NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE

Handledare: Johannes Björnerås, Weihua Ye, Eva Allard NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE EN STUDIE MED NMR-SPEKTROSKOPI AV BEROENDET MELLAN KEMISKT SKIFT OCH PH I FOSFATBUFFER SAMT HUR BICELLERS HYDRODYNAMISKA RADIE PÅVERKAS AV TEMPERATUR OCH TOTAL LIPIDKONCENTRATION YLVALI BUSCH SÖDRA LATINS GYMNASIUM 2013 1

INNEHÅLLSFÖRTECKNING 1. ABSTRACT S.3 2. INLEDNING S.3 3. BAKGRUND 3.1 FRÅGESTÄLLNING S.4 3.2 NMR-SPEKTROMETERN S.4 3.3 CELLMEMBRAN S.4 3.4 BICELLER S.5 4. TEORI 4.1 VAD ÄR SPINN? S.7 4.2 ATOMKÄRNANS MAGNETISKA MOMENT S.8 4.3 NMR SPEKTROMETERNS UPPBYGGNAD S.10 4.4 TILLÄMPNING AV KÄRNMAGNETISK RESONANS KEMISKT SKIFT S.10 4.5 HUR FUNGERAR NMR-SPEKTROMETERN? S.11 4.6 SPEKTRAT S.13 4.7 DIFFUSION S.13 4.8 ATT MÄTA DIFFUSION I NMR-SPEKTROMETERN S.13 4.9BICELLERS STORLEK S.16 5. MATERIAL & METOD 5.1 KEMISKT SKIFT BEROENDE PÅ PH I FOSFATBUFFER S.17 5.2 BICELLERS STORLEK S.18 6. Resultat - KEMISKT SKIFT RELATERAT TILL PH-VÄRDE FÖR 31 P S.19 7. DISKUSSION - KEMISKT SKIFT RELATERAT TILL PH-VÄRDE FÖR 31 P S.20 8. RESULTAT -MÄTNING AV BICELLERS STORLEK S.22 9. DISKUSSION -MÄTNING AV BICELLERS STORLEK S.23 10. AVTACKANDE S.24 11. REFERENSER S.25 2

1. ABSTRACT In this project we sought to explore the basic physics behind NMR spectroscopy and to do so we performed two different experiments. The first one intended to ascertain the relationship between the ph-value and the chemical shift in phosphate buffer. In the second experiment we tried to establish the effect of temperature and total lipid concentration on the hydrodynamic ratio of bicelles. In both cases we used an NMR spectrometer for the measurements and this report also attempts to explain some of the basic physics of MR. In our experiments we could see the effect of increased ph in the spectra, and it was clear that ph and chemical shift are related. Our measurements also showed that the temperature and total lipid concentration affects the size of the bicelles. 2. INLEDNING Vad kan vi veta om livet? Inte livet ur ett psykologiskt perspektiv, utan om processerna som möjliggör livet. Om biologin, kemin och fysiken bakom livet? Hur långt in i kroppen kan vi tränga? Hur små komponenter kan vi studera? Under 1900-talet har vi tagit oss in i kroppen, förbi organen, förbi cellstrukturerna och förbi cellmembranen; in i molekylerna och in i atomerna. Vi plockar isär vår kropp, studerar de byggstenar som utgör den och försöker förstå. Försöker förstå hur det fungerar, hur det hänger ihop. I jakten på förståelsen om processerna som ständigt sker i vår kropp, de processer som utgör själva grunden för att vi kan leva och fungera, måste vi betrakta och studera vår kropp ur olika perspektiv. Medan biologin beskriver helheten och biokemin beskriver detaljerna så beskriver biofysiken istället grunden till detaljerna. Biologin ger en helhetssyn av systemet, biokemin beskriver växelverkan mellan systemets komponenter och biofysiken beskriver själva komponenternas funktion. Genom att förstå detaljerna kan en sedan förstå helheten. Inom biofysiken studeras fysikaliska egenskaper och förlopp i biologiska material och fysikaliska metoder används för att förstå livet bättre. I det här arbetet har biologin studerats utifrån dess minsta beståndsdelar. Vi har trängt in i atomen, studerat detaljerna, för att sedan försöka pussla ihop helheten. Det här arbetet har inte handlat om att göra banbrytande upptäckter. Det har inte handlat om att se det som ingen annan sett. Det har handlat om detaljer och helhet. Det har handlat om att försöka förstå en liten del av fysiken bakom livet. Teorin bakom dina andetag, dina celler och din existens. Det har handlat om atomkärnans grundläggande egenskaper och hur vi kan använda dessa för att försöka pussla ihop helheten. 3

