur mycket smittkällan späs ut i det mottagande vattnet och av huruvida strömmarna bär föroreningarna i riktning mot, eller bort från, musselodlingen. Avföring från både människor och djur kan vara en källa till patogener som sedan kan överföras till människor via förorenade musslor. Mänsklig avföring är generellt sett den största riskfaktorn, men flera patogener med förmåga att infektera människor kan förekomma i djurs avföring. För närvarande finns inte tillräckliga bevis för att behandla dessa två smittkällor på olika sätt. Man bör använda så mycket information som möjligt från befintliga dataset och andra myndigheter för att minimera resursåtgången. Strandlinjeundersökningar ska göras för att fastställa om alla viktiga föroreningskällor har upptäckts i de dataset som redan finns tillgängliga, och om de tidigare identifierade källorna kvarstår. Ett områdes vattendjup och strömmar spelar in på utspädningen av föroreningarna, vilket i sin tur avgör hur stor påverkan de får på musselodlingar i närheten. Dessa faktorer har stor effekt på nivån av mikrobiologiska föroreningar i musslorna, och strömmarna bestämmer också i stor utsträckning hur denna förändras med tiden (p.g.a. tidvatten- och vindeffekter osv.). Det är därför viktigt att man har kunskap om dessa faktorer vid tolkningen av den information om föroreningskällor som samlats in vid den sanitära undersökningen. Det är svårt att göra kvalitativa eller kvantitativa bedömningar av föroreningskällornas inverkan, eftersom denna kan påverkas av ett stort antal faktorer. Även efter en sanitär undersökning kan det vara oklart var man bör placera de representativa provtagningspunkterna. En kortare bakteriologisk undersökning av ett flertal potentiella provtagningspunkter kan ge den information som behövs. Prov måste tas vid ett flertal tillfällen för att återspegla olika väderförhållanden (t.ex. under springflod och nipflod, perioder med vått/torrt väder osv.). Föroreningskällorna i ett område kan förändras över tid, t.ex. till följd av förbättrad rening av avloppsvatten eller nya jordbruksmetoder. Därför bör informationen, och de rekommendationer som grundas på denna, inbegripet provtagningsplaner, ses över regelbundet. 2.2 Krav I förordning (EG) nr 854/2004, bilaga II, kapitel II, A 6, fastställs att om den behöriga myndigheten fattar ett principbeslut om att klassificera ett produktions- eller återutläggningsområde skall den a) göra en inventering av de källor till förorening från människor eller djur som kan komma att kontaminera produktionsområdet, b) undersöka mängden organiska föroreningar som släpps ut under olika tider på året och relatera dem till bland annat säsongsvariationerna i fråga om folkmängd och antal djur i omgivningen, regnmängden och reningen av avfallsvatten,

Sida 11 av 39 c) bestämma föroreningarnas rörelsemönster genom batymetri samt genom kartläggning av strömmarna och tidvattencykeln i upptagningsområdet. Den sanitära undersökningen ska omfatta samtliga faktorer i leden a c ovan. I andra delar av förordningen sägs det att den sanitära undersökningen ska påverka utformningen av provtagningsplanen (se avsnitt 3). De olika stegen i genomförandet av en inledande sanitär undersökning visas i figur 2. Figur 2. Sanitär undersökning inledande sanitär undersökning och framtagning av provtagningsplan Nytt upptagningsområde anmäls till behörig myndighet 1 Inledande skrivbordsstudie Strandlinjeundersökning Provtagning och analys Ja Krävs bakteriologisk undersökning? Nej Tolkning av resultat Inledande rapport från sanitär undersökning Fastställande, registrering och tillämpning av provtagningsplan 1 Av livsmedelsföretagare eller annan intressent.

