Dako LSAB2 System-HRP Kod K0672 15 ml Kod K0673 15 ml Kod K0675 110 ml Avsedd användning För in vitro-diagnostik. Dessa instruktioner gäller Universal Dako Labelled Streptavidin-Biotin2 System, Horseradish Peroxidase (LSAB2 System, HRP). Detta system är avsett för användning med primära antikroppar från kanin eller mus, som tillhandahålls av användaren, för kvalitativ identifiering av antigener med ljusmikroskopi och immunhistokemi i paraffininbäddade vävnader, kryostatvävnader och cellpreparat, som ett hjälpmedel för att diagnostisera patologiska sjukdomar. Vävnader som behandlats i olika fixativ, inklusive etanol, B-5, Bouins, zinkformalin och neutralbuffrat formalin, kan användas. Se Dakos Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning eller detektionssystemets instruktioner om IHC-procedurer för: 1) Procedurprincip, 2) Material som behövs men inte medföljer, 3) Förvaring, 4) Provberedning, 5) Färgningsprocedur, 6) Kvalitetskontroll, 7) Felsökning, 8) Tolkning av färgningen, 9) Allmänna begränsningar. Sammanfattning och förklaring LSAB2-systemet, HRP är baserat på en modifierad märkt avidin-biotinteknik (LAB), i vilken en biotinylerad sekundär antikropp bildar ett komplex med peroxidaskonjugerade streptavidinmolekyler. 1 Jämfört med ABC-metoden har LAB/LSAB-metoden rapporterats vara fyra till åtta gånger känsligare. 2 Giorno, et al 2 attribuerar den ökade känsligheten till den mindre storleken på det enzymmärkta (strept)avidinkomplexet i LAB/LSAB-metoden när det jämförs med avidin-biotinenzymkomplexet i ABC-metoden. Den kliniska tolkningen av all färgning eller frånvaro av färgning måste kompletteras med morfologiska och histologiska studier med användning av lämpliga kontroller. Utvärderingar skall göras av en kvalificerad person inom ramen för patientens anamnes och andra diagnostiska tester. Procedurprincip LSAB2 System, HRP är en känslig och mångsidig immunhistokemisk procedur som medger samtidig behandling av ett stort antal olika prover med primära kanin- eller mus-antikroppar på mindre än en timme. Endogen peroxidasaktivitet släcks genom att inkubera provet i 5 minuter med 3 % väteperoxid. Provet inkuberas sedan med en lämpligt karakteriserad och spädd primär kanin- och mus-antikropp, följt av sekventiella 10 minuters inkubationer med en biotinylerad länkantikropp (innehållande anti-kanin- och anti-mus-immunglobuliner) och peroxidasmärkt streptavidin. Färgning avslutas efter en inkubation med substratkromogenen (AEC eller DAB). För AEC i K0672, är detta en 10 minuters inkubation med 3-amino-9-etylcarbazol (AEC) substrat-kromogen, som resulterar i ett rödfärgat precipitat vid antigenplatsen. För DAB i K0673, är detta en 5 10 minuters inkubation med 3-3'-diaminobenzidin (DAB) substrat-kromogen, som resulterar i ett brunfärgat precipitat vid antigenplatsen. Medföljande reagens Kod K0672 Följande material, som är tillräckligt för 150 vävnadssnitt, baserat på 100 µl per snitt, innefattas i detta kit: Kvantitet Beskrivning 1 x 15 ml Peroxidase Block 3 % väteperoxid i vatten. 1 x 15 ml Link Antibody Biotinmärkta, affinitetsisolerade get-anti-kanin- och get-anti-mus-immunglobuliner i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), innehållande stabiliserande protein och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 15 ml Streptavidin-HRP Streptavidinkonjugerat till pepparrotsperoxidas i PBS innehållande stabiliserande protein och antimikrobiella medel. 1 x 15 ml AEC Substrate Chromogen AEC i N,N-dimetylformamid (DMF) och acetatbuffert, ph 5,0, innehållande väteperoxid, stabiliseringsmedel, förstärkare och ett antimikrobiellt medel. Förvaras vid 2 8 C. (107451-003) 302289SE_001 s. 1/8