3. BAKGRUND 3.1 FRÅGESTÄLLNING Den här studien består av två olika delar men gemensamt för båda är att fysikaliska metoder använts för att få ökad kunskap om biologiska processer. I den första delen av studien studerades ph-värdet i fosfatbuffert utifrån följande frågeställning; Beror det kemiska skiftet för 31 P (i PO-4) på ph-värdet? Den andra delen av studien handlade istället om biceller, vilket är en typ av membranmodell, och framförallt huruvida den hydrodynamiska radien hos bicellerna påverkas av faktorer som temperatur och total lipidkoncentration. 3.2 NMR-SPEKTROMETERN I båda delarna av studien användes en NMR-spektrometer för att besvara frågeställningarna. Med NMR-spektrometern kan vi få information om levande system på en atomär och molekylär nivå och tekniken hjälper oss att studera struktur, dynamik, samverkan och kinetik hos bl.a. DNA-molekyler, peptider och proteiner. NMR () utnyttjar de magnetiska egenskaperna hos atomkärnor och 1952 fick Bloch och Purcell (USA) Nobels fysikpris för utvecklingen av metoder för att bestämma atomernas magnetism, en upptäckt som de gjort sju år tidigare, vilket banade väg för utvecklingen av NMR.spektrometern. (2/3) På 1950-talet kom ytterligare ett genombrott; upptäckten gjordes att resultatet från NMR-spektrometern inte bara berodde på atomkärnans egenskaper, utan också på dess kemiska omgivning. Men hjälp av NMR kan alltså antal och typ av funktionella grupper hos en molekyl bestämmas. (4) 3.3 CELLMEMBRAN Alla djurceller, dvs. alla celler i våra kroppar, är omgärdade av ett membran som är uppbyggt av ett dubbelskikt av fosfolipider vilka är estrar av två fettsyror och en glycerolenhet. Till glycerolenheten är också en fosfatgrupp bunden till vilken ytterligare en hydrofil grupp är bunden. Fettsyraenheterna är däremot hydrofoba vilket gör att fosfolipiden består av både en vattenlöslig del, och en del som inte löser sig i vatten. I vattenlösning kommer de hydrofila enheterna binda till vattenmolekylerna med jon-dipolbindingar medan kolvätekedjorna i fosfolipden kommer binda till varandra. Även om cellmembranet bara består av två skikt av fosfolipider och är mellan 6-10 nm tjockt kan det hålla två helt olika lösningar åtskilda från varandra. (1) Även om membranets grundläggande struktur och egenskaper byggs upp av och beror på dubbelskiktet av fosfolipiderna så är de biologiska membranens specifika egenskaper till stor del beroende på vilka membranproteiner som är bundna till membranet. Det är alltså membranproteinerna som ger membranet dess karakteristiska funktionella egenskaper. Olika membranprotein ger cellen olika möjligheter att kommunicera olika signaler, transportera 4

olika ämnen osv. och beroende på vilken typ av funktion cellen har så ser membranproteinerna olika ut. Både typer av membranprotein och totalt antal kan variera stort mellan olika cellspecifika membran. (5) Membranproteiner är proteiner som är bundna till biologiska membran, antingen temporärt eller permanent. Membranproteiner fyller en rad vitala funktioner och det uppskattas att mellan 20-30% av våra gener kodar för just dessa typer av proteiner. (6) Vissa membranproteiner fungerar som membranreceptorer och de kommunicerar signaler mellan cellens inre och den yttre omgivningen. Andra membranprotein transporterar bort slaggprodukter eller så transporterar de in eller ut molekyler och joner. Membranproteinerna låter också cellerna identifiera varandra och interagera. Detta är en viktig funktion för celler som exempelvis är involverade i immunförsvaret. (6) 1. Cellmembranets uppbyggnad med dubbelskiktet av lipider samt tre olika typer av membranproteiner; transporterande proteiner, membrankanaler och receptorer. Att förstå hur membranproteiner fungerar, hur de påverkar cellmembranets egenskaper och hur de interagerar med molekyler och joner är ett viktigt steg för att förstå våra celler. Eftersom membranproteinerna reglerar hela cellens kommunikation och transport finns nyckeln till förståelse om cellen i membranproteinerna. Över 50 % av de moderna medicinerna verkar genom att påverka membranproteinerna på ett eller annat sätt. Därför kan ökad förståelse om membranproteiner innebära stora framsteg inom den medicinska forskningen. (7) 3.4 BICELLER Då cellmembran är både för komplicerade och för stora för att enskilda membranproteiners funktion ska kunna studeras används membranlika modeller vid sådana studier. En sådan modell som har som syfte att efterlikna cellmembran är biceller. Biceller är sammansatta av två typer av fosfolipider; DMPC och DHPC. DMPC består av en lång kolkedja vilket gör molekylen olöslig i vatten medan DHPC består av en kortare kolkedja vilket innebär att DHPC är lösligt i vatten. När DMPC löses i vatten bildas utbredda dubbelsidiga skikt med de hydrofila fosfatgrupperna utåt och de opolära kolkedjorna inåt medan DHPC har tillräckligt korta kolkedjor för att det ska bildas en klotformad struktur, s.k. miceller med en radie i storleksordningen 20 Å. (9) Den huvudsakliga drivkraften när fosfolipiderna ordnas är den s.k. hydrofoba effekten vilken gör att bildningen av miceller eller dubbelskikten sker spontant. Den hydrofoba effekten innebär att opolära ämnen samlar ihop sig på ett sådant sätt att kontaktytan mot 5

vattenmolekylerna minimeras. Detta förklaras huvudsakligen med att entropin för vattnet ökar eftersom vattenmolekylerna annars ordnar sig runt den opolära ytan. För att det ska bildas miceller måste totalkoncentrationen av DHPC vara tillräckligt hög, detta kallas Critical Micell Concentration, CMC. Mängden molekyler under CMC av DHPC kommer alltid vara lösta, oavsett hur hög koncentrationen blir. Detta måste tas hänsyn till när förhållandet mellan DHPC och DMPC, det s.k. q-värdet, ska räknas ut. Även om miceller har förenklat forskningen på membranproteiner dramatiskt eftersom de är små objekt bestående av endast en komponent, så är de en väldigt förenklad modell av cellmembranet eftersom de inte har ett dubbelskikt av fosfolipider. Även den kraftigare krökningen av miceller jämfört med cellmembran innebär komplikationer då det 2. Kemisk struktur för DMPC och snedvrider hur proteinet binder till membranet. DHPC Istället används Biceller som med sitt dubbelskiktiga lipidlager och större radie i större utsträckning efterliknar ett cellmembran. Det är när DHPC och DMPC löses i samma lösning som bicellerna bildas. Förhållandet mellan koncentrationen av DMPC och DHPC kallas q-värde och påverkar bicellernas utseende. När biceller bildas binds lipiderna med 3. Bicellens uppbyggnad längre kolkedjor till varandra i ett utbrett dubbelskikt och lipiderna med kortare kolkedjor binds till detta skikts ytterkanter vilket gör att bicellen får en sluten skivform (se figur). (8) Genom att studera och förstå olika membranmodeller ökar förståelsen om membranmodellernas biofysikaliska egenskaper och därigenom förståelsen för vilken typ av membranmodell som ska användas vid vilken typ av studie. Membranmodeller som bl.a. biceller och miceller har inneburit att forskning inom membranproteiner rönt stora framgångar. (8/17) 6