Sida 12 av 39 2.3 Rekommendationer Även om bestämmelserna i förordning (EG) nr 854/2004 bara är formellt tillämpliga på områden som klassificerats efter den 1 januari 2006 eller på befintliga klassificerade områden som omklassificeras (dvs. som upp- eller nedgraderas) (råd från Europeiska kommissionen), rekommenderas det att de behöriga myndigheterna upprättar ett program med sanitära undersökningar av alla befintliga områden, detta för att övervakningsprogrammen skall genomföras på likvärdigt sätt för samtliga klassificerade upptagningsområden. Programmet bör stå färdigt i januari 2015. Producenter och anknutna organisationer kan hjälpa den behöriga myndigheten att genomföra sanitära undersökningar. 2.3.1 Den sanitära undersökningens innehåll Undersökningen bör bestå av följande delar: Skrivbordsstudie. Strandlinjeundersökning. Batymetri/hydrodynamik. Bakteriologisk undersökning. ANMÄRKNING: Flera av dessa delar kan pågå parallellt, vilket förkortar den tid som krävs för att genomföra den sanitära undersökningen. 2.3.2 Skrivbordsstudie Denna studie bör ta upp följande: Beskrivning av musselodlingarna. Information om potentiella föroreningskällor. o Kontinuerliga avloppsutsläpp (inbegripet handelsrelaterade utsläpp med betydande innehåll av avloppsvatten). o Avloppsutsläpp i samband med regn (bräddavlopp för kombinerade avloppssystem eller dagvattenmagasin) och andra regnberoende utsläpp (dagvattenutsläpp). o Utsläpp i nödfall (t.ex. vid pumpfel i reningsverk). o Markanvändning. o Lantbruksdjur. o Vilda djur. o Fartyg och båtar. o Årstidsbundna variationer för ovannämnda faktorer (gödsling, turism, lantbruksdjur osv.). 2.3.3 Strandlinjeundersökning Denna bör ha följande mål: Bekräfta den information som samlats in om musselodlingens placering och omfattning. Bekräfta den information som samlats in om placering och typ för potentiella källor till förorening. Identifiera ytterligare potentiella föroreningskällor. o Om möjligt bör prover för E. coli-analys tas från alla tidigare oidentifierade utsläppsplatser för avloppsvatten eller ytvatten, alla vattendrag med utlopp nära upptagningsområden, musslor från platser nära de potentiella källorna till förorening. Anmärkning: Det är inte säkert att alla föroreningskällor kan identifieras under en enda undersökning p.g.a. årstidsbundna faktorer, regnfallsrelaterade utsläpp.

Sida 13 av 39 ANMÄRKNING: Metoderna för analys av sötvatten, saltvatten och sediment omfattas inte livsmedelslagstiftning. av EU:s 2.3.4 Batymetri/hydrodynamik Denna del kan bestå av en eller flera av nedanstående element: Hur komplex denna del av undersökningen behöver vara beror på lokala förhållanden, inbegripet förekomsten av betydande potentiella källor till fekala föroreningar, hur nära musselodlingarna dessa befinner sig och områdets hydrodynamiska egenskaper. Hänvisningar till hydrografiska kartor. Hänvisningar till tidvattenkartor/programvara som visar tidvattenströmmar. Enkla hydrodynamiska modeller. Mer komplexa hydrodynamiska modeller. Alternativa eller kompletterande metoder som o uppskattning av utspädningsgrad (kan inkludera resultat från dosering av färgämnen eller studier av salthalten), o studier av spårämnen. 2.3.5 Bakteriologisk undersökning En bakteriologisk undersökning bör genomföras i följande fall: Om det inte står klart var man bör placera en eller flera representativa provtagningspunkter efter att skrivbordsstudie och strandlinjeundersökning genomförts. Undersökningen görs på följande sätt: o Ett antal potentiella platser identifieras med hjälp av resultaten från skrivbordsstudien och strandlinjeundersökningen. o Minst tre prov tas på varje plats, med minst två veckors mellanrum, och testas för E. coli. o För ytterligare information kan prov från havsvatten och/eller ytsediment tas, utöver prov från musslor. o Provtagningen ska betona förhållanden som anses öka risken för förorening av musslor i det aktuella området (t.ex. regn eller särskilda tidvattenförhållanden). o Resultatens geometriska medelvärde och variationsbredd beräknas och registreras tillsammans med rådatan. o Den eller de provtagningspunkter som uppvisar högst toppkoncentrationer av E. coli inkluderas i övervakningsprogrammet. o Om toppkoncentrationerna är likartade väljs den eller de platser med det högsta geometriska medelvärdet för E. coli-koncentration. 2.3.6 Analys av historiska mikrobiologiska data Denna analys bör genomföras i följande fall: Då historiska mikrobiologiska data från angränsande eller närbelägna områden finns tillgängliga. Analysen kan bidra till den övergripande bedömningen och rekommendationerna i den sanitära undersökningen, men dess resultat får inte prioriteras högre än undersökningens övriga delar. Undersökningen görs på följande sätt: o Hänsyn ska tas till geografisk och tidsrelaterad (inbegripet årstidsbunden) variation. o Om tillräckliga uppgifter finns tillgängliga kan statistiska analyser göras, för att undersöka olika miljöfaktorers inverkan. o Man bör vinnlägga sig om att hänsyn tas till dessa analyser då man sammanställer resultaten av den sanitära undersökningen.