Kod K0673 Följande material, som är tillräckligt för 150 vävnadssnitt, baserat på 100 µl per snitt, innefattas i detta kit: Kvantitet Beskrivning 1 x 15 ml Peroxidase Block 3 % väteperoxid i vatten. 1 x 15 ml Biotinylated Link Biotinmärkta, affinitetsisolerade get-anti-kanin- och get-anti-mus-immunglobuliner i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), innehållande stabiliserande protein och 0,015 mol/l natriumazid. Streptavidin-HRP 1 x 15 ml Streptavidinkonjugerat till pepparrotsperoxidas i PBS innehållande stabiliserande protein och antimikrobiella medel. Substrat 1 x 18 ml Imidazol-HCl-buffert ph 7,5 innehållande väteperoxid och ett antimikrobiellt medel. DAB Chromogen 1 x 1 ml 3,3 -diaminobensidin i kromogenlösning. Tillbehör 1 Kalibrerat provrör 1 Pasteur-pipett i plast Kod K0675(11) Följande material, som är tillräckligt för 1100 vävnadssnitt, baserat på 100 µl per snitt, innefattas i detta kit: Kvantitet 1 x 110 ml Beskrivning Biotinylated Link Biotinmärkta, affinitetsisolerade get-anti-kanin- och get-anti-mus-immunglobuliner i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), innehållande stabiliserande protein och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 110 ml Streptavidin-HRP Streptavidinkonjugerat till pepparrotsperoxidas i PBS innehållande stabiliserande protein och antimikrobiella medel. Kod K0675(89) Följande material, förpackat för användning med Dako Autostainer (kod S3400), innefattas i detta kit: Kvantitet 10 x 11 ml Beskrivning Biotinylated Link Biotinmärkta, affinitetsisolerade get-anti-kanin- och get-anti-mus-immunglobuliner i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), innehållande stabiliserande protein och 0,015 mol/l natriumazid. 10 x 11 ml Streptavidin-HRP Streptavidinkonjugerat till pepparrotsperoxidas i PBS innehållande stabiliserande protein och antimikrobiella medel. (107451-003) 302289SE_001 s. 2/8
Material som behövs men inte medföljer Absorberande papper Antikroppar: N-serien bruksfärdiga eller koncentrerade antikroppar spädda i Antibody Diluent (kod S0809 eller S3022) Antibody Diluent (kod S0809 eller S3022) Kontrollvävnader, positiva eller negativa Motfärg, vattenbaserad, såsom Lillies Modified Mayers Hematoxylin (kod S3309) Täckglas Destillerat vatten Torkugn, som kan bibehålla 60 C eller mindre Etanol, absolut och 95 % Ljusmikroskop (20x 800x) Monteringsmedia, såsom Faramount (kod S3025) eller Glycergel (kod C0563) Negativa kontrollreagens Objektglas, poly-l-lysin-belagda eller Silanized Slides (kod S3003) Färgningskärl eller -bad Timer (med 2 10 minuters intervall) Tvättflaskor Tvättbuffertlösning Xylen, toluen eller xylensubstitut För K0675 LSAB2-systemet (110 ml), krävs följande reagenser förutom den ovannämnda listan: Väteperoxid, 3 % lösning eller Peroxidase Block (kod S2001) Substratkromogenlösning såsom AEC Substrate-Chromogen (kod K3464, 110 ml, bruksfärdig) eller Liquid DAB (kod K3466) Valfria material som inte medföljer Buffertar: Wash buffer (kod S3006) för automatiserad och manuell användning Phosphate buffered saline (kod S3024) Tris-buffered saline (kod S3001 eller S1968) Proteolytiska enzymer: Pepsin (kod S3002) Proteinase K (kod S3004 eller S3020) Proteolytic Enzyme, RTU (kod S3007) Annat: Positiva kontrollpreparat (tillgängliga från Dako) Target Retrieval Solution (kod S1699 eller S1700) Target Retrieval Solution, High ph (kod S3307 eller S3308) Target Retrieval Solution, ph 9 (kod S2367 eller S2368) Fuktkammare Ammoniumhydroxid, 15 mol/l spätt till 0,037 mol/l Försiktighetsåtgärder Produktspecifikt 1. För yrkesmässigt bruk. 2. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten vid kassering så att inte metallazider ansamlas i avloppet. 3,4 3. AEC- och DAB-substratkromogener är känsliga för kontamination från flera olika oxidationsmedel såsom metaller, bakterier, damm och allmänt använda laboratorieglas. Undvik att utsätta AEC- eller DAB-lösningarna för någon potentiell kontaminationskälla och pipettera aldrig direkt från flaskan, för att undvika kontamination och utgång i förtid. Häll erfordrad mängd i en ren behållare och pipettera från denna. Häll inte tillbaka överflödig AEC- eller DAB-lösning i den primära förvaringsbehållaren. 4. De medföljande reagenserna har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan resultera i minskad antigenfärgning. Alla sådana ändringar måste valideras av användaren. Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan ge signifikanta variationer i resultat, vilket kräver regelbundet utförande av interna kontroller. 5. Substituera inte reagenser från andra partinummer eller från satser från andra tillverkare. 6. Andra inkubationstider eller temperaturer än vad som specificeras kan ge felaktiga resultat. Alla sådana ändringar måste valideras av användaren. 7. Enzymer och kromogener kan påverkas negativt om de exponeras för höga ljusnivåer. Förvara inte satskomponenter och utför inte färgning i starkt ljus, t.ex. direkt solljus. Allmänt 1. I likhet med alla produkter av biologiskt ursprung krävs en korrekt hantering. 2. Minimera mikrobiell kontamination av reagenser eftersom felaktiga resultat då kan förekomma. 3. Undvik att stänka reagenserna eller att framkalla aerosoler. 4. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste noggrant instrueras om lämplig arbetsprocedur, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsanvisningar. 5. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögonen och huden. Oanvända reagenser måste kasseras enligt lokala och statliga föreskrifter. 6. Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. (107451-003) 302289SE_001 s. 3/8
Risker och säkerhet K0672 - AEC Substrate Chromogen Ready-to-Use: 1-<10 % N,N-dimetylformamid / Risksymbol: Giftigt R61 S35 S45 S53 Kan ge fosterskador. Detta material och dess förpackning skall oskadliggöras på säkert sätt. Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta läkare omdedelbart. Visa om möjligt etiketten. Undvik exponering begär specialinstruktioner före användning. Får endast användas av professionella användare. K0673 - DAB Chromogen: 1 5 % bifenyl-3,3,4,4 -tetrayltetraammoniumtetraklorid / risksymbol: Hälsoskadlig R40 Misstänks kunna ge cancer. R43 Kan ge allergi vid hudkontakt. R68 Möjlig risk för bestående hälsoskador. S35 Detta material och dess förpackning skall oskadliggöras på säkert sätt. S36/37 Använd lämpliga skyddskläder och skyddshandskar. Förvaring Reagenser i LSAB2-systemet, HRP skall förvaras vid 2 8 C. Får ej frysas. Får ej användas efter det ut gångsdatum som finns tryckt på reagensflaskorna och satsetiketten. Användaren måste validera alla förvaringsförhållanden som avviker från vad som specificerats. 