4. TEORI - DEN FYSIKALISKA BAKGRUNDEN TILL NMR 4.1 VAD ÄR SPINN? En atomkärna har fyra fundamentala egenskaper; massa, elektrisk laddning, spinn och magnetiskt moment. Dessa fyra egenskaper definieras efter vilken typ av växelverkan de ger upphov till. Precis som att frågan vad är massa? besvaras genom att beskriva hur massan växelverkar med gravitationen och ger upphov till en tyngd så kan vi beskriva spinn efter vilka egenskaper den får atomen att uttrycka. När en konståkare gör en piruett och drar in sina armar ökar rotationshastigheten. Orsaken är att en storhet som heter rörelsemängdsmoment måste bevaras. Alla objekt som roterar har rörelsemängdmoment. Spinn är en kvantmekanisk egenskap som ger partiklar ett inbyggt rörelsemängdmoment utan att de egentligen roterar. Då alla partiklar endera är laddade, eller är uppbyggda av laddade partiklar, kommer detta rörelsemängdsmoment ge upphov till ett magnetiskt moment eftersom laddade partiklar i rörelse ger ju upphov till ett magnetfält. Partiklar med spinn beter sig alltså som små magneter. Likt att modellen för elektroner är uppbyggd av en tanke att elektronerna kretsar runt atomkärnan i olika skal, som motsvarar energinivåer, så är det möjligt att ställa upp en modell för atomkärnan där protonerna och neutronerna kretsar i olika skal. Enligt modellen befinner sig nukleonerna alltså i olika kvantiserade energinivåer och precis som elektroner så är det möjligt för nukleonerna att fylla upp ett s.k. skal. Nukleonerna rör sig i ett slags effektiv potential som skapas av kraften hos de övriga kärnpartiklarna och modellen innebär att det är den enskilda nukleonens inre impulsmoment, eller spinn, som påverkar energinivåerna i vilken kärnan kan befinna sig. (10) Intuitivt kan detta tyckas omöjligt; hur kan kärnpartiklarna fullfölja sina kretslopp i den kompakta kärnan, där den starka kraften för partiklarna samman, utan att krocka med varandra? Om vi betraktar nukleonernas rörelse som en slags stående våg så säger Paulis uteslutningsprincip att deras vågrörelse måste vara antisymmetrisk, detta innebär att två fermioner (partiklar med halvtalsspinn, såsom protoner och neutroner) inte kan existera i samma kvanttillstånd. Om det inte finns ett möjligt kvanttillstånd inom räckhåll för interaktionens energi, så kommer interaktionen alltså inte äga rum. (12) Med andra ord, partiklarna kan inte krocka med varandra eftersom det skulle ändra deras energi men det finns inga lediga energitillstånd i närheten. Precis som att atomkärnans massa definieras av ett tal så definieras atomkärnans spinn efter ett spinntal och precis som för atomkärnans masstal så är spinntalet unikt för varje isotop. Det är fördelningen av neutroner och protoner som bestämmer kärnans spinntal. Varje nukleons spinn har ett värde av ½ och kärnans totala spinn är alltså en multipel av halvtal, med antingen 7

ett positivt eller negativt värde som beskriver hur nukleonens magnetiska moment linjerar sig i ett yttre magnetfält. Spinn beskrivs av kvanttalet S och atomkärnans energisplittring för ett visst energitillstånd i ett magnetfält svarar mot S, S+1, S-1, S. Att S är kvantiserat betyder att atomkärnan inte har ett kontinuerligt energispektra utan energinivåerna kan bara anta specifika värden. (12) 4.2 ATOMKÄRNANS MAGNETISKA MOMENT Ett objekt med magnetiskt moment μ som påverkar av ett magnetfält B vinkelrätt mot momentet påverkas av kraftmomentet M = μb som försöker vrida momentet i fältets riktning. Ett exempel är magneten i en kompass vars magnetiska moment gör att den vrids av jordens magnetfält tills dess moment och magnetfält är parallella. Ett annat exempel är en strömförande slinga som har ett magnetiskt moment och i ett magnetfält därför vrids vilket är principen bakom en elmotor. Kvantmekaniska partiklar är endera laddade själva eller består av laddade elementarpartiklar. Klassiskt ger laddade partiklar i rörelse upphov till magnetiska moment. Det visar sig att impulsmomentet I, spinnet, hos kvantpartiklar också ger upphov till ett magnetiskt moment: μ = γi. Atomkärnans spinn beskriver en vektor för kärnans magnetiska moment och det är således spinn som beskriver kärnans egenskaper i ett magnetfält. Förhållandet mellan spinntalet,, och det magnetiska momentet, µ, beskrivs av den magnetogyriska ration, vilken är unik för varje enskild isotop, enligt sambandet: µ = Utan påverkan av ett yttre magnetfält så har de olika spintillstånden samma energi och det magnetiska momentet kommer att orientera sig slumpmässigt. Utan yttre magnetfält kommer atomkärnans spinntal alltså inte ge upphov till några effekter, precis som att en partikels laddning inte inverkar på partikelns egenskaper om den inte har ett yttre elektriskfält att växelverka med. Spinntalet ger alltså upphov till ett magnetiskt moment om det finns ett yttre magnetfält för det kärnmagnetiska momentet att linjera sig med. (11) 8