Sida 14 av 39 2.3.7 Bedömning av data från den sanitära undersökningen Detta kan göras på en av följande tre nivåer, beroende på tillgängliga data och den lokala situationen: Kvalitativ bedömning o Varje potentiell föroreningskälla bör bedömas utifrån sin potential att påverka musselodlingens mikrobiologiska kvalitet. Semikvantitativ bedömning o För varje potentiell föroreningskälla görs en relativ bedömning av hur den kommer att påverka musselodlingens mikrobiologiska kvalitet. Kvantitativ bedömning o Denna görs då en källas påverkan inte kan uteslutas efter en kvalitativ bedömning. o Bedömningen görs vanligtvis med hjälp av kvantitativa modeller. 2.3.8 Innehåll i rapporten om den sanitära undersökningen Rapporten ska åtminstone innehålla information om följande: Översikt över musselodlingen. Odlingsverksamhet. o Placering och omfattning. o Musselarter. o Vattenbruk eller vilda musselbankar. o Produktionsområde eller återutläggningsområde. o Upptagningsperiod. o Upptagningsteknik. o Eventuella naturskyddsåtgärder. Placering, storlek och behandlingsnivå för mänskliga källor till förorening. Placering och uppskattad volym/belastning för jordbruksrelaterade källor till förorening. Betydande bestånd av vilda djur/fåglar. Kartor och årstidsbundna effekter för dessa faktorer. Dokumentation om strandlinjeundersökningar. Hydrografi/hydrodynamik. Dokumentation om resultat från bakteriologiska undersökningar. Bedömning av föroreningarnas inverkan på skaldjur. Rekommenderad provtagningsplan (se avsnitt 3) En rekommendation om produktionsområdets storlek (geografiska gränser). Eventuella ytterligare upplysningar om källor som kan påverka situationen. Rekommenderad klassificering (om tillräckliga uppgifter finns tillgängliga, se avsnitt 7.3.1). 2.3.9 Översyn Den sanitära undersökningens innehåll och slutsatser bör ses över regelbundet. De olika stegen i översynen av en sanitär undersökning visas i figur 3. 2.4 Resultat Efter den sanitära undersökningen bör den behöriga myndigheten ha en grundlig förståelse för det föreslagna upptagningsområdet och de källor till fekala föroreningar som påverkar området. Med hjälp av detta bör myndigheten kunna godkänna representativa provtagningspunkter och provtagningsplaner.