5 AEC- och DAB-substratkromogenlösningarna är instabila vid högre temperaturer än 8 C. Använd och förva ra AEC- och DABsubstratkromogenlösningarna vid det rekommenderade 2 8 C temperaturintervallet. Dessa lösningar kan a nvändas omedelbart efter de har tagits ut ur kylskåpet. Efter användning skall de återföras till kylskåp vid 2 8 C så snart som möjli gt. Det finns inga tydliga tecken som tyder på instabilitet hos dessa produkter. Därför bör positiva och negativa kontroller testas samtidigt med patientproverna. Kontakta Dako Teknisk Support om du observerar en oväntad färgning som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och om du misstänker att det är något problem med satsen. Reagensberedning Det är lämpligt att bereda följande reagenser före färgning. Tvättbuffertlösning TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline med Tween (kod S3006) rekommenderas som tvättbuffert för automatisk och manuell immunhistokemisk detektion. TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (kod S1968) och PBS 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (kod S3024) är också lämpliga tvättbuffertlösningar för manuell färgning. Tvättbuffertlösningar innehållande natriumazid rekommenderas ej. Natriumazid inaktiverar pepparrotsperoxidas (HRP), vilket resulterar i negativ färgning. Förvara oanvänd buffert vid 2 8 C. Kassera buffert en om den ser grumlig ut. Destillerat vatten kan användas för att skölja väteperoxiden, substratkromogenlösningen och motfärgen. Primär antikropp Ett stort urval av N-seriens bruksfärdiga primära antikroppar och Negativt kontrollreagens är tillgängliga för användning med LSAB2- system. Koncentrerade antikroppar är också tillgängliga från Dako; optimala spädningar måste emellertid bestämmas experimentellt av användaren. Spädningar bör beredas med användning av Antibody Diluent (kod S0809), som innehåller 0,05 mol/l Tris-HCl buffert, ph 7,2 7,6, och 1 % bovint serumalbumin (BSA). BSA verkar som ett proteinblock och eliminerar behovet av en separat inkubation med proteinblocksreagens. Antibody Diluent with Background Reducing Components (kod S3022) är också lämpligt för användning som ett spädningsmedel. Spädningsmedel utan proteinbärare rekommenderas ej. För de flesta primära antikroppar som används med LSAB2-systemet, är en inkubation på 10 minuter tillräckligt. Negative Control Reagent En negativ kontrollreagens innehåller under idealiska förhållanden antikropp som inte uppvisar någon specifik reaktivitet med humana vävnader (icke-humanreaktiv) i samma matris/lösning som den primära antikroppen. Den icke-humanreaktiva antikroppen skall vara av samma underklass och djurursprung som den primära antikroppen, spädd till samma immunglobulin- eller proteinkoncentration som den spädda primära antikroppen, med användning av samma spädningsmedel. Beroende på typen av primär antikropp/antiserum som används, kan normalt/icke-immunt serum från samma art som det primära, vid en proteinkoncentration som motsvarar den utspädda primära i samma spädningsmedel, vara lämpligt för användning. Inkubationsperioden för det negativa kontrollreagenset bör motsvara inkubationsperioden för den primära antikroppen/det primära antiserumet. Vid användning av Dako N-Seriens bruksfärdga antikroppar, rekommenderas Universal Negative Control(s), som negativt kontrollreagens. Dessa kontroller är optimerade för användning med N-Seriens bruksfärdiga antikroppar antingen från mus (kod N1698) eller kanin (kod N1699). Substratkromogenlösning K0672 LSAB2-systemet innehåller bruksfärdig AEC, som är redo att appliceras på vävnad eller cellprover. K0673 LSAB2-systemet innehåller DAB, som bereds enligt följande: Tillsätt 1 droppe (eller 20 µl) av DAB-kromogen per ml substratbuffert. Använd det medföljande graderade provröret för att mäta upp mängden substratbuffert som behövs. Blanda och applicera lösningen med användning av den medföljande överföringspipetten. Skölj det graderade provröret och pipettera noggrant med destillerat vatten efter användning. Oanvänd DAB-arbetslösning är stabil i upp till 2 veckor om den förvaras vid 2 8 C. Blanda väl före användning om en utfällning bildas. Ready-to-use AEC Substrate-Chromogen Solution (kod K3464, 110 ml) eller Liquid DAB (kod K3466) rekommenderas för användning med LSAB2-systemet, HRP, 110 ml (kod K0675). Följ anvisningarna som medföljer varje substratkromogensystem för beredning av substratkromogen. (107451-003) 302289SE_001 s. 4/8