Rotationsaxeln för kärnans magnetiska moment orienterar sig beroende på dess spinntal. Väteatomens kärna, alltså protonen, har två möjliga spinntillstånd och kan linjera sig parallellt/anti-parallellt med flödeslinjerna för det yttre magnetfältet som vi antar är B0. Övriga atomkärnor kan ha fler spinntillstånd då rotationsaxeln kommer ligga på en vinkel, v i förhållande till flödeslinjerna för B0. Kärnans magnetiska moment precesserar runt rotationsaxeln med vinkelhastigheten o = B 0,, 4. Väteatomen har två möjliga spintillstånd; +1/2 och ½. Spintillstånden beskriver hur det magnetiska momentet precesserar i det magnetiska fältet vars flödeslinjer följer Sz Hur nukleidens magnetiska moment orienterar sig i magnetfältet svarar direkt mot vilken energinivå kärnan befinner sig i. Skillnaden på energinivåerna beror på styrkan hos det yttre magnetfältet, B0, och motsvarar frekvensen med vilken kärnan precesserar. Antalet energinivåer kärnan kan befinna sig i beror på spinntalet. Eftersom energitillståndet för en atomkärna svara mot det kvantiserade spinntalet så kommer den magnetiska dipolens orientering i rummet också vara kvantiserad. (12). Den energimässigt fördelaktiga orienteringen för kärnpartiklarnas magnetiska moment är den då det magnetiska momentet linjerar sig parallellt med det yttre magnetfältets flödeslinjer och atomen har spinn n + ½. Spinn (n + ½) innebär att det magnetiska momentet för kärnpartiklarna orienterat sig i negativ riktning i förhållande till flödeslinjerna vilket kräver ett högre energinivåtillstånd. Förhållandet mellan antalet atomkärnor som befinner sig i respektive spinntillstånd är en faktor som avgör intensiteten på den uppmätta frekvensen av atomkärnornas resonansfrekvens i NMR-spektrometern. 5. Det är mer fördelaktigt för kärnpartiklarna att ha ett positivt värde på spin eftersom kärnan då befinner sig i ett lägre energitillstånd. Ju starkare magnetfält desto större blir energigapet mellan tillstånden vilket gör att fler av partiklarnas magnetiska moment kommer linjera sig med magnetfältets flödeslinjer. 9

(11) Om det yttre magnetfältet B0 är stort kommer skillnaden mellan antalet kärnpartiklar i de olika energistånden också vara stort eftersom det blir mer och mer energimässigt fördelaktigt att linjera sig med magnetfältet, och svårare att linjera sig mot. Detta innebär att energin hos partiklarna splittas av magnetfältet. Som tidigare sagt så beskriver atomkärnans spinn en vektor för kärnans magnetiska moment. Denna vektor är en summering av nukleonernas individuella vektorer. Spinntalets negativa/positiva värde beskriver riktningen för det magnetiska momentets vektor hos varje nukleon. När vektorerna summeras tar de negativa och positiva vektorerna ut varandra och det kommer alltså bara vara överskottet av vektorerna som är 6. Kärnpartiklarnas olika magnetiska moments parallella med fältet (en parallell vektor vektorer summeras vilket ger atomkärnan som beskriver ett fördelaktigare energitillstånd) som helhet en storlek för det magnetiska momentets bestämmer kärnans totala vektor. En större vektor, M. Det är sedan denna vektor som vektor kommer innebära att atomkärnan har ett kommer inducera en ström av en viss frekvens i spolen i NMR-spektrometern. större magnetisk moment vilket medför att en större ström kommer induceras i den spole i NMR-spektrometern där atomkärnans magnetiska moment låts inducera en ström. Intensiteten av resonansfrekvensen är alltså proportionell mot förhållandet mellan antalet atomkärnor som befinner sig i respektive energitillstånd. Ju större skillnad det är mellan energitillstånden desto fler atomkärnor kommer befinna sig i det energifördelaktiga tillståndet, dvs. den inducerade strömmen blir större vilket innebär att signalen blir tydligare och små skillnader lättare att se. Eftersom styrkan på det yttre magnetfältet påverkar skillnaden mellan energitillstånden så är det alltså fördelaktigt med ett så starkt magnetfält som möjligt eftersom fler atomkärnor då linjerar sig med fältet. Även temperaturen påverkar fördelningen eftersom temperatur egentligen bara är ett mått på materiens inneboende rörelseenergi. Hög temperatur innebär alltså att det finns mer energi tillgängligt, och fler atomkärnor kommer kunna linjera sig i negativ riktning med fältet. (12) 4.3 NMR SPEKTROMETERNS UPPBYGGNAD För att detektera resonansfrekvensen hos atomkärnor används en NMR-spektrometer. NMRspektrometern består av ett starkt homogent magnetfält (~10 T) som induceras av en spole. Spolen omges av flytande helium vilket håller en temperatur på ca 4 K (-269 C). Heliumet i sin tur kyls ner av flytande kväve. Att temperaturen är nära den absoluta nollpunkten innebär att resistansen i spolen är nära noll och spolen liknar en supraledare. Eftersom resistansen är så låg så kommer strömmen färdas i spolen även om det inte finns någon spänningsskillnad. 10