Sida 15 av 39 Figur 3. Översyn av sanitär undersökning och provtagningsplan Fastställd period avslutad eller viktiga förändringar upptäckta vid fortgående kontroll/översyn Skrivbordsöversyn av sanitär undersökning, översyn av rapporter och data Gör och utvärdera ny strandlinjeundersökning Ja Ny strandlinjeundersökning nödvändig? Nej Fullfölj översynen Översyn av provtagningsplan Ja Krävs översyn av provtagnings planen? Nej Skriv rapport och tillämpa provtagningsplan

Sida 16 av 39 3. UPPRÄTTANDE OCH REGISTRERING AV PROVTAGNINGSPLANER 3.1 Inledning För att man effektivt ska kunna skydda folkhälsan krävs representativa resultat från mikrobiologiska övervakningsprogram. Viktiga faktorer för utformningen och genomförandet av ett effektivt program är urvalet av arter som undersöks, placeringen av de representativa provtagningspunkterna (främst i relation till föroreningskällor), provtagningsfrekvens, tidpunkt för provtagning (främst i förhållande till miljörelaterade variabler) och det sätt på vilket data bedöms (tidsperiod, tillåten tolerans). Om dessa faktorer inte behandlas på ett lämpligt sätt kan resultatet bli orepresentativa dataset, vilket i sin tur kan leda till olämpliga klassificeringsbeslut. Provtagningsplanen är ett formellt dokument över planerad provtagning i ett upptagningsområde där det anges vilka arter som berörs, vilka platser som används som representativa provtagningspunkter och vilken frekvens som kommer att tillämpas för provtagningen. Vilka uppgifter som ska ingå i provtagningsplanen fastställs efter den sanitära undersökningen. Ytterligare information, t.ex. ansvarig myndighet och vilken/vilka person(er) som utsetts till provtagare måste också anges, för att garantera att provtagningen genomförs som planerat. En provtagningsplan är alltid en avvägning mellan den vetenskapliga bedömningen av vilka krav som måste uppfyllas för att nivån av mikrobiologisk förorening i ett upptagningsområde ska kunna återspeglas korrekt (i avsikt att skydda folkhälsan) och de praktiska aspekterna när det gäller att samla in, transportera och analysera proverna. Denna avvägning måste beaktas vid tolkningen av erhållna uppgifter (se avsnitt 7). Alla de som deltar i ett mikrobiologiskt övervakningsprogram måste känna till provtagningsplanerna för den del/de delar av projektet som de själva är inblandade i, detta för att arbetet ska kunna genomföras på ett tillfredsställande sätt. Det är dock bara möjligt om planerna blir formellt registrerade och görs tillgängliga för alla berörda parter. Planerna är också ett sätt att kontrollera huruvida den övervakning som faktiskt genomförs lever upp till förväntningarna. 3.2 Krav Förordning (EG) nr 854/2004, bilaga II, kapitel II, A 6: Om den behöriga myndigheten fattar ett principbeslut om att klassificera ett produktions- eller återutläggningsområde skall den d) upprätta ett provtagningsprogram för musslor i produktionsområdet. Programmet skall bygga på granskning av kända data och av ett antal prover, med en geografisk spridning av provtagningspunkterna och en provtagningsfrekvens som ger ett så representativt urval som möjligt för analysen av produktionsområdet. Förordning (EG) nr 854/2004, bilaga II, kapitel II, B 1: Klassificerade återutläggnings- och produktionsområden skall övervakas regelbundet för att kontrollera b) de levande musslornas mikrobiologiska status i relation till produktions- och återutläggningsområdena. Förordning (EG) nr 854/2004, bilaga II, kapitel II, B 2: För att tillämpa punkt 1 b skall det upprättas provtagningsplaner för kontroller med jämna mellanrum eller, i händelse av oregelbundna upptagningsperioder, från fall till fall. Den geografiska spridningen av provtagningspunkterna och provtagningsfrekvensen måste ge ett så representativt urval som möjligt för analysen av produktionsområdet.