Motfärg DAB-kromogen ger en slutprodukt som är olöslig i alkohol och som kan användas med ett alkoholbaserat hematoxylin. När AECsubstratkromogen används är den färgade slutprodukten av färgningsreaktionen löslig i alkohol och bör endast användas med vattenbaserade motfärger såsom Mayers Hematoxylin. Följ motfärgning av hematoxylin med en noggrann sköljning i destillerat vatten och blötlägg sedan vävnadspreparaten i ett bad med 0,037 mol/l ammoniakvatten. 0,037 mol/l ammoniakvatten framställs genom att blanda 2,5 ml 15 mol/l (koncentrerad) ammoniumhydroxid med 1 liter vatten. Oanvänt 0,037 mol/l ammoniakvatten kan förvaras vid rumstemperatur (20 25 C) i en väl försluten flaska i upp till 12 månader. Se tillverkarens riktlinjer för alternativa motfärgninsprocedurer. Monteringsmedia Faramount Aqueous Mounting Medium, bruksfärdigt (kod S3025) eller Glycergel Mounting Medium (kod C0563) rekommenderas för vattenbaserad montering. Gör Glycergel flytande genom att värma det till cirka 40 ± 5 C före användni ng. Provberedning Se Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning och/eller produktbladet för antikroppen. Före immunhistokemisk färgning måste vävnaderna fixeras och behandlas. Fixering förhindrar autolys och förruttnelse av utskuren vävnad, bevarar antigenicitet, förstärker vävnadens brytningsindex och ökar de cellulära elementens resistans mot vävnadsbehandling. Vävnadsbehandling inkluderar dehydrering, klarning av dehydreringsmedel, infiltrering av inbäddningsmedia, inbäddning och snittning av vävnader. De vanligaste fixativen för immunhistokemisk vävnadsberedning diskuteras i Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning. Detta är endast riktlinjer. Optimala procedurer måste bestämmas och verifieras av användaren. Färgningsprocedur Proceduranmärkningar Användaren ska läsa dessa instruktioner noggrant och bekanta sig med systeminnehållet före användning. Reagenserna och anvisningarna som medföljer detta system har utformats för att ge optimal prestanda. Ytterligare spädning av systemreagenserna eller förändring av inkubationstiderna eller temperaturerna kan ge felaktiga resultat. Alla systemreagenser förutom AEC-substratkromogen bör anta jämvikt vid rumstemperatur (20 25 C) före immunfärgning. Likaså skall alla inkuberingar utföras vid rumstemperatur. AEC-substratkromogen kan användas omedelbart efter det tagits ut ur kylskåp och behöver inte vara i rumstemperatur före användning. Sätt tillbaka i kylskåp vid 2 8 C efter användnin g. Förvaring vid temperaturer som överskrider 8 C påverkar AEC-substratkromogenets s tabilitet negativt. Se till att vävnadssnitten inte torkar ut under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa ökad icke-specifik färgning. Täck objektglas som utsätts för drag. Om långvariga inkuberingar används skall vävnaderna placeras i en fuktig miljö. Om färgningsproceduren avbryts kan glasen förvaras i ett buffertbad efter inkubation av länkantikroppen (Steg 3) i upp till en timme vid rumstemperatur (20 25 C) utan att färgningsresulta tet påverkas. Känsligheten hos LSAB2-systemet, HRP kan ökas ytterligare genom att förlänga inkubationstiderna i steg 2, 3 och 4 till 30 ± 5 minuter vardera. Färgningsprotokoll STEG 1 PEROXIDASE BLOCK Slå bort överskottsvätska. Torka noggrant runt provet med hjälp av en luddfri