NMR-spektrometern är alltså inte kopplad till ett eluttag utan när strömmen letts in i spolen kommer den fortsätta inducera en spänning tills heliumet avdunstar och temperaturen höjs. 4.4 TILLÄMPNING AV KÄRNMAGNETISK RESONANS KEMISKT SKIFT När det yttre magnetfältet i NMR växelverkar med atomkärnorna i en given molekyl börjar de precessera enligt en isotop-specifik resonansfrekvens som beror på det omgivande magnetfältets styrka. Atomen som helhet har även den magnetiska egenskaper där vi tillexempel kan tänka oss elektronen som en laddning i en ledare. Elektronen kommer då ge upphov till ett magnetiskt fält som kommer påverka de omgivande atomerna i molekylen. Dessa fält kommer motverka det yttre omgivande fältet enligt Lenz lag. (En inducerad spänning är alltid sådan, att den ström den ger upphov till, är riktad så att den motverkar orsaken till sin uppkomst.). En given atomkärna i en molekyl kommer alltså uppleva ett lokalt fält som är beroende av hur dess omgivande miljö ser ut. Eftersom det upplevda fältet för varje atomkärna påverkar med vilken resonansfrekvens de precesserar, då det yttre magnetfältet påverkar energinivåerna som resonansfrekvensen svarar mot, så leder detta till att olika protoner i molekylen kommer precessera med olika frekvens beroende på dess position i molekylen. Kan denna frekvensskillnad uppmätas fås information om protonens omgivning och position i molekylen. Med hjälp av detta kan alltså molekylers struktur kartläggas. (13/18) För att kunna uttrycka frekvensskillnaden så jämförs den med en godtyckligt vald referensfrekvens. Om frekvensen för en proton i en molekyl ska mätas skulle referensfrekvensen idealt vara den frekvens med vilken en helt isolerad proton, utan inverkan av andra atomer, skulle precessera i det yttre magnetfältet. Eftersom detta är omöjligt att mäta så använder man antingen en uppskattad frekvens av detta värde eller väljer en frekvens tillhörande en proton med känd omgivning som referensfrekvens. Det tillsätts då lite av det ämne som ska användas som referens i det prov där den molekyl som ska mätas finns och nollnivån anpassas efter dess resonansfrekvens. Frekvensskillnaden mellan den frekvens det lokala magnetfältet ger upphov till och referensfrekvensen uttrycks som det kemiska skiftet. Det kemiska skiftet beskriver alltså hur mycket atomkärnan påverkas av lokala magnetfält vilket beskriver atomkärnans omgivning. (12) 4.5 HUR FUNGERAR NMR-SPEKTROMETERN? Det magnetiska momentet hos atomkärnan precesserar runt en rotationsaxel med en viss frekvens. NMR utnyttjar detta genom att låta atomkärnans magnetfält inducera en ström i en spole. Precessionen av det magnetiska momentet innebär att den inducerade strömmen kommer följa en sinuskurva med samma frekvens som atomkärnans resonansfrekvens. Den inducerade strömmens frekvens ger alltså direkt resonansfrekvensen. NMR-spektrometern mäter det kemiska skiftet för alla atomkärnor i alla molekyler i provet med samma resonansfrekvens eftersom de protoner som har samma omgivande miljö kommer inducera en ström med samma frekvens, det vi mäter är alltså en nettosignal. (12) Det yttre magnetfältet som går längs z-axeln är för starkt för att skillnaden i de lokala fälten ska kunna mätas i samma plan. För att kunna inducera en ström i spolen måste det magnetiska 11

momentet istället tippas nittio grader så att det befinner sig längs med det horisontella planet. Rent praktiskt innebär detta att det läggs på ett svagt magnetfält som följer med kärnans frekvens och knuffar det magnetiska momentet neråt mot horisontalplanet för varje varv. Tillslut befinner sig det magnetiska momentet i horisontalplanet. Det är spolen i horisontalplanet som inducerar denna ström och vid mätningen, som sker med samma spole, stängs detta magnetfält av. Atomkärnans magnetiska moment kommer då för varje varv återgå till sin ursprungliga position under mätningen vilket gör att intensiteten på signalen snabbt minskar. (12) 12

4.6 SPEKTRAT Det som mäts i NMRspektrometern är det kemiska skiftet. Det kemiska skiftet är värdet på hur mycket varje protons resonansfrekvens avviker från den valda referensfrekvensen, dvs. hur mycket de omgivande atomerna påverkar atomkärnans upplevda magnetfält. Det kemiska skiftet mäts i ppm och fås fram genom att man subtraherar den uppmätta resonansfrekvensen med referensresonansfrekvensen och dividerar med referensresonansfrekvensen. Om atomkärnor i molekyler har likadan omgivning kommer deras magnetfält att påverkas lika och deras resonansfrekvens sammanfaller. Ett exempel: Metanmolekylen har fyra väteatomer som har identisk omgivning med varandra, vätekärnornas kemiska skift kommer alltså ha samma frekvens och intensiteten på toppen kommer alltså vara fyra gånger så hög som det kemiska skiftet för en av väteatomerna. (12) Stora molekyler med komplicerade strukturer kommer ha ett avancerat spektra med många olika kemiska skift och många gånger är det mycket svårt att läsa ut en större molekyls struktur. 4.7 TILLÄMPNING AV KÄRNMAGNETISK RESONANS - DIFFUSION Diffusion är processen där molekyler sprider sig slumpmässigt i ett material under en tid. Ett mått på diffusion är ett mått på den slumpartade rörelsen hos ett ämnes molekyler under en viss tid. Temperatur är ett mått på partiklarnas rörelseenergi, och alla partiklar som har en temperatur över den absoluta nollpunkten kommer röra sig och kollidera med andra partiklar slumpartat. Hur mycket partiklarna i ett ämne rör sig beror på ett flertalfaktorer, t.ex. på just temperaturen, mediets viskositet genom vilket partiklarna färdas och på partiklarnas storlek. (16) 4.8 ATT MÄTA DIFFUSION I NMR-SPEKTROMETERN 7. Kemiskt skift för 1 H i Mentol. Varje vätekärna har ett karakteristiskt kemiskt skift som beror på det lokala magnetfältet som atomkärnan upplever. I Metylgrupp a är vätekärnorna bundna så att det lokala magnetfält de upplever är närmast identiskt detta gör att kärnorna kommer precessera med samma frekvens och intensiteten på topp a blir också tre gånger så hög. Om atomkärnornas magnetiska moments vektor betraktas i ett tredimensionellt koordinatsystem kommer det magnetiska momentets vektor precessera kring z-axeln. 13