Sida 17 av 39 Förordning (EG) nr 854/2004, bilaga II, kapitel II, B 3: Provtagningsplanerna för kontroll av de levande musslornas mikrobiologiska status måste ta särskild hänsyn till och a) sannolika variationer av halterna av fekal förorening, b) de faktorer som avses i punkt 6 i del A. 3.3 Rekommendationer Syftet med lagstiftningen är att säkerställa att provtagningsplanerna och de mikrobiologiska data som framkommer under provtagningen är så representativa som möjligt för det övervakade området. Rekommendationerna nedan kan hjälpa behöriga myndigheter att uppfylla kraven genom ett systematiskt, vetenskapligt tillvägagångssätt. En provtagningsplan bör bestå av följande delar: 3.3.1 Information att inkludera i provtagningsplanen Provtagningsplanen ska innehålla följande uppgifter: De musselarter som provtagningen gäller. De representativa provtagningspunkternas placering och antal. o Dessa bör grundas på resultaten av den sanitära undersökningen. o När det gäller områden i havet (längre än 5 km från kusten) som (enligt den sanitära undersökningen) inte påverkas av särskilda utsläppspunkter är det möjligt att använda slumpmässigt utvalda provtagningspunkter inom det klassificerade området. Geografiska angivelser för de representativa provtagningspunkterna. o Dessa ska vara tillräckligt exakta. Provtagningsdjup. o Detta anges i relevanta fall (t.ex. för musslor som odlas på rep eller träpålar). o Provet ska tas på det djup där koncentrationen av E. coli är som högst. Provtagningsfrekvens. o Klassificering (inledande) Områdena ska övervakas med hög frekvens a som tillåter en relativt snabb bedömning av klassificeringsstatus. Proven ska inte tas så tätt på varandra att det uppstår korrelation mellan resultaten. Provtagningen ska göras under en tillräckligt stor del av året för att kortvariga och årstidsbundna variationer ska kunna återspeglas. o Klassificering (fastställd) Övervakningen ska fortgå med hög frekvens b tills tillräckliga mängder data har samlats in om inverkan från årstidsbundna variationer. Den fortgående övervakningen ska vara tillräckligt omfattande c för att man ska kunna upptäcka fluktuationer i E. coli-nivåer. o Stabila områden Områden som betecknas som stabila d vad gäller E. coli-resultat kan övervakas mindre ofta. Den tid på året som provtagningen pågår, i de fall det föreligger tydliga årstidsbundna mönster i affärsverksamheten. o Övervakning kan i vissa fall genomföras bara under vissa perioder på året. o Övervakningen ska påbörjas före upptagningsperioden för att den ska återspegla områdets aktuella mikrobiologiska status.

Sida 18 av 39 Tidpunkt för provtagning. o Denna ska fastställas med hänsyn till faktorer som kan påverka provets mikrobiologiska kvalitet. 3.3.2 Fastställande av tidpunkt för provtagning i återutläggningsområden Tillräcklig tid e bör förflyta från det att musslorna placeras i återutläggningsområdet till det att provtagningen påbörjas, för att djuren ska ha tid på sig att assimileras till områdets mikrobiologiska kvalitet. 3.3.3 Registrering av provtagningsplaner Planerna ska registreras och innehålla följande information: Produktionsområde. Produktionsplatsens namn. Identifieringsinformation för produktionsplatsen. Musselarter. Geografisk placering (rutnätsreferens och/eller latitud/longitud). Högsta tillåtna avstånd från en angiven provtagningspunkt. Provtagningsdjup (i tillämpliga fall). Provtagningsfrekvens. Ansvarig myndighet. Auktoriserade provtagare: namn och referensnummer. Annan relevant information. 3.4 Resultat Då denna del av arbetet är avslutat bör den behöriga myndigheten ha kännedom om de praktiska faktorer som påverkar upprättandet av en vetenskapligt underbyggd provtagningsplan och bör också ha införlivat dessa i ett formellt register över provtagningsplaner.