duk (t.ex. Kimwipe eller gasväv) för att avlägsna kvarvarande vätska och för att hålla reagenser inom det föreskrivna området. Applicera tillräckligt med Peroxidase Block för att täcka provet. Inkubera i 5 (±1) minuter. Skölj varsamt med destillerat vatten eller buffertlösning från en tvättflaska (rikta inte strålen direkt mot vävnaden) och placera i ett färskt buffertbad. STEG 2 PRIMÄR ANTIKROPP ELLER NEGATIV KONTROLLREAGENS Slå bort överflödig vätska och torka objektglasen enligt beskrivning ovan. Applicera tillräckligt med primär antikropp eller negativ kontrollreagens för att täcka provet. Inkubera 10 (±1) minuter om inte annat anges. Skölj varsamt med buffertlösning från en tvättflaska (rikta inte strålen direkt mot vävnaden) och placera i ett färskt buffertbad. STEG 3 BIOTINYLATED LINK Slå omedelbart bort överflödig buffert och torka objektglasen enligt beskrivning ovan. Applicera tillräckligt med GULA droppar från länkantikroppen för att täcka provet. Inkubera i 10 (±1) minuter. Skölj objektglaset enligt Steg 2. Om färgningsproceduren avbryts kan glasen förvaras i ett buffertbad efter inkubation av länkantikroppen (Steg 3) i upp till en timme vid rumstemperatur (20 25 C) utan att färgni ngsresultatet påverkas. STEG 4 STREPTAVIDIN-HRP Torka objektglasen enligt beskrivning ovan. Applicera tillräckligt med RÖDA droppar av Streptavidinreagenset för att täcka provet. Inkubera i 10 (±1) minuter. Skölj objektglaset enligt beskrivning ovan (107451-003) 302289SE_001 s. 5/8
STEG 5 SUBSTRATKROMOGENLÖSNING Ta ut AEC- eller DAB-substratkromogenlösningarna ur kylskåpet (2 8 C). Se avsnittet Reagensberedning för beredning av DAB. Torka objektglaset enligt beskrivning ovan. Applicera tillräckligt med AEC- eller DAB-substratkromogenlösning för att täcka provet. Sätt tillbaka AEC- eller DABsubstratkromogenet i kylskåpet. Inkubera i 10 (±1) minuter för AEC och 5 10 minuter för DAB. Skölj varsamt med destillerat vatten från en tvättflaska (rikta inte strålen direkt mot vävnaden). Samla upp AEC- eller DABsubstratkromogenavfall i en behållare för riskmaterial för lämplig kassering. STEG 6 MOTFÄRGNING MED HEMATOXYLIN (VALFRITT) Sänk ner objektglasen i ett bad med hematoxylin. Inkubera i två till fem (2 5) minuter, beroende på styrkan hos det använda hematoxylinet. Skölj varsamt i ett bad med destillerat vatten. Doppa objektglasen 10 gånger i ett bad med 0,037 mol/l ammoniakvatten (valfritt). Skölj objektglasen i ett bad med destillerat eller avjoniserat vatten i två till fem (2 5) minuter. STEG 7 MONTERING Prover kan monteras och förses med täckglas med ett vattenbaserat monteringsmedel, såsom Faramount (kod S3025) eller Glycergel (kod C0563). OBS! AEC-reaktionsprodukten är löslig i organiska lösningsmedel och är därför inte kompatibel med toluen- eller xylenbaserad, permanent monteringsmedia. OBS! DAB kan monteras med vilket permanent monteringsmedia som helst. OBS! Objektglasen kan avläsas när så är lämpligt. Viss blekning förekommer emellertid om objektglasen utsätts för starkt ljus under en period på en vecka. Förvara objektglasen mörkt i rumstemperatur (20 25 C) för att minimera blekningen. Kvalitetskontroll Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan ge signifikanta variationer i resultat, vilket kräver regelbundet utförande av interna kontroller. Se riktlinjer för kvalitetskontroll enligt College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry och referenser 6 8 för ytterligare information. Se produktbladet för varje primär antikropp som används för ytterligare detaljer angående känslighet och immunreaktivitet. Se Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning för ytterligare information om positiva och negativa kontroller. Tolkning av färgningen Se Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning för riktlinjer för tolkning. Allmänna begränsningar Se Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning för allmänna begränsningar. Produktspecifika begränsningar Dako tillhandahåller LSAB2-systemreagenser vid optimal spädning för användning enligt de medföljande instruktionerna för immunhistokemi på paraffininbäddade vävnadssnitt, kryostater och blodutstryk. Alla avvikelser från de rekommenderade testprocedurerna kan göra förväntade resultat ogiltiga. Lämpliga kontroller måste användas och dokumenteras. Användare som avviker från de rekommenderade testprocedurerna måste ta ansvar för tolkningen av patientresultat under dessa förhållanden. Endogen avidinbindningsaktivitet (EABA) har observerats i frysta snitt av lever (hela levernodulen) och njure (tubulärt epitel), såväl som i frysta och formalinfixerade lymfvävnader (parakortikala histiocyter). 9-12 EABA kan hämmas med sekventiella 20-minuters inkubationer, först med 0,1 % avidin och sedan med 0,01 % biotin i 0,05 M Tris-HCl buffert, ph 7,2 7,6, före färgning eller använd Biotin Blocking System (kod X0590). Endogen peroxidas- eller pseudoperoxidasaktivitet kan påträffas i hemoproteiner såsom hemoglobin, myoglobin, cytokrom och katalas, såväl som i eosinofiler. 13,14 I formalinfixerad vävnad kan denna aktivitet hämmas genom att inkubera proverna med 3 % väteperoxid i fem minuter före applicering av den primära antikroppen. Blod och benmärgsutstryk och frysta vävnader kan behandlas med Peroxidase Blocking Reagent (kod S2001). Denna procedur utplånar emellertid inte det rödbruna pigmentet hos hemoproteiner. Alternativt kan en lösning av metanolväteperoxid användas. Vissa antigener kan brytas ned med denna procedur. Reagenser kan uppvisa oväntade reaktioner i tidigare otestade vävnader. Sannolikheten för oväntade reaktioner även i testade vävnadsgrupper kan inte fullständigt elimineras på grund av biologisk variation av antigenexpression i neoplasmer eller andra patologiska vävnader. 8 Rapportera dokumenterade oväntade reaktioner till Dakos Tekniska Support. Vävnader från personer infekterade med hepatit B-virus och med hepatit B-ytantigen (HBsAg) kan uppvisa icke-specifik färgning med pepparrotsperoxidas. 15 (107451-003) 302289SE_001 s. 6/8
Felsökning Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Ingen färgning av objektglasen. 1a. Reagenserna har inte använts i korrekt ordning. 1a. Gå igenom appliceringen av reagenser. 1b. Natriumazid i buffertbadet. 1b. Använd färsk, azidfri buffert. 1c. Substratkromogenreagenset har blandats på fel sätt. 1c. Gör en färsk substratkromogenlösning enligt 2. Svag färgning av objektglasen. 3. Alltför kraftig bakgrundsfärgning av alla objektglas, inklusive negativa kontrollpreparat. 4. Vävnadssntiten lossnar från objektglasen. 5. Alltför stark specifik färgning 2a. Snitten bibehåller för mycket lösning efter tvättningsbadet. 2b. Objektglasen har inte inkuberats tillräckligt länge med reagenser. 2c. Inkompatibel motfärg eller monteringsmedia som löser upp reaktionsprodukten. 3a. Proverna innehåller hög endogen peroxidasaktivitet. 3b. Paraffinet har inte avlägsnats fullständigt. 3c. Objektglasen har inte sköljts ordentligt. 3d. Snabbare än normal substratreaktion p.g.a. för hög rumstemperatur. 3e. Snitten torkade under färgningsproceduren. 3f. Icke-specifik bindning av reagenser till vävnadssnitt. kitprotokollet. 2a. Knacka försiktigt bort överflödig vätska innan du torkar runt snittet. 2b. Gå igenom rekommenderade inkubationstider. 2c. Använd endast vattenbaserade motfärger och monteringsmedia för AEC-immunfärgade objektglas. 3a. Inkubera objektglasen med färsk väteperoxid. 3b. Använd färska xylen- eller toluenbad. 3c. Använd färska lösningar i buffertbaden och tvättbaden. 3d. Använd kortare inkubationstider med substratkromogenlösning. 3e. Använd fuktkammare. Torka endast tre till fyra objektglas åt gången före tillsats av reagens. 3f. Använd Dako antikroppsspädningar eller tillsätt 1 % BSA till antikroppsspädningen. Alternativt kan 0,05 mol/l Tris innehållande 0,3 mol/l NaCl och 0,1 % Tween 20, ph 7,2 7,6 (kod S3306) användas som en tvättbuffert. Inkubation av ett separat proteinblockerande reagens (kod X0909) före appliceringen av den primära antikroppen kan också vara nödvändigt. 3g. Använd en svagare spädning 3g. Den primära antikroppen är för starkt koncentrerad. av den primära antikroppen. 4a. Fel slags objektglas används. 4a. Använd poly-l-lysinglas för den största delen av färgningen. Använd Silanized Slides för primära antikroppar som kräver målåtervinningstekniker. 5a. Den primära antikroppen är för starkt koncentrerad. 5b. Inkubationen för den primära antikroppen, biotinylerade länken eller streptavidin-hrp är för lång. 5a. Utför seriella spädningar av den primära antikroppen för att bestämma optimal spädning. 5b. Bestäm lämpligt färgningsprotokoll för antikroppen, dvs. inkubationslängd för den primära antikroppen, den biotinylerade länken och streptavidin-hrp. OBS! Om problemet inte härrör från någon av ovanstående orsaker eller om den föreslagna åtgärden inte löser problemet, kontakta Dakos Tekniska Support för ytterligare hjälp. Ytterligare information om färgningstekniker och provframställning finns i Dakos Immunohistochemical Staining Methods 10 (tillgänglig från Dako), Atlas of Immunohistology 16 och Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 17 (107451-003) 302289SE_001 s. 7/8
Referenser 1. Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979;27(8):1131-9 2. Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984;2(3):161-6 3. Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Atlanta, Georgia. April 30, 1976 4. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976 5. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final rule, 57FR7163. February 18, 1992 6. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe S, Battifora H, Brigati DJ. Quality control in immunohistochemistry. Report of a workshop sponsored by the Biological Stain Commission. Amer J Clin Pathol 1989;92(6):836-43 7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: Principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA. 1991; 4: Order code C24-A 8. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991;66(4):194-9 9. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981:81 10. Key M (ed). Immunohistochemical Staining Methods. 4th Edition. Dako 2006 11. Wood GS, Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981;29(10):1196-204 12. Banerjee D, Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984;37(2):223-5 13. Escribano LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987;35(2):213-20 14. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: American Society of Clinical Pathologists Press 1990; 46 15. Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Am J Path 1980;73(5):626-32 16. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: ASCP Press 1986 17. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques, A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: ASCP Press 1986 Utgåva 05/07 (107451-003) 302289SE_001 s. 8/8