TROSY NMR-analys av större proteiner (> 30 kda) begränsas av två faktorer: -Snabb transvers relaxation hos intressanta spinn (1H, 15N, 13C): och vi behöver ha magnetiseringen i x-y-planet för detektion och manipulering -Snabbare relaxation ju större proteiner
I ett vanligt HSQC spelar vi in 1 H- 15 N- korrelationer, men vi dekopplar för att inte få topparna splittrade av J-kopplingen. Hur gå vidare?
I ett kopplat S-I system (spinn ½) påverkas den transversella relaxationen olika av CSA och dipolär växelverkan för olika magnetiseringsövergångar. Detta blir än mer uttalat för större proteiner, och högre fält.
Figure from review by Sattler & Simon, 2002
Vi kan designa experiment som selektivt väljer ut den smalaste linjen för varje multiplett! Vi förlorar något i toppintensitet (eftersom en del av övergångarna selekteras bort under experimentet) men vi vinner oerhört i upplösning.
TROSY För S. aureus DNA gyrase B, 45 kda Konventionellt HSQC
och så här ser skillnaden ut i 1D-spektra
Här har vi ännu högre molekylvikter! S. aureus 7,8-dihydroneopterin aldolase (DHNA), 110 kda
Vi kan använda dessa metoder för heteronukleär tillordning av stora proteiner. TROSY- HNCA Konventionellt HNCA
NMR på membranproteiner Fernandéz & Wütrich, FEBS Lett. 2003
OBS: proverna måste prepareras, och märkas ( 2 H, 15 H, 13 C)
OmpX OmpA PagP
Dipolära kopplingar Levitt Individuella magnetiska moment skapar magnetiska fält. Dessa påverkar magnetiska fält som skapas vid andra näraliggande magnetiska moment. Växelverkan sker parvis: j påverkar k samtidigt som k påverkar j. I en vätska med isotrop rörelse medelvärdas den dipolära kopplingen ochendastettkemisktshift fåsförvarjeatom. Men vad händer då molekylerna ordnar upp sig?
I en kristall beror det kemiska shiftet också på orienteringen av molekylen relativt det magnetiska fältet, eftersom molekyler med olika orientering upplever olika shielding gentemot det yttre fältet. Levitt
I en slumpvis orienterad fast fas får vi en apparent breddning av det kemiska shiftet, men det är egentligen en summering av alla de olika shift som atomerna visar. H cs cos Levitt
Dipolära kopplingar är symmetriska Storleken på kopplingen är riktningsberoende map yttre fältet, och avståndsberoende. H DD cos 1/r 3 Precis som för J-kopplingar finns par av tillstånd, vilket ger en splittring på två toppar i ett partiellt orienterat system (proteiner/biceller).
Vad händer om vi delvis orienterar molekylerna? Levitt I partiellt ordnade system kan vissa dipolära kopplingar kvarstå (dvs inte medelvärdas). Detta påverkar storleken på den heteronukleära kopplingskonstanten.
Hur ser detta ut i spektra? Residual Dipolar Couplings (RDCs) mäts från skillnaden i icke-dekopplade och dekopplade HSQC spektra, för N-HN, C -H, och C -C. Från denna information kan bindningsvektor-orienteringar beräknas och användas i strukturberäkningar.
Den experimentella RDCn och den teoretiskt beräknade RDCn kan användas för förfining av strukturer. Lipsitz & Tjandra, 2004
Exempel: multidomänproteiner Kristallografi: domänorienteringar påverkas ofta av kristallpackning NMR: ofta för få NOEer mellan domänerna för att definiera en orientering Vad är verkligt?
Om man kan mäta vinkelorienteringen för varje domän i ett partiellt ordnat system vet vi hur domänerna är orienterade i förhållande till varandra!
Domänorientering i kristallstrukturen Domänorientering i lösning m hj av RDCs Fischer et al., Biochemistry 1999
Exempel: Proteininteraktioner LpxA: en trimer ACP Hur binder ACP till LpxA? Viktigt för design av antibakteriella inhibitorer
Kemisk shift-analys vid komplexbindning Jain et al., JMB 2004
tillsammans med RDC-mätningar
gav tillräckligt med information för att kunna docka de två proteinerna.
Användning av RDCs: Förbättra strukturdata map interdomänorientering Snabbt räkna om struktur där domänändringar förväntas vid t ex ligandbindning Förbättra kristallstrukturdata map rörliga loopar Docking och domäninteraktioner Struktur av stora proteiner / komplex
Amidprotonutbyte Hur snabbt byter NH-protonerna ut med omgivande H 2 O? H H H H H H H H H D D D H H H D D H H D D H D D Tiderna för utbytet kan väljas så det passar systemet - från sekunder till dagar (år!). Whittemore et al., Biochemistry 2005
Amidprotonutbyte i nativt HCA I
Amidproton-utbyte i molten globule-tillstånd detekterat i det foldade tillståndet Alfa-lactalbumin, ph 2 Christina Redfields grupp i Oxford
Dynamiskt strukturinnehåll kan uppskattas även om man har få NOEer, här för apo-myoglobins molten globule Redfield, Methods 2004
Kemiskt utbyte för intermediär dynamik, t ex enzymreaktioner Mikael Akke, Lund Dorotee Kerr, Brandeis
Hur skilja mellan ordning och oordning? Calbindin D 9k
Trots att båda siten är Ca 2+ -laddade är loopstrukturerna dåligt bestämda i lösning. RMSD i kristallstrukturen RMSD i NMR-strukturen
Hur utvärdera om verklig oordning eller bara dålig struktur?
Översikt över relaxationsteori (enligt Palmer, Annu Rev Biophys Biomol Str 2001) Relaxationshastigheterna för magnetiska interaktioner (dipolär vxv, CSA och quadropolinteraktioner) är linjärkombinationer av spektraltäthetsfunktionerna, J(w). Det numeriska utseendet på funktionerna påverkas av vilka atomer som är inblandade (13C-O för CO-binding, 15N-H osv) där (t) är en vektor som är parallell till bindningsvektorn mellan de atomer mellan vilka relaxationen studeras (NH, CO, CH).
Spektraltätheten ges av där (t) är en vektor som är parallell till bindningsvektorn mellan de atomer mellan vilka relaxationen studeras (NH, CO, CH).
Beroende på hur man beskriver modellen för rörelsen av bindningsvektorn jämfört med rotationsrörelsen för hela molekylen kan man konstruera olika uttryck för bindningens ordningsparameter.
Två approacher Spectral density mapping: karakterisera alla parametrarna i ekvation 4-6. Kräver mätning vid flera olika fältstyrkor och kräver stor kunskap för att tolka data, men ger mer komplett kunskap om dynamiken. Model-free model (Lipari & Szabo): här utgår man från direkta mätningar av T1 och T2 (R1, R2) samt använder en förenklad beskrivning av spektraltäthetsfunktionen för att bestämma ordningsparametrar.
Experiment Palmer, Curr Biol 1993
Mätningar av T1- och T2-relaxation
Resultat utvärderat som ordningsparametrar För få NOE-er för att definiera strukturen!
Ordnade sites! Oordnad Linker!
Jämförelse av fritt och ligandbundet Calbindin
Sammanfattning: TROSY för höga molekylvikter RDCs för att öka upplösningen för strukturer som är svåra att lösa, stora proteiner, samt multidomänproblem och multiproteinkomplex H-utbyte Kemiskt utbyte Relaxation: Lipari&Szabo model-free model approach (S 2 ) för NH och metylgrupper