Sida 19 av 39 4. PROVTAGNING OCH TRANSPORT AV PROVER 4.1 Inledning Vid genomförandet av de offentliga mikrobiologiska kontrollerna av upptagningsområden måste musslor tas från den fastställda representativa provtagningspunkten (enligt provtagningsplanen). Detta måste göras under lämpliga kontrollerade förhållanden för att man ska kunna vara säker på att resultaten blir representativa. På vissa musselodlingar kan provtagningen behöva utföras med hjälp av en båt. Förpackningsmetod, temperaturkontroll under transporten och den tid som förflyter mellan provtagning och analys är också viktiga faktorer. Både provtagningen och transporten av proverna måste planeras noggrant, och det måste finnas tillräckliga resurser för att garantera att de data som samlas in under provtagningen överensstämmer med provtagningsplanen. Rekommendationerna i detta avsnitt ges i avsikt att säkerställa att provresultaten blir så representativa som möjligt. Protokoll för provtagning och transport av prover är en viktig förutsättning för att dessa processer ska kunna standardiseras och att provresultaten blir representativa för musslorna i det berörda upptagningsområdet. För att man ska kunna vara säker på att protokollen tillämpas ska de vara tillgängliga för alla som deltar i klassificerings- och övervakningsprogrammet, provtagningen och transporten av prover. 4.2 Krav I förordning (EG) nr 882/2004 fastställs följande: (11) De myndigheter som är behöriga att utföra offentlig kontroll bör uppfylla ett antal verksamhetskriterier som garanterar deras opartiskhet och effektivitet. De bör ha tillgång till tillräckligt stor, för ändamålet väl kvalificerad och erfaren personal, och lämpliga utrymmen och lämplig utrustning för att kunna utföra sina uppgifter ordentligt. (12) Offentlig kontroll bör genomföras med lämpliga metoder som är utvecklade för detta ändamål, bl.a. rutinövervakning och mer ingående kontroller såsom inspektioner, verifieringar, revisioner, provtagning och analys av prover. För att metoderna skall kunna användas på ett riktigt sätt måste den personal som utför offentliga kontroller få lämplig utbildning. Utbildning behövs även för att garantera att de behöriga myndigheterna fattar enhetliga beslut, särskilt vad gäller tillämpningen av HACCP-principerna (faroanalys och kritiska styrpunkter). I förordningen sägs också följande (avdelning II, kapitel III): 1. De provtagnings- och analysmetoder som används i den offentliga kontrollen skall överensstämma med relevanta gemenskapsföreskrifter eller a) om sådana inte finns, med internationellt erkända bestämmelser eller protokoll, t.ex. sådana som har godkänts av Europeiska standardiseringskommittén (CEN) eller sådana om vilka överenskommits i nationell lagstiftning, eller b) i avsaknad av ovanstående, med andra metoder som lämpar sig för det avsedda ändamålet eller som tagits fram i enlighet med vetenskapliga protokoll. Förordning (EG) nr 854/2004, bilaga II, kapitel II F, föreskriver följande: Vid beslut om klassificering, öppnande eller stängning av produktionsområden kan den behöriga myndigheten ta hänsyn till resultaten av kontroller som utförts av livsmedelsföretagarna eller av de organisationer som företräder livsmedelsföretagarna. I sådana fall krävs det att den behöriga myndigheten har utsett det laboratorium som genomför analysen och, om så är nödvändigt, att provtagningen och analysen genomförts

Sida 20 av 39 i enlighet med ett protokoll som den behöriga myndigheten och de berörda livsmedelsföretagarna eller den berörda organisationen har enats om. 4.3 Rekommendationer 4.3.1 Protokoll för provtagning och transport av prover Provtagningstjänstemän bör förses med instruktioner som innehåller information om följande: Platsen där provtagningen ska ske. De arter som provtagningen gäller. Provtagningsmetod. o Denna ska inte ge upphov till föroreningar i större utsträckning än vad som skulle orsakats av den normala affärsverksamheten. Antal och minimivikt för de individuella djur som ska ingå i provtagningen (angett för varje art). Rengöring av provtagningsexemplarens ytterskal. Provtagningsprotokoll. o Detta ska inkludera användning av ett provinlämningsformulär. De behållare och yttre förpackningar som ska användas för proverna. Anbefallen metod för användning av kylförpackningar eller annan utrustning för temperaturkontroll. o o Syftet är att hålla temperaturen inom det intervall som fastställts av den behöriga myndigheten, för att E. coli-nivån ska förbli stabil under transporten. Den längsta tid som får förflyta mellan provtagning och påbörjad laboratorieanalys, som fastställs av den behöriga myndigheten för att garantera E. coli-stabilitet. 4.3.2 Provinlämningsformulär Det är viktigt att använda sig av lämpliga provinlämningsformulär för att förhindra förlust av data och garantera spårbarheten. Följande information ska anges i provinlämningsformuläret: Identifiering av provtagningspunkten. Kartkoordinater (rutnätsreferens och/eller latitud/longitud) för provtagningspunkten. Tidpunkt och datum för provtagningen. Arter som provtagningen utförts på. Insamlingsmetod för proverna (handplockade, insamlade med skave osv.). Havsvattnets temperatur (eller lufttemperatur för arter som lever i områden som påverkas av tidvatten och som befann sig ovanför vattenytan vid provtagningen). Annan relevant information (ovanliga händelser, svåra väderförhållanden osv.). Vindriktning och vindhastighet, tidvattenläge, vattenströmmars riktning (i tillämpliga fall). I tabell 2 visas ett exempel på formulär.

Sida 21 av 39 Programkod/beskrivning Provtagarens referensnummer Provtagarens namn Referensnummer för provet Datum Tid Provtagningspunktens nummer Tabell 2. Exempel på provinlämningsformulär Provtagningspunktens namn Den representativa provtagningspunktens placering (rutnätsreferens eller latitud/longitud) Musselarter Skave Handplockad Insamlingsmetod (ringa in) Handskrapad Hämtad av dykare Annat (ange metod) Tidvattenläge (ringa in) Springflod Nipflod Vattentemperatur (exemplar under vattenytan) Lufttemperatur (exemplar över vattenytan) Vind (riktning och hastighet) Regn under senaste 48 tim. Anmärkningar 1 Datum då provet kom till laboratoriet Tid då provet kom till laboratoriet Accepterat av laboratoriet (Om Nej, ange orsak) Högvatten Ebb Lågvatten Flod Ja/Nej Ja/Nej 1 Till exempel djur/fåglar/använda bräddavlopp/fartyg i området/turister osv. 4.3.3 Kontroll av provtagningsprogrammet Alla provtagare ska genomgå formell utbildning. De ska förses med all nödvändig provtagnings- och säkerhetsutrustning. Provtagningen bör kontrolleras genom o fortgående översyn av provtagningsprotokoll, och o regelbunden fysisk revision av provtagnings- och provtransportförfarandena. o Frekvensen för kontrollerna bestäms på grundval av en riskbedömning. Identifierade avvikelser i provtagningsförfarandet ska åtgärdas. o Vid behov ska detta omfatta ytterligare utbildning av provtagarna.

Sida 22 av 39 4.3.4 Industrins tillhandahållande av prov eller provresultat om detta godkänts av den behöriga myndigheten Om tjänstemän hos den behöriga myndigheten, eller hos ett annat behörigt organ, inte kan utföra provtagningen gäller följande: o Industriaktörer får tillhandahålla prov om alla inlämningskrav som gäller för offentliga provtagare uppfylls, och om provtagningen sker under överinseende av en auktoriserad tjänsteman då detta är möjligt. Annars ska sporadiska prover tas av, eller under överinseende av, en auktoriserad tjänsteman om provtagningen utförs enligt ett protokoll som har godkänts av både den behöriga myndigheten och industrin. o Förfaranden ska upprättas så att alla eventuella avvikelser från protokollen identifieras vid inlämningstillfället inte efter att laboratorieresultatet har meddelats. Industrins tillhandahållande av provresultat o Platsen/platserna och tidpunkten för provtagning ska ge en korrekt bild av föroreningsnivån i området. Dessa ska fastställas på grundval av den sanitära undersökningen. o Förfarandena för provtagning och transport av prover ska följa de protokoll som utfärdats av den behöriga myndighet eller det kontrollorgan som ansvarar för övervakningprogrammet. o Provtagnings- och transportförfarandena ska också följa riktlinjerna i avsnitt 4.3.1-4.3.3 ovan. o Laboratorier ska väljas ut av den behöriga myndigheten. o Laboratorieanalyserna ska följa rekommendationerna i avsnitt 5 i dessa riktlinjer. o Det ska finnas ett formellt förfarande för att se till att den behöriga myndigheten får kännedom om alla provresultat. 4.3.5 Mottagande av prover hos laboratoriet Proverna ska endast analyseras om de uppfyller följande krav: De har transporterats enligt reglerna i avsnitt 4.3.1. Minimiantalet och minimivikten för kött från levande djur uppfyller den behöriga myndighetens krav o samt kravet på ett absolut minimiantal på tio djur som fastställts i förordning (EG) nr 2073/2005. Proverna levereras i de behållare och påsar som är avsedda att användas vid provtagning. Behållaren/påsen är märkt på korrekt sätt. Provet levereras i tillfredsställande skick. Provet åtföljs av ett ifyllt provinlämningsformulär (se avsnitt 4.3.2). Temperaturen och tiden mellan provtagning och inlämning uppfyller den behöriga myndighetens krav. 4.4 Resultat Efter genomgång av detta steg bör den behöriga myndigheten ha upprättat robusta formella förfaranden för provtagning inom ramen för den offentliga kontrollen och för transport av proverna till laboratoriet där analysen utförs.