Frekvensen är mycket hög (runt 600 MHz för en vätekärna i fältstyrkan ~10T), och det blir svårt att studera skillnader mellan olika vektorer. Om vi istället betraktar det magnetiska momentets vektor i ett tänkt koordinatssystem som rör sig med samma frekvens som den valda referensfrekvensen kommer vektorn att röra sig med den frekvens som beskriver det kemiska skiftet, dvs. vektorn kommer precessera med den resulterande hastigheten av det lokala magnetfältet och det yttre magnetfältet. Denna frekvens är mycket lägre och således enklare att studera. Med grund i denna tanke så kan diffusionsstudier i NMR förklaras på följande vis: Istället för att det yttre magnetfältet är helt uniformt så tillåts ett graderat magnetfält påverka provet. Molekyler i olika delar av provet kommer då uppleva olika magnetfält och de olika molekylernas atomkärnor kommer precessera med olika resonansfrekvens. (19) Vi tittar på en vätekärna, en proton, i molekyl A. Antagandet att molekylerna i provet inte rör sig är gällande. Protonen i molekyl A upplever ett specifikt magnetfält beroende på var den befinner sig. Vi låter magnetfältet inverka på molekylen under tiden t. Protonen kommer under denna tid att precessera med en viss frekvens och hinna ett visst antal varv. Vi låter sedan magnetfältet byta riktning och inverka på protonen under samma tid, t. Detta innebär att protonen känner av ett magnetfält av samma storlek men med motsatt riktning och protonen kommer således nu precessera i motsatt riktning med samma frekvens. När tiden t passerat kommer protonens magnetiska moment att befinna sig i samma position som i utgångsläget eftersom samma sträcka tillryggalagts i motsatt riktning. Betraktas samma proton i molekyl B, som befinner sig i en annan del av provet med ett högre värde på magnetfältet, så kommer denna proton att precessera med en snabbare frekvens än A. Protonens magnetiska vektor kommer hinna längre än A:s under samma tid, men kommer även den att vridas tillbaka till utgångsläget när magnetfältet byter riktning och samma tid får passera. B 0 Magnetfältet är en gradient, detta innebär att molekyl B kommer påverkas av ett starkare magnetfält än molekyl A och atomkärnorna i B kommer precessera med en högre frekvens än atomkärnorna i A. Genom att märka in molekylernas position på detta sätt kan vi mäta diffusionen. Men molekylerna, och därmed protonerna, kommer röra sig slumpmässigt i provet vilket innebär att det magnetiska momentets vektor inte kommer kunna återfokuseras. När molekylen rör sig i provet under tiden t, så kommer det upplevda magnetfältets styrka bero på dess position i gradienten och protonen kommer därmed precessera med olika frekvens beroende på sin position. Detta medför att molekylens rörelse kommer inverka på sträckan 14

som det magnetiska momentets vektor tillryggalägger. När riktningen på magnetfältet byts börjar det magnetiska momentets vektor precessera i motsatt riktning. Protonen rör sig fortfarande slumpvis, och upplever således olika styrka på magnetfältet, och om den inte rör sig i exakt samma bana tillbaka till det fysiska utgångsläget så kommer positionen för det magnetiska momentets vektor skilja sig från det magnetiska momentets vektors position i utgångsläget. (19/8) B 0 -B 0 Utgångsläge, t 0. Det magnetiska momentets vektor ligger i riktning mot spolen. En gradient har verkat under tiden t och det magnetiska momentets vektor har färdats en längd l. En negativ gradient har verkat under tiden t, vektorn är inte helt återfokuserad vilket innebär att y- komposanten är mindre än i utgångsläget dvs. signalens intensitet är mindre. Spolen som mäter den inducerade strömmen är placerad i riktning med y-axeln. Spolen där ström induceras av protonernas magnetiska nettosignal påverkas alltså bara av y-komposanten till det magnetiska momentets vektor. Efter att de båda riktningarna på magnetfältets gradient låtits verka befinner sig vektorerna inte längs x-axeln eftersom total återfokusering inte är möjlig. Detta innebär att styrkan på den inducerade strömmen minskat. Eftersom gradienten i fältet skapar ett beroende mellan molekylernas rörelse och det upplevda magnetfältet, och därmed med atomkärnornas resonansfrekvens, beror återfokusering helt på molekylernas diffusion. Genom att mäta nettosignalens intensitet efter att vi låtit ett graderat magnetfält med positiv och sedan negativ riktning verka under lika tid, t, och för flera olika gradientstyrkor, kan molekylernas diffusionskonstant bestämmas genom att en teoretisk funktion passas till uppmätt signalintensitet som funktion av gradientstyrka. (19) 15

4.9 BICELLERS STORLEK Om diffusionsmätningar utförs på statiska partiklar, alltså partiklar vars storlek och form inte beror på temperaturen, är sambandet mellan diffusion och temperatur linjärt. Högre temperatur innebär mer energi och mer rörelse. Partikelns storlek inverkar också på rörelsen och en liten partikel kommer röra sig mer, alltså få en högre diffusionskonstant, eftersom det krävs mindre energi för partikelns rörelse. Men eftersom bicellernas storlek beror på temperaturen så blir sambandet mellan temperatur och diffusion komplicerat: I = e Dx2 Intensiteten, I, uppmäts med hjälp av NMR-spektrometern. D är diffusionskonstanten och x beskriver en lång rad olika konstanta förhållanden som påverkar partiklarnas rörelse, ex. vätskans viskositet. Genom att räkna ut diffusionskonstanten vid given temperatur kan bicellernas radie bestämmas enligt följande funktion: D = kt 6πηR H Där k är Boltzmanns konstant, T är rådande temperatur, RH är bicellens hydrodynamiska radie och η är lösningsmedlets viskositet. (15/8) 16

5. MATERIAL & METOD 5.1 KEMISKT SKIFT BEROENDE PÅ PH I FOSFATBUFFER Två stamlösningar förbereddes med koncentrationen 1 M enligt formlerna n = m M och n = c v Där n är antal mol, m är massan, M är molmassan, c är koncentrationen och v är volymen. A. 1 M Na2HPO4 3.58g Na2HPO4 (s) vägdes upp. 10 ml D2O tillsattes sedan och provet både vortexcentrifugerades och värmdes för att lösningen skulle lösa sig. B. 1 M NaH2PO4 1.38 g NaH2PO4 (s) vägdes upp. 10 ml D2O tillsattes därefter och provet både vortexcentrifugerades och värmdes för att lösningen skulle lösa sig. Dessa båda stamlösningar blandades sedan enligt tabell 1: Volym av 1 M Na2HPO4 (µl) Volym av 1 M NaH2PO4 (µl) 0 50 3 47 6 44 15 35 29 21 41 9 50 0 De sju blandade lösningarna späddes till volymen 1000 µl med dubbeldestillerat D2O. phvärdet mättes sedan med en ph-elektrod, till resultaten i tabell 2. Volym av 1 M Na2HPO4 (µl) Volym av 1 M NaH2PO4 (µl) ph-värde 0 50 3.58 3 47 5.86 6 44 6.09 15 35 6.64 29 21 7.14 41 9 7.79 50 0 9.20 Med hjälp av en NMR-spektrometer (600 MHz) uppmättes sedan lösningarnas kemiska skift. 17

5.2 BICELLERS STORLEK Till det andra experimentet eftersöktes en lösning med totalkoncentrationen 300mM av biceller. Lösningens volymen skulle vara 500 ml och ha ett q-värde på 0,5. Totalkoncentrationen 300mM med q-värdet 0,5 ger en koncentration av DHPC på 200mM och en koncentration av DMPC på 100mM. 33.9 mg DMPC mättes upp och... mg av DHPC mättes upp innan båda mängderna tillsattes i ett prov med 500 ml D2O. provet undersöktes i en NMR-spektrometer och diffusionen uppmättes vid temperaturerna 20 C, 25 C,37 C och 45 C. Därefter späddes provlösningens koncentration till 150mM genom att vi tillsatte 500 ml D2O innan volymen sedan minskades ner igen till 500 ml. Undersökningen upprepades sedan igen med samma temperaturer. Därefter halverade vi koncentrationen ännu en gång ner till 75mM genom att tillsätta ytterligare 500 ml D2O innan volymen återställdes till 500 ml igen. Sedan upprepade vi undersökningen i NMR-spektrometern ännu en gång med samma temperaturer. 18

6. RESULTAT - KEMISKT SKIFT RELATERAT TILL PH-VÄRDE FÖR 31 P Det kemiska skiftet för 31P med olika ph-värden redovisas i tabell 3: ph-värde Kemiskt skift (ppm) 3.58 0.1443 5.86 0.3681 6.09 0.4961 6.64 1.0158 7.14 1.8023 7.79 2.3639 9.20 2.6298 Värdena passades till funktionen : ω m = ω 1 + ω 2 10 ph pk2 1 + 10 ph pk2 19

7. DISKUSSION - KEMISKT SKIFT RELATERAT TILL PH-VÄRDE FÖR 31 P Fosfatbuffer finns i alla celler, och om vi kan mäta ph-värdet hos fosfatbuffer genom att studera det kemiska skiftet får vi en metod som innebär att vi kan mäta ph inuti cellen, till och med inuti cellens komponenter, vilket är väldigt värdefullt för många typer av forskning. Om det ska studeras hur molekyler samverkar med biologiska membran skulle en kunna använda sig av olika ph-värden innanför och utanför membranet och på så sätt kan det ses i ph-förändringarna huruvida molekylen tagit sig förbi membranet. Att studera hur de biologiska membranen växelverkar med t.ex. proteiner kan ge vital information om cellmembranens och/eller proteiners funktion. Därför kan ph-mätning med hjälp av NMR hjälpa forskningen framåt i dessa områden då det är en ph-mätning som inte skadar cellsystemet. Det kemiska skiftet är som tidigare förklarat beroende på en atomkärnas kemiska omgivning. Eftersom ph är ett mått på antalet vätejoner är det rimligt att det kemiska skiftet förändras med ph-värdet. En förändring i ph-värdet ger ju en förändring för 31 P:s kemiska omgivning. Enligt Kazuo Yoshizaki (et. al; Intracellular ph measurement in frog muscle by means of 31P nuclear magnetic resonance: Japanese journal of physiology, 29, 211-225, 1979) så ser beroendet mellan ph-värdet och det kemiska skiftet idealt ut som följer: ω m = ω 1 + ω 2 10 ph pk2 1 + 10 ph pk2 ω m beskriver det kemiska skiftet, ω 1, ω 2 beskriver vändpunkter för det kemiska skiftet, och mycket riktigt planar vår anpassade kurva ut vid högt/lågt ph. pk2 är en konstant som beskriver hur H2PO4 dissocierar, alltså protolyseras till H + och en korresponderande bas, för pk2 användes ett värde från litteraturen: 6.85. medan ω1 och ω2 passades fram från vår uppmätta data. ω1 = 0.0261 ω1 = 2.66 Om ph ska fastställas utifrån ett uppmätt kemiskt skift, t.ex. som ph ska mätas inne i cellen, fås: ph = pk2 + log ω m ω 1 ω 2 ω m 20

Att två mätningar i vår undersökning, inom ett ganska litet ph-intervall, gav avvikande värden från den passade kurvan kan eventuellt förklaras med att ph-värdet inte uppmättes helt riktigt. Det kan dock vara så att modellen just i detta område av ph-värden inte överrensstämmer, därför skulle utförligare mätningar behöva göras. I övrigt stämmer våra mätningar väldigt bra överens med modellen. 21

8. RESULTAT -MÄTNING AV BICELLERS STORLEK Diffusionskonstanten vid varierande temperatur och varierande total koncentration av biceller uppmättes i NMR-spektrometern och resultaten visas i tabell 4. 20 C 25 C 37 C 45 C 300 mm 3.8 4.3 6.2 1.9 150 mm 4.5 5.4 2.0 2.8 75 mm 4.6 5.3 6.8 15 Genom att använda den uppmätta diffusionskonstanten får vi ut bicellernas radie(nm) ur formeln, bicellernas radie anges i tabell 5: R H = kt/6πηd 20 C 25 C 37 C 45 C 300 mm 4,52 4,52 4,10 15,42 150 mm 3,83 3,56 12,21 10,57 75 mm 3,83 3,56 3,71 2,02 22

9. DISKUSSION -MÄTNING AV BICELLERS STORLEK När membran ska studeras används ofta olika slags membranliknande substitut. Beroende på vad som ska studeras är det viktigt att ha kunskap om dessa membranmodellers struktur och egenskaper. Biceller är en sådan modell och kunskapen gällande hur preparatet med DMPC och DHPC ska prepareras, och under vilka förutsättningar som bicellerna har vilken storlek och struktur är en viktig del för att kunna utföra riktiga undersökningar med biceller som membranmodell. Storleken på bicellerna spelar stor roll när en ska studera exempelvis hur membranproteiner interagerar med cellmembranet. Är t.ex. proteinet som ska studeras större än bicellen så säger det sig själv att bicellen och proteinet inte kommer att interagera. Det är också viktigt att förstå under vilka förhållanden som biceller bildas. Är det viktigt att ha en viss temperatur i sitt prov? Spelar totalkoncentrationen verkligen roll eller är det bara q-värdet som påverkar bicellernas storlek? För att få en tillförlitlig undersökning när biceller används som membranmodell måste vi alltså kunna avgöra vilka egenskaper, exempelvis storlek, bicellen bör ha för vilken studie. Våra resultat pekar på att i temperaturintervallet 20-25 C så sker ingen större förändring i bicellernas storlek som en följd av temperaturen. Inte heller totalkoncentrationen av lipider verkar innebära en drastisk ändring av bicellernas radie inom detta temperaturintervall. Lägre totalkoncentration verkar dock ge upphov till mindre biceller men vid högre temperatur bli resultatet svårtolkat. Kanske innebär den höga temperaturen att lipiderna struktureras på helt andra sätt än som biceller? Kanske innebär den höga temperaturen att de klumpas ihop och bildar större skikt? För koncentrationen 75mM så verkar sambandet mellan diffusionskonstant och temperatur vara linjärt upp till 37 C, vilket innebär att radien är relativt konstant. Mellan 37 C och 45 C händer något med radien, och vi kan inte längre vara säkra på att det är biceller i vårt prov. För koncentrationen 150 mm ser vi att något drastiskt händer redan mellan 25 C och 37 C och bicellernas radie ökar för att sedan minska något. Vid koncentrationen 300mM tycks radien konstant upp till 37 C, sedan sker en förändring och bicellernas radie ökar kraftigt. De slutsatser vi kan dra av denna undersökning innebär att det verkar som att det finns ett område där bicellernas storlek är relativt konstant oavsett temperatur och total lipidkoncentration. Små förändringar i temperatur eller koncentration bör alltså inte påverka resultatet i forskning där biceller används om en håller sig inom detta område. Vid högre temperaturer verkar bicellerna förstöras, vid högre koncentration bildas större formationer medan det vid lägre koncentrationer verkar som om bicellernas splittras till mindre beståndsdelar. 23

10. AVTACKANDE Under två veckor deltog jag i ett projekt som Johannes Björnerås och Weihua Ye vid avdelningen för biofysik och biokemi på Stockholms Universitet utformat där jag fick möjlighet att genomföra experimenten som beskrivs i rapporten. Jag vill tacka Johannes och Weihua för deras stora tålamod. Jag vill även tacka övriga gruppmedlemmar Philip Josephson, Ahmed Al, Oskar Lennborg, Nawel Gaouar, Alexander Bois, Ali Alhilo och Fabian Ekdahl Filipson. Jag vill även rikta ett tack till Stockholms Universitets Forskarskola och min fantastiska fysiklärare Rickard Fors. 24

11. REFERENSER 1. Kemiboken: Borén, Larsson m.fl. Liber, 2012 (Stockholm) 2. "The Nobel Prize in Physics 1952". Nobelprize.org. Nobel Media AB 2013. Web. 20 Sep 2013. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/physics/laureates/1952/ 3. Felix Bloch - Facts". Nobelprize.org. Nobel Media AB 2013. Web. 20 Sep 2013. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/physics/laureates/1952/bloch-facts.html 4. E. M. Purcell - Facts". Nobelprize.org. Nobel Media AB 2013. Web. 20 Sep 2013. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/physics/laureates/1952/purcell-facts.html 5. Alberts B, Johnson A, Lewis J m.fl, Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002.//http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26878/ 6. Overington JP, Al-Lazikani B, Hopkins AL (December 2006). "How many drug targets are there?". Nat Rev Drug Discov 5 (12) 7. ^ Krogh, A.; Larsson, B. R.; Von Heijne, G.; Sonnhammer, E. L. L. (2001). "Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: Application to complete genomes".journal of Molecular Biology 305 (3): 567 580. doi:10.1006/jmbi.2000.4315. PMID 11152613) 8. Weihua Ye, Biophysical studies of membrane associated biomolecular interactions. Licentiate thesis, February 2013, Stockholm University. 9. A. Diller, C. Loudet m.fl. Bicelles: A natural molecular goniometer for structural, dynamical and topological studies of molecules in membranes (2009) National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2899883/) 10 http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/nuclear/shell.html 11. http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/nuclear/nmr.html 12. Joseph P. Hornak, Ph.D. : RIT Magnetic Resonance Laboratory, Center for Imaging Science, Rochester Institute of Technology, Rochester, NY// http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/inside.htm 13. http://www.springerimages.com/images/lifesciences/1-10.1007_s11101-007-9086-9-2 14. http://www.cardiff.ac.uk/biosi/researchsites/emric/basics.html 15. http://catbert.cs.duke.edu/~brd/teaching/bio/asmb/papers/nmr/residual-dipolarcoupling/ja011967l_swisscheese.pdf 16. http://www.ne.se/diffusion/153560 25

17. Mäler, Lena, Solution NMR studies of peptide-lipid interactions in model membranes. 2012 Molecular Membrane Biology 29 (5). 18. http://chem.ch.huji.ac.il/nmr/whatisnmr/whatisnmr.html 19. http://www.uni-muenster.de/imperia/md/content/physikalische_chemie/nmr_pfg_diffusion.pdf BILDER 1. http://learn.genetics.utah.edu/content/begin/cells/membranes/ 2. http://www.nanoscalereslett.com/content/6/1/61/figure/f1?highres=y 3. http://webb.cm.utexas.edu/research/research1.html4. 4. http://en.wikipedia.org/wiki/file:spin_half_angular_momentum.svg 5. https://wiki.umn.edu/mxp/nuclearmagneticresonancespectroscopy 6. http://en.wikipedia.org/wiki/file:nmr_splitting.gif 7. http://en.wikipedia.org/wiki/file:menthol_proton_spectrum.jpg Övriga bilder och modeller har jag själv skapat. 26