Sida 23 av 39 5. MIKROBIOLOGISK ANALYS 5.1 Inledning Det är av avgörande betydelse för de offentliga övervakningsprogrammen att kvaliteten på analysresultaten är god. Dessa måste övervakas väl, så att man inte inkluderar missvisande tester i programmet. EU:s förordningar innehåller ett antal viktiga kvalitetskrav för de offentliga kontrollerna, inbegripet krav på testmetoder, ackreditering av laboratorier, kvalifikationsprövning och lämplig tillsyn utövad av ett referenslaboratorium. En del av de metoder som används för mätning av E. coli-bakterier i livsmedel har visat sig ge mycket inkonsekventa resultat när de används på musslor. Det är särskilt viktigt att använda en metod som ger en korrekt mätning av bakterier som påverkats av den marina miljön. Om en olämplig metod används kan det leda till inkorrekta, låga resultat som leder till en klassificering som inte i tillräckligt hög grad skyddar folkhälsan. ISO TS 16649-3 är den referensmetod som föreskrivs i EU-lagstiftningen för mätning av E. coli-bakterier i musslor (se nedan). Detta är ett MPN-femrörstest med tre utspädningar i två steg. Det första steget är en återupplivning genom inokulering av mineralmodifierad glutamatbuljong med en serie utspädda musselhomogenat och inkubering vid 37 ± 1 C i 24 ± 2 timmar. Förekomsten av E. coli bekräftas därefter genom subkulturer i rör som visar syraproduktion på TBGA och betaglukoronidasaktivitet med hjälp av blå eller blågröna kolonier. ISO TS 16649-3 hänvisar till ISO 7218 för fastställande av MPN genom kombination av positiva och negativa rör (ISO 2007). Detaljerad information om laboratoriemetoden finns i ISO TS 16649-3. Metoder för hantering av prover beskrivs i EN ISO 6887-3. I förordning (EG) nr 882/2004 sägs följande: "Utnämningen av referenslaboratorier på gemenskapsnivå och nationell nivå bör leda till analysresultat som präglas av hög kvalitet och enhetlighet. Målet kan uppnås genom att använda validerade analysmetoder, skapa tillgång till referensmaterial, genomföra jämförande tester och utbilda laboratoriepersonal." 5.2 Krav 5.2.1 Angiven metod för E. coli Enligt förordning (EG) nr 854/2004 ska ett MPN-femrörstest med tre utspädningar användas för klassificering av områden i kategorierna B och C. Detta ändrades genom kommissionens förordning (EG) nr 1021/2008 där följande slogs fast: "Referensmetoden för denna analys är MPN-femrörstest med tre utspädningar enligt ISO 16649-3." Förordning (EG) nr 854/2004 hänvisar till kommissionens förordning om mikrobiologiska kriterier för livsmedel (förordning (EG) nr 2073/2005), som anger ISO 16649-3 som referensmetod för slutprodukter och kategori A-områden. Andra metoder får användas om de har validerats mot denna referensmetod i enlighet med kriterierna i EN ISO 16140 (förordning (EG) nr 1021/2008) eller om de har validerats mot referensmetoden i protokollet ISO 16140 eller andra internationella protokoll (förordning (EG) nr 2073/2005). Alternativa metoder för mätning av E. coli för vilka valideringen har godkänts av EU:s referenslaboratorium anges k,l i bilaga 1 till dessa riktlinjer. 5.2.2 Val och ackreditering av laboratorier I förordning (EG) nr 882/2004 fastställs följande: "1. Den behöriga myndigheten skall utse laboratorier som får analysera prover som tagits vid offentlig kontroll. 2. Den behöriga myndigheten får dock endast utse laboratorier som bedriver verksamhet, och är bedömda och ackrediterade i enlighet med följande europeiska